Un metodo versatile di patterning proteine e cellule
February 26th, 2017
Questo rapporto descrive una tecnica semplice e facile da eseguire, utilizzando il vuoto a bassa pressione, per riempire canali microfluidici con cellule e substrati per la ricerca biologica.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di modellare cellule o substrati distribuendoli in microcanali complessi lunghi e chiusi utilizzando semplici strumenti da banco disponibili nella maggior parte dei laboratori biologici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia riguardanti le interazioni cellula-cellula e cellula-proteina. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è facile da eseguire e richiede solo strumenti prontamente disponibili nella maggior parte dei laboratori biologici.
In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché richiede l'ottimizzazione delle condizioni di incubazione per le cellule e i substrati scelti dal ricercatore. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché il corretto posizionamento del timbro PDMS e della soluzione migliora significativamente la riproducibilità dell'esperimento. Inizia disegnando il layout del microcanale utilizzando uno strumento di disegno CAD.
Quindi, stampa il disegno su carta bianca. Quindi, usa l'isopropanolo per pulire un vetrino abbastanza grande da ospitare il design. E poi asciugare il carrello con una pistola ad aria compressa.
Attaccare del nastro adesivo al vetrino pulito, facendo attenzione a non intrappolare bolle d'aria. Quindi, fissa con nastro adesivo i lati del vetrino sulla carta con il disegno, in modo che il lato del nastro sia rivolto verso l'alto. Usa un bisturi per tagliare il nastro sul vetrino, usando il disegno della carta come riferimento.
Una volta tagliato, staccare il nastro dalle aree indesiderate del vetrino. Quindi, sciacquare il vetrino con isopropanolo per rimuovere eventuali residui di adesivo. E poi usa una pistola ad aria compressa per asciugare la superficie.
Una volta modellato e pulito, cuocere il vetrino in forno a 65 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi, arrotolare delicatamente il nastro con un rullo di gomma, per rimuovere le bolle d'aria e lasciare raffreddare il vetrino a temperatura ambiente in una capsula di Petri. Iniziare mescolando 10 parti di un elastomero PDMS con 1 parte del suo agente indurente e mescolare energicamente la miscela.
Quindi, posizionare la miscela in una camera a vuoto per degassare la miscela fino a quando non rimangono bolle d'aria. Versare uno strato di 2 mm di composto sullo stampo del nastro adesivo e degassare lo stampo fino a quando tutte le bolle d'aria scompaiono. Una volta raffreddato, utilizzare un bisturi per tagliare lo strato PDMS ad almeno 5 mm di distanza dalle caratteristiche.
Quindi, staccare il PDMS polimerizzato dallo stampo usando un paio di pinzette. Praticare un singolo foro di ingresso con un punzone per biopsia da 1 mm, preferibilmente all'estremità di una rete di microcanali. Quindi, pulire il calco PDMS con nastro adesivo, per rimuovere le particelle di polvere dal dispositivo.
Sterilizzare il dispositivo a microcanali PDMS sciacquandolo con una soluzione di ehtanolo al 70%, seguita da acqua deionizzata sterile, ed esporlo alla luce UV per 30 minuti. Utilizzare una pinzetta per posizionare il PDMS sterile su un vetrino di vetro sterile e applicare una leggera pressione utilizzando la punta delle pinzette. Quindi, posizionare una goccia di poli-d lisina in tampone tetraborato di sodio all'ingresso dei microcanali.
Mettere la capsula di Petri sotto vuoto per 10 minuti. Durante questo periodo, osservare l'aria che esce dal canale sotto forma di bolle. Rilasciare il vuoto e osservare la soluzione del substrato che scorre nel microcanale: incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora.
Quindi, staccare con cura il timbro PDMS utilizzando una pinzetta sterile e lavare il modello tre volte con acqua deionizzata. Aggiungere una soluzione all'1% di BSA al vetrino coprioggetto, per ridurre l'adesione aspecifica, e incubare il campione per una notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, aspirare la soluzione BSA.
Per avviare il patterning indiretto delle cellule, preparare una sospensione cellulare in terreno di coltura libero da siero come descritto nel protocollo di testo allegato. Aggiungere la sospensione cellulare alla capsula di Petri modellata, immergendo completamente la regione modellata nella sospensione cellulare. Quindi, incubare la capsula di Petri a 37 gradi Celsius in un'incubatrice per 15 minuti per consentire alle cellule di attaccarsi al substrato modellato.
Dopo l'incubazione, aspirare la sospensione cellulare in eccesso dalla capsula di Petri e lavare le cellule modellate tre volte con PBS, agitando delicatamente per dieci secondi per rimuovere le cellule non attaccate. Quindi, aggiungere il terreno di coltura appropriato alle colture cellulari modellate e incubare le cellule modellate a 37 gradi Celsius in un incubatore tamponato con anidride carbonica. Per la modellazione diretta delle cellule, in primo luogo, sterilizzare il dispositivo microfluidico sciacquandolo con una soluzione di etanolo al 70% seguita da acqua deionizzata.
Quindi, immergere il dispositivo per una notte in una soluzione di BSA all'1% per evitare l'adesione cellulare non specifica al PDMS. Asciugare il dispositivo a temperatura ambiente, quindi fissarlo al fondo della capsula di Petri trattata con coltura tissutale. Posizionare da 4 a 8 microlitri di sospensione cellulare, sufficienti per riempire i microcanali, sull'ingresso, coprendo completamente il foro.
Quindi, mettere la capsula di Petri in una camera a vuoto per 10 minuti. Rilasciare il vuoto e osservare la sospensione cellulare che scorre nel microcanale. Incubare la capsula di Petri a 37 gradi Celsius in un incubatore tamponato con anidride carbonica, per un massimo di un'ora.
Quindi, rimuovi il piatto dall'incubatrice e usa un paio di pinzette per staccare con cura il PDMS dal piatto. Lavare il modello con PBS, quindi aggiungere i terreni di coltura cellulare alla capsula di Petri. Al termine, riposizionare le cellule nell'incubatore.
Qui sono mostrati neuroni corticali embrionali di ratto modellati su superfici di poli-d lisina e laminina. La posizione delle cellule dimostra un'aderenza generale alle aree modellate e la crescita lungo le strisce PDL e laminina. Qui sono mostrati, ad un ingrandimento maggiore, i mioblasti C2C12.
Questo tipo di cellula aderisce anche alle aree modellate e dimostra la fusione in miotubi multinucleati. Questa tecnica è stata adattata anche per il patterning cellulare diretto, mostrato qui con i fibroblasti. Questo metodo di patterning cellulare diretto non ha effetti negativi sulla sopravvivenza cellulare.
Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la microscopia fluorescente per rispondere a ulteriori domande che coinvolgono la localizzazione delle proteine o le interazioni cellula-substrato. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che il corretto posizionamento della gocciolina di cellule o della soluzione di substrato per coprire l'intero intarsio è fondamentale per il successo. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare la guida degli assoni dei fotorecettori nella biologia retinica.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come modellare le celle e il substrato con dispositivi microfluidici PDMS gassodosi utilizzando la pressione negativa. Grazie per l'attenzione e buona fortuna con il tuo esperimento.
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Panoramica
Questo rapporto descrive una tecnica semplice e facile da eseguire, utilizzando un vuoto a bassa pressione, per riempire i canali microfluidici con cellule e substrati per la ricerca biologica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia riguardanti le interazioni cellula-cellula e cellula-proteina.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Ricerca biologica
- Microfluidica
- Interazioni cellulari
Contesto
- La tecnica utilizza un vuoto a bassa pressione per riempire i microcanali.
- È progettata per l'uso con strumenti di laboratorio facilmente disponibili.
- L'ottimizzazione delle condizioni di incubazione è necessaria per un'applicazione di successo.
- La dimostrazione visiva migliora la riproducibilità del metodo.
Obiettivo dello studio
- Configurare cellule o substrati nei microcanali.
- Facilitare la ricerca sulle interazioni cellulari.
- Fornire un metodo semplice per i ricercatori.
Metodi utilizzati
- Utilizzo di un vuoto a bassa pressione per riempire i canali microfluidici.
- Progettazione di layout di microcanali utilizzando strumenti CAD.
- Posizionamento di timbri PDMS per risultati migliori.
- Ottimizzazione delle condizioni per cellule e substrati specifici.
Risultati principali
- Riempimento con successo dei microcanali con cellule e substrati.
- Migliore riproducibilità attraverso la tecnica corretta.
- Efficacia dimostrata nello studio delle interazioni biologiche.
- Metodo accessibile per i ricercatori nei laboratori biologici.
Conclusioni
- La tecnica è facile da eseguire ed efficace per la ricerca biologica.
- Consente modelli complessi di cellule e substrati.
- Gli aiuti visivi sono cruciali per un'implementazione di successo.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This method enables precise spatial control of proteins and cells in complex microfluidic geometries using accessible laboratory tools, supporting mechanistic studies of cell-substrate and cell-cell interactions. By eliminating the need for specialized equipment or exotic materials, it lowers technical barriers for target validation and assay development in early discovery. The approach enhances predictive confidence in phenotypic screening by enabling reproducible, disease-relevant microenvironments for mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through controlled presentation of substrates like fibronectin, collagen, and laminin to assess cell adhesion and signaling.
- Operational Value: Supports functional target validation by patterning multiple cell types including neuronal lines and fibroblasts to evaluate pathway-specific responses.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking by allowing direct comparison of cell behavior on defined protein patterns, improving target confidence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized protein-patterned substrates for quantitative assessment of compound effects on cell attachment, spreading, or differentiation.
- Operational Value: Enables assay reproducibility through vacuum-driven filling of long, closed PDMS microchannels, reducing variability in substrate coating.
- Scalability: Supports platform reuse across different cell and substrate types with minimal retooling, enhancing screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Patterns primary and stem cell-derived neurons (e.g., embryonic rat cortical, amphibian retinal) to model disease-relevant neural networks for preclinical target evaluation.
- Mechanistic De-risking: Enables study of neurite outgrowth and axon guidance on patterned laminin or PDL, supporting predictive modeling of neurotherapeutic efficacy.
- Risk-Adjusted Advancement: Allows indirect patterning of diverse cell types via substrate pre-coating, facilitating cross-model consistency in target engagement studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, enabling mechanistic interrogation before compound screening.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by patterning substrates to isolate integrin-mediated signaling or neuronal guidance cues in controlled microenvironments.
- Screening: Delivers quantitative, spatially resolved readouts of cell-substrate interactions when combined with fluorescence microscopy, enabling condition comparison.
- Analytics: Generates imaging-compatible patterns that support morphometric analysis of cell alignment, fusion (e.g., myotube formation), or neurite length as phenotypic endpoints.
- Translational Research: Connects to preclinical work by patterning disease-relevant neurons to assess substrate-dependent survival or maturation, only when supported by source.
- Enterprise Reuse: Functions as a adaptable patterning module for multiple projects, reducing dependency on specialized microfabrication core facilities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in cell-substrate interactions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through vacuum-assisted filling, minimizing user-dependent variability in protein deposition.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of compound effects on adhesion or morphology in physiologically relevant contexts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing mechanistic data on target engagement before significant investment in lead optimization.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic design, PDMS handling, and sterile technique for cell culture applications.
- Depends on access to vacuum chambers, CAD tools, and standard cell culture incubators for optimization and execution.
- Necessitates cross-team standardization of incubation times, vacuum duration, and substrate concentrations to ensure reproducibility across users.
- Involves adaptation considerations when extending to new cell types or matrix proteins, as noted in the need for condition optimization.
- Includes practical limitations such as the requirement for precise droplet placement to fully fill microchannel networks, which impacts success rate.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:00
Fabrication of Master Molds for Soft Lithography Using Adhesive Tape
2:32
Soft Lithography Fabrication of PDMS Devices
4:02
Substrate Patterning
5:22
Indirect Patterning of Cells
6:29
Direct Patterning of Cells
8:05
Results: Direct and Indirect Patterning of Cells
8:56
Conclusion
