Un metodo versatile di patterning proteine ​​e cellule

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di modellare cellule o substrati distribuendoli in microcanali complessi lunghi e chiusi utilizzando semplici strumenti da banco disponibili nella maggior parte dei laboratori biologici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia riguardanti le interazioni cellula-cellula e cellula-proteina. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è facile da eseguire e richiede solo strumenti prontamente disponibili nella maggior parte dei laboratori biologici.

In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché richiede l'ottimizzazione delle condizioni di incubazione per le cellule e i substrati scelti dal ricercatore. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché il corretto posizionamento del timbro PDMS e della soluzione migliora significativamente la riproducibilità dell'esperimento. Inizia disegnando il layout del microcanale utilizzando uno strumento di disegno CAD.

Quindi, stampa il disegno su carta bianca. Quindi, usa l'isopropanolo per pulire un vetrino abbastanza grande da ospitare il design. E poi asciugare il carrello con una pistola ad aria compressa.

Attaccare del nastro adesivo al vetrino pulito, facendo attenzione a non intrappolare bolle d'aria. Quindi, fissa con nastro adesivo i lati del vetrino sulla carta con il disegno, in modo che il lato del nastro sia rivolto verso l'alto. Usa un bisturi per tagliare il nastro sul vetrino, usando il disegno della carta come riferimento.

Una volta tagliato, staccare il nastro dalle aree indesiderate del vetrino. Quindi, sciacquare il vetrino con isopropanolo per rimuovere eventuali residui di adesivo. E poi usa una pistola ad aria compressa per asciugare la superficie.

Una volta modellato e pulito, cuocere il vetrino in forno a 65 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi, arrotolare delicatamente il nastro con un rullo di gomma, per rimuovere le bolle d'aria e lasciare raffreddare il vetrino a temperatura ambiente in una capsula di Petri. Iniziare mescolando 10 parti di un elastomero PDMS con 1 parte del suo agente indurente e mescolare energicamente la miscela.

Quindi, posizionare la miscela in una camera a vuoto per degassare la miscela fino a quando non rimangono bolle d'aria. Versare uno strato di 2 mm di composto sullo stampo del nastro adesivo e degassare lo stampo fino a quando tutte le bolle d'aria scompaiono. Una volta raffreddato, utilizzare un bisturi per tagliare lo strato PDMS ad almeno 5 mm di distanza dalle caratteristiche.

Quindi, staccare il PDMS polimerizzato dallo stampo usando un paio di pinzette. Praticare un singolo foro di ingresso con un punzone per biopsia da 1 mm, preferibilmente all'estremità di una rete di microcanali. Quindi, pulire il calco PDMS con nastro adesivo, per rimuovere le particelle di polvere dal dispositivo.

Sterilizzare il dispositivo a microcanali PDMS sciacquandolo con una soluzione di ehtanolo al 70%, seguita da acqua deionizzata sterile, ed esporlo alla luce UV per 30 minuti. Utilizzare una pinzetta per posizionare il PDMS sterile su un vetrino di vetro sterile e applicare una leggera pressione utilizzando la punta delle pinzette. Quindi, posizionare una goccia di poli-d lisina in tampone tetraborato di sodio all'ingresso dei microcanali.

Mettere la capsula di Petri sotto vuoto per 10 minuti. Durante questo periodo, osservare l'aria che esce dal canale sotto forma di bolle. Rilasciare il vuoto e osservare la soluzione del substrato che scorre nel microcanale: incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora.

Quindi, staccare con cura il timbro PDMS utilizzando una pinzetta sterile e lavare il modello tre volte con acqua deionizzata. Aggiungere una soluzione all'1% di BSA al vetrino coprioggetto, per ridurre l'adesione aspecifica, e incubare il campione per una notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, aspirare la soluzione BSA.

Per avviare il patterning indiretto delle cellule, preparare una sospensione cellulare in terreno di coltura libero da siero come descritto nel protocollo di testo allegato. Aggiungere la sospensione cellulare alla capsula di Petri modellata, immergendo completamente la regione modellata nella sospensione cellulare. Quindi, incubare la capsula di Petri a 37 gradi Celsius in un'incubatrice per 15 minuti per consentire alle cellule di attaccarsi al substrato modellato.

Dopo l'incubazione, aspirare la sospensione cellulare in eccesso dalla capsula di Petri e lavare le cellule modellate tre volte con PBS, agitando delicatamente per dieci secondi per rimuovere le cellule non attaccate. Quindi, aggiungere il terreno di coltura appropriato alle colture cellulari modellate e incubare le cellule modellate a 37 gradi Celsius in un incubatore tamponato con anidride carbonica. Per la modellazione diretta delle cellule, in primo luogo, sterilizzare il dispositivo microfluidico sciacquandolo con una soluzione di etanolo al 70% seguita da acqua deionizzata.

Quindi, immergere il dispositivo per una notte in una soluzione di BSA all'1% per evitare l'adesione cellulare non specifica al PDMS. Asciugare il dispositivo a temperatura ambiente, quindi fissarlo al fondo della capsula di Petri trattata con coltura tissutale. Posizionare da 4 a 8 microlitri di sospensione cellulare, sufficienti per riempire i microcanali, sull'ingresso, coprendo completamente il foro.

Quindi, mettere la capsula di Petri in una camera a vuoto per 10 minuti. Rilasciare il vuoto e osservare la sospensione cellulare che scorre nel microcanale. Incubare la capsula di Petri a 37 gradi Celsius in un incubatore tamponato con anidride carbonica, per un massimo di un'ora.

Quindi, rimuovi il piatto dall'incubatrice e usa un paio di pinzette per staccare con cura il PDMS dal piatto. Lavare il modello con PBS, quindi aggiungere i terreni di coltura cellulare alla capsula di Petri. Al termine, riposizionare le cellule nell'incubatore.

Qui sono mostrati neuroni corticali embrionali di ratto modellati su superfici di poli-d lisina e laminina. La posizione delle cellule dimostra un'aderenza generale alle aree modellate e la crescita lungo le strisce PDL e laminina. Qui sono mostrati, ad un ingrandimento maggiore, i mioblasti C2C12.

Questo tipo di cellula aderisce anche alle aree modellate e dimostra la fusione in miotubi multinucleati. Questa tecnica è stata adattata anche per il patterning cellulare diretto, mostrato qui con i fibroblasti. Questo metodo di patterning cellulare diretto non ha effetti negativi sulla sopravvivenza cellulare.

Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la microscopia fluorescente per rispondere a ulteriori domande che coinvolgono la localizzazione delle proteine o le interazioni cellula-substrato. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che il corretto posizionamento della gocciolina di cellule o della soluzione di substrato per coprire l'intero intarsio è fondamentale per il successo. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare la guida degli assoni dei fotorecettori nella biologia retinica.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come modellare le celle e il substrato con dispositivi microfluidici PDMS gassodosi utilizzando la pressione negativa. Grazie per l'attenzione e buona fortuna con il tuo esperimento.