Rilevamento di Ligand-activated proteina G-recettore accoppiato internalizzazione da microscopia confocale

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di fornire un metodo efficiente e facilmente interpretabile per rilevare la localizzazione subcellulare e l'internalizzazione delle proteine di fusione GPCR espresse in cellule di mammifero. Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nel campo della localizzazione delle proteine subcellulari, come l'internalizzazione e il riciclaggio dei recettori. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata in modo semplice ed efficiente.

Quindi questo metodo può fornire informazioni sul monitoraggio e la localizzazione dei GPCR. E può essere applicato anche ad altri sistemi, come le proteine citoplasmatiche e nucleari. Dopo aver recuperato e fatto passare le cellule HEK293 secondo il protocollo di testo, quando le cellule sono cresciute quasi alla confluenza, scartare il terreno di crescita equilibrato, aggiungere due millilitri di PBS e agitare il piatto per lavare le cellule.

Scartare il PBS e aggiungere un millilitro di tripsina EDTA. Per digerire completamente le cellule, agitare con cura il piatto e aspirare la soluzione. Quindi, metti il piatto in questo incubatore a C02 con camicia d'acqua a 37 gradi Celsius per tre minuti.

Mentre le cellule sono in incubazione, preparare una piastra a sei pozzetti aggiungendo due millilitri di terreno di crescita bilanciato a ciascun pozzetto. Quindi, quando le cellule si sono sollevate dal fondo del piatto, aggiungere un millilitro di terreno di crescita equilibrato al piatto. Miscelare mediante pipettaggio e trasferire immediatamente 0,1 millilitri di sospensione cellulare in ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti preparata.

Pipettare delicatamente la sospensione nei pozzetti e incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di CO2. Il giorno seguente, assicurarsi che le celle siano confluenti all'85-95%. Quindi, a due provette sterili per microcentrifuga, aggiungere tre microgrammi di DNA plasmidico e 100 microlitri di terreno di siero ridotto in una provetta.

Nel frattempo, aggiungere nove microlitri di reagente uno e 100 microlitri di terreno sierico ridotto a un'altra provetta. Incubare le provette a temperatura ambiente per cinque minuti. Combinare la miscela plasmidica diluita con quella del reagente diluito.

Quindi, mescolare delicatamente la soluzione e incubarla a temperatura ambiente per 20 minuti. Aspirare il terreno delle cellule e aggiungere 1,5 millilitri di DMEM fresco senza FBS. Quindi, aggiungere goccia a goccia 215 microlitri di miscela di reagenti per la trasfezione del DNA a ciascun pozzetto e mescolare delicatamente facendo roteare la piastra.

Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e al 5% di CO2 per quattro-otto ore. Quindi, sostituisci il terreno con DMEM fresco con il 10% di FBS. Incubare le cellule per altre 24-48 ore prima di eseguire qualsiasi esperimento.

L'efficienza di trasfezione può variare notevolmente nelle diverse linee cellulari. Pertanto, l'ottimizzazione della deposizione può essere necessaria a seconda del particolare tipo di cella utilizzata. Rimuovere il terreno di coltura dalla piastra di coltura a sei pozzetti.

Quindi, utilizzare un millilitro di PBS per lavare il monostrato cellulare. Aggiungere 0,5 millilitri di tripsina EDTA, agitare il piatto e aspirare la soluzione. Quindi, incubare la piastra di coltura a 37 gradi Celsius per tre minuti.

Durante l'incubazione, inserire vetrini coprioggetti sterili di 15 millimetri di diametro in ciascun pozzetto di una piastra da 12 pozzetti. Risospendere le cellule in un piccolo volume di terreno di coltura fresco completo e trasferire il numero richiesto di cellule nella piastra a 12 pozzetti con vetrini. Quindi, incubare le cellule per 16-24 ore.

Dopo 16-24 ore di incubazione, quando le cellule sono cresciute quasi alla confluenza, aggiungere cinque micromolari dell'aneto della sonda a membrana in ciascun pozzetto e rimettere le cellule nell'incubatore per 30 minuti. Rimuovere il terreno di coltura equilibrato e utilizzare il PBS freddo per lavare le cellule due volte. Quindi, aggiungi un millilitro di PFA al 4% in ciascun pozzetto e agita le cellule per 15 minuti per fissare le cellule.

Con PBS, lavare due volte le celle fisse, quindi aggiungere da 200 a 300 microlitri di DAPI in ciascun pozzetto e incubare la piastra per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver lavato due volte le celle con PBS, rimuovere con cura i vetrini coprioggetti dalla piastra e rimuovere il tampone in eccesso. Capovolgere i vetrini coprioggetti sui vetrini del microscopio caricati con una goccia di mezzo di montaggio.

Quindi, rimuovere il mezzo di montaggio in eccesso dalle diapositive. Utilizzando cellule che sono cresciute quasi alla confluenza, rimuovere il terreno di coltura equilibrato e aggiungere DMEM fresco e riscaldato. Incubare le cellule per un'ora.

Trattare le cellule con diverse concentrazioni di ligando per 30 minuti. E trattare le cellule con 10 ligando a sei molari negativi per i diversi tempi mostrati qui. Utilizzare il PBS freddo per lavare le cellule due volte, quindi aggiungere un millilitro di PFA al 4% in PBS a ciascun pozzetto, prima di agitare delicatamente le cellule per 15 minuti.

Dopo aver lavato le celle due volte in PBS, rimuovere con cura i vetrini coprioggetti dai pozzetti della piastra e montarli come appena dimostrato in precedenza in questo video. Per eseguire la microscopia confocale, accendere l'hardware del microscopio confocale, inclusa l'alimentazione della lampada al mercurio, il microscopio PC, lo scanner e il laser. Avvia il software, quindi controlla la configurazione e seleziona il laser.

Accendere le diverse unità del sistema di microscopia confocale secondo le istruzioni. Posizionare un vetrino preparato sul tavolino del microscopio e utilizzare il controller del tavolino per posizionare il campione sopra la lente dell'obiettivo. Per una lente a immersione in olio, aggiungere una goccia di olio di cedro sul vetrino coprioggetti e orientare il vetrino con un vetrino coprioggetti rivolto verso la lente.

Sotto fluorescenza, trova le cellule di interesse, quindi passa alla modalità di scansione e scegli la potenza del laser e la gamma spettrale del fluoroforo di emissione. Cattura immagini di alta qualità regolando l'intensità del laser e altri parametri. Questa figura illustra l'espressione di pEGFP-N1 nelle cellule HEK293.

Il segnale GFP è stato rilevato nel citoplasma e nel nucleo. La localizzazione subcellulare nelle cellule HEK293 dei recettori dell'ormone di rilascio delle gonadotropine da S-Japonica, o SjGnRHR, è mostrata qui. I recettori EGFP sono in verde e la colorazione Dil, che evidenzia la membrana cellulare, è in rosso.

I recettori si localizzano sulla membrana plasmatica. Per visualizzare l'internalizzazione dei SjGnRHR, le cellule sono state trattate con l'ormone di rilascio delle gonadotropine a diverse concentrazioni. Come si vede qui, l'internalizzazione dei recettori procedeva in modo dose-dipendente, e il recettore veniva completamente internalizzato dalla superficie della cellula con il ligando molare da 10 a meno sei.

Quando trattati con un ligando molare da 10 a meno sei molari per diversi periodi di tempo, i SjGnRHR internalizzati erano rilevabili 10 minuti dopo la simulazione dell'agonista e l'internalizzazione estrema si è verificata entro 60 minuti. Come dimostrato nelle cellule HEK293, in entrambi gli esperimenti, la proteina di fusione fluorescente SjGnRHR EGFP si è localizzata principalmente sulla membrana plasmatica ed è stata drammaticamente e rapidamente internalizzata nelle cellule. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere le cellule nelle giuste condizioni senza contaminazione da batteri, funghi e micoplasmi.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire metodi come il controllo cellulare e l'immobilizzazione per rispondere a ulteriori domande come il secondo in pass V dei recettori proteici. Dopo ogni sviluppo, la tecnologia ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia cellulare e della biochimica per esplorare la localizzazione e l'internalizzazione dei recettori transmembrana in varie linee cellulari.