Un metodo semplice per identificare le cinasi che regolano la pluripotenza delle cellule staminali embrionali mediante screening di inibitori ad alta percentuale
May 12th, 2017
Qui presentiamo un protocollo quantitativo e scalabile per eseguire schermate di piccole molecole mirate per i regolatori di chinasi della transizione pluripotente con primato naïve.
L'obiettivo generale di questo screening è identificare inibitori della proteina chinasi a piccole molecole che modulano la pluripotenza delle cellule staminali embrionali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della segnalazione delle cellule staminali embrionali identificando nuove vie di segnalazione delle protein chinasi che regolano la pluripotenza delle cellule staminali embrionali. Quindi il vantaggio principale di questa tecnica è che lo schermo è relativamente facile da eseguire utilizzando attrezzature di laboratorio standard e reagenti prontamente disponibili.
Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando ci siamo resi conto che la maggior parte della ricerca sulle vie di segnalazione della pluripotenza aveva completamente ignorato vaste onde del kinome. Preparare piatti da 10 centimetri ricoperti di gelatina aggiungendo cinque millilitri di gelatina allo 0,1% in piatti da 10 centimetri. Dopo aver incubato a temperatura ambiente per cinque minuti, aspirare la gelatina e lasciare asciugare la piastra per due minuti.
Quindi, placcare qualsiasi linea cellulare ES standard di topo sui piatti rivestiti in terreni cellulari ES di topo standard contenenti 100 nanogrammi per millilitro di MIF marcato GST, il 10% di siero fetale di vitello e il 5% di sostituzione del siero knockout. Coltivate le cellule a 37 gradi Celsius 5% di CO2 e sostituite il terreno ogni giorno. Far passare le cellule ES di topo a circa l'80% di confluenza ogni due giorni aspirando il terreno e lavando con cinque millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato per piastra.
Quindi, aggiungere un millilitro di tripsina EDTA per piastra di cellule ES di topo e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo l'incubazione, risospendere le cellule tripsinizzate in quattro millilitri di terreno e centrifugare le cellule a 1200 giri/min per cinque minuti. Risospendere accuratamente il pellet di cella risultante in cinque millilitri di terreno, pipettando su e giù per generare una singola sospensione cellulare.
Contare le cellule combinando una sospensione cellulare da 10 microlitri e 10 microlitri di blu di tripano. Mettere la miscela in una camera di conteggio delle cellule o utilizzare un emocitometro e un microscopio ottico. Successivamente, seminare 3000 cellule ES di topo in piastre a 96 pozzetti rivestite di gelatina allo 0,1% in un volume finale di 100 microlitri di terreno utilizzando una pipetta multicanale.
Quindi, applicare gli inibitori della chinasi a una diluizione da uno a 100 utilizzando una pipetta multicanale. Pipettare delicatamente il terreno per miscelare l'inibitore e la sospensione cellulare. Quindi, lasciare riposare le cellule in una cappa di coltura tissutale per un'ora per garantire una distribuzione uniforme sulla superficie della piastra.
Coltivare le cellule per 48 ore senza cambiare il terreno. Per iniziare l'analisi di screening, lavare piastre cellulari ES di topo a 96 pozzetti in 200 microlitri di PBS utilizzando un aspiratore multicanale e pipette. Dopo il lavaggio, mescolare gli estratti cellulari in 150 microlitri di tampone di lisi.
Chiarificare gli estratti mediante centrifugazione a 1500 volte G per 30 minuti in piastre a 96 pozzetti con fondo a V. Quindi, immobilizzare 100 microlitri di surnatanti su una membrana di nitrocellulosa utilizzando un collettore a punti a vuoto a 96 pozzetti. Asciugare la membrana e colorare con 40 millilitri di Ponceau S per garantire un trasferimento costante.
Dopo aver lavato la membrana con TBST, bloccarla in TBST più il 3% di latte. Quindi, incubare la membrana negli anticorpi Nanog e Dnmt3b a una diluizione da uno a 1000 nel tampone bloccante durante la notte. Il giorno successivo, lavare la membrana tre volte per 10 minuti in TBST.
Quindi, incubarlo in 30 millilitri di anticorpi secondari a una diluizione da uno a 10.000 in tampone bloccante. Sviluppare la membrana utilizzando un sistema di imaging digitale di immunoblotting. Prima di procedere, è fondamentale convalidare gli inibitori delle chinasi identificati nello screening utilizzando l'immunoblotting convenzionale.
Ciò consente di rimuovere i falsi positivi prima di ulteriori analisi a valle. Analizzare i dati dello schermo e convalidare gli inibitori come regolatori di pluripotenza in buona fede, come descritto nel protocollo di testo. Qui è mostrato un grafico a punti Nanog rappresentativo dalla schermata eseguita.
Vengono evidenziati gli inibitori del controllo positivo che guidano la pluripotenza innescata o naïve. Viene mostrato anche un grafico a punti Dnmt3b rappresentativo dalla schermata eseguita. Gli inibitori del controllo positivo che guidano la pluripotenza innescata o naïve sono nuovamente evidenziati.
In questo grafico, gli inibitori sono stati classificati per il rapporto Nanog/Dnmt3b. Viene impostata una soglia di doppio rapporto tra Nanog e Dnmt3b per identificare gli inibitori che stabilizzano la pluripotenza naïve o innescata. Vengono forniti anche segnali Nanog e Dnmt3b sommati.
Inoltre, vengono annotati gli inibitori delle chinasi selezionati per un'ulteriore convalida. Qui è mostrata una convalida immunoblot convenzionale di inibitori della chinasi selezionati, immunoblot Nanog e Dnmt3b, nonché il rapporto Nanog/Dnmt3b e il segnale totale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come identificare gli inibitori delle chinasi di piccole molecole che modulano la pluripotenza delle cellule staminali embrionali.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 72 ore se eseguita correttamente. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle vie di segnalazione delle chinasi che controllano la pluripotenza, può anche essere applicato alla differenziazione delle cellule staminali embrionali e ad altri sistemi regolatori come i modificatori epigenetici. A seguito della procedura, altre librerie di inibitori di piccole molecole, come quelle che hanno come bersaglio i modificatori epigenetici, possono essere utilizzate per identificare nuovi attori nella regolazione della pluripotenza.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada al nostro gruppo di ricerca per chiarire nuove vie di segnalazione della pluripotenza. Usiamo questa tecnica per identificare un nuovo ruolo per la via amplificata nella regolazione della pluripotenza.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo quantitativo e scalabile per screening mirati di piccole molecole volte all'identificazione di regolatori delle chinasi della transizione pluripotente da ingenua a potenziata. Il metodo è progettato per migliorare la comprensione dei percorsi di segnalazione delle cellule staminali embrionali.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Biologia cellulare
- Ricerca sulle cellule staminali
- Trasduzione del segnale
Contesto
- La pluripotenza delle cellule staminali embrionali è regolata da vari percorsi di segnalazione.
- Le ricerche precedenti hanno trascurato molti componenti del kinoma.
- L'identificazione di nuovi inibitori delle chinasi può fornire informazioni sulla regolazione della pluripotenza.
- Questo studio mira a colmare le lacune nella conoscenza attuale riguardante la segnalazione delle chinasi nelle cellule staminali.
Obiettivo dello studio
- Identificare inibitori delle chinasi proteiche a piccole molecole che modulano la pluripotenza delle cellule staminali embrionali.
- Chiarire nuovi percorsi di segnalazione delle chinasi coinvolti nella pluripotenza.
- Sviluppare un metodo di schermatura semplice utilizzando attrezzature di laboratorio standard.
Metodi utilizzati
- Preparazione di piastre rivestite di gelatina per la coltura cellulare.
- Seminazione di cellule staminali embrionali di topo e applicazione di inibitori delle chinasi.
- Analisi di screening attraverso tecniche di immunoblotting.
- Validazione degli inibitori delle chinasi identificati utilizzando metodi convenzionali.
Risultati principali
- Identificazione con successo di inibitori delle chinasi che stabilizzano la pluripotenza ingenua o potenziata.
- L'analisi dei dati ha rivelato una soglia di rapporto Nanog a Dnmt3b di due volte per la selezione degli inibitori.
- La validazione degli inibitori selezionati ha confermato il loro ruolo nella regolazione della pluripotenza.
- Le intuizioni acquisite possono essere applicate ad altri sistemi regolatori e processi di differenziazione.
Conclusioni
- Il protocollo sviluppato consente uno screening efficiente degli inibitori delle chinasi.
- Questo metodo può essere adattato per lo studio della differenziazione delle cellule staminali embrionali.
- Le future applicazioni potrebbero includere l'esplorazione di modificatori epigenetici nella regolazione della pluripotenza.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D teams to systematically interrogate kinase signaling networks that govern pluripotency transitions, a critical inflection point in stem cell-based therapeutic development. By providing a scalable, reagent-efficient platform for target de-risking, it supports early-stage hypothesis testing and mechanistic insight into cell fate regulation. The approach enhances predictive confidence in target selection by linking kinase modulation to defined pluripotency biomarkers, informing portfolio prioritization in regenerative medicine and disease modeling pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of kinase-dependent mechanisms underlying naïve-primed pluripotency transitions.
- Operational Value: Uses standard cell culture and immunoblotting infrastructure, minimizing specialized equipment needs.
- Predictive Value: Identifies kinase inhibitors that modulate pluripotency biomarkers (Nanog/Dnmt3b) to support target hypothesis validation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative immunoblot readouts (Nanog, Dnmt3b, ratio) for hit identification in kinase-focused screens.
- Operational Value: Compatible with 96-well formats and multichannel pipetting for medium-throughput compound evaluation.
- Assay Readiness: Produces normalized, reproducible signals enabling cross-plate comparison and threshold-based hit selection (e.g., two-fold Nanog/Dnmt3b ratio).
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links kinase activity to pluripotency states relevant for disease modeling and regenerative applications.
- Mechanistic De-risking: Clarifies signaling pathways upstream of core pluripotency factors, reducing ambiguity in target mechanism.
- Preclinical Relevance: Supports validation of kinase targets in stem cell-derived models prior to differentiation or tissue-specific assays.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, connecting target hypothesis testing to assay development and preclinical validation through measurable biomarker outputs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven screening of kinase libraries to clarify signaling nodes in pluripotency regulation.
- Screening: Enables standardized, reproducible compound screening in ESC models using accessible reagents and detection methods.
- Analytics: Delivers quantitative, normalized immunoblot data (signal intensity, ratios) to prioritize hits based on pluripotency effects.
- Translational Research: Connects kinase modulation to stem cell state transitions, informing downstream differentiation and disease model relevance.
- Enterprise Reuse: Platform can be adapted for other small molecule libraries (e.g., epigenetic modifiers) and stem cell contexts beyond pluripotency screening.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in kinase-target pluripotency relationships through biomarker-linked phenotypic readouts.
- Operational Value: Leverages standard lab equipment (incubator, centrifuge, immunoblot system) for broad accessibility across discovery teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early functional validation of kinase targets in a physiologically relevant system.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target prioritization by identifying kinases that modulate defined pluripotency states.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic stem cell culture and maintenance under defined conditions.
- Dependent on access to immunoblotting infrastructure and validated antibodies (e.g., Nanog, Dnmt3b).
- Necessitates standardization of cell seeding density, inhibitor dosing, and incubation times for assay reproducibility.
- Adaptation to other model systems may require optimization of coating, media, and passaging protocols.
- False positive rates require orthogonal validation (e.g., conventional immunoblot) to confirm target engagement and specificity.
