In Vitro Imaging e quantificazione della Drug Targeting efficienza di fluorescente GnRH analoghi

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare e prevedere l'efficacia dei sistemi di somministrazione di farmaci basati su GnRH in colture di cellule tumorali umane. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della terapia antitumorale mirata, come l'efficienza con cui le cellule di diversi tipi di cancro umano assumono farmaci antitumorali mirati al GnRH. Il vantaggio principale di questo metodo è che utilizza nuovi analoghi del GnRH marcati in fluorescenza che consentono l'uso simultaneo della microscopia confocale e dell'analisi della citometria a flusso.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia antitumorale perché i recettori del GnRH sono altamente espressi su diversi tipi di cellule tumorali, consentendo il targeting selettivo di essi. A dimostrare la procedura sarà Bianka Gurbi, una dottoranda del mio laboratorio. Per iniziare, rimuovere il terreno coltivato da ciascuno dei sette pozzetti di un vetrino microscopico seminato.

Quindi, aggiungere 250 microlitri del terreno completo preriscaldato al pozzetto di controllo negativo e 250 microlitri del terreno di trattamento delle sementi GnRH fit preriscaldato a ciascuno dei sei pozzetti rimanenti. Incubare il vetrino in un incubatore a 37 gradi Celsius, al cinque percento di anidride carbonica per cinque ore. Dopo cinque ore di incubazione, aspirare il terreno da ogni pozzetto e lavare le cellule con 250 microlitri di PBS.

Successivamente, aggiungere 250 microlitri di soluzione di fissaggio in ciascun pozzetto e incubare il vetrino a temperatura ambiente per 10 minuti. Una volta fissate le cellule, scartare la soluzione di fissaggio e lavare le celle con 250 microlitri di PBS. Aggiungere 250 microlitri di soluzione di sonda fluorescente a cinque micromolari preparata in PBS in ciascun pozzetto e incubare il vetrino a temperatura ambiente per 10 minuti.

Dopo aver rimosso la soluzione della sonda fluorescente, lavare accuratamente le cellule due volte con 250 microlitri di PBS. Infine, aggiungi tre o quattro gocce di terreno di montaggio in ogni pozzetto. Tenere il vetrino al buio a temperatura ambiente fino a quando non viene ripreso al microscopio.

Rimuovere il terreno coltivato da ciascuno dei cinque pozzetti di un vetrino microscopico seminato. Quindi, aggiungere 250 microlitri del terreno completo preriscaldato al pozzetto di controllo negativo e al secondo pozzetto con le cellule non trattate. Pretrattare le cellule nei tre pozzetti rimanenti con il mezzo di trattamento preriscaldato contenente 10 micromolari di GnRH FITC.

Incubare il vetrino in un incubatore a 37 gradi Celsius, cinque percento di anidride carbonica per un'ora. Successivamente, rimuovere il terreno solo dalle celle trattate e lavare le cellule con 250 microlitri del terreno completo preriscaldato. Quindi, rimuovere il mezzo di lavaggio.

Quindi, aggiungere 250 microlitri del terreno completo preriscaldato in ciascuno dei tre pozzetti. Incubare il vetrino in un incubatore a 37 gradi Celsius, cinque percento di anidride carbonica per un'ora. Dopo l'incubazione, scartare il terreno da tutti e cinque i pozzetti e lavare le cellule con 250 microlitri di PBS.

Quindi, rimuovere il PBS e fissare le celle con 250 microlitri di soluzione fissante a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi, scartare la soluzione fissante e lavare le celle con 250 microlitri di PBS. Aggiungere 250 microlitri di soluzione bloccante in ciascun pozzetto e incubare il vetrino a temperatura ambiente per un'ora.

Aspirare la soluzione bloccante da ciascun pozzetto tranne il controllo negativo. Dopo aver lavato le cellule con 250 microlitri di PBS, aggiungere 250 microlitri di soluzione di anticorpi primari a ciascun pozzetto. Incubare il vetrino a temperatura ambiente per un'ora in un luogo buio.

Rimuovere le soluzioni da ciascuno dei cinque pozzetti e lavare le celle con 250 microlitri di PBS. Quindi, rimuovere il PBS e aggiungere 250 microlitri di soluzione di anticorpi secondari. Incubare il vetrino a temperatura ambiente per un'ora al buio.

Aspirare la soluzione da ogni pozzetto e lavare le cellule con 250 microlitri di PBS. Rimuovere il PBS di lavaggio e quindi aggiungere 250 microlitri di PBS contenente cinque sonde fluorescenti micromolari in ciascun pozzetto. Incubare il vetrino per 10 minuti a temperatura ambiente.

Rimuovere la soluzione della sonda fluorescente da ogni pozzetto e lavare accuratamente le cellule due volte con 250 microlitri di PBS. Infine, aggiungi tre o quattro gocce di terreno di montaggio in ogni pozzetto. Tenere il vetrino al buio a temperatura ambiente fino a quando non viene ripreso al microscopio.

Visualizzare le cellule sotto un microscopio a scansione laser confocale invertito. Accendi i laser a 488 nanometri e quelli a 633 nanometri. Controllare l'amplificazione del laser e la dimensione del foro stenopeico.

Immagine del campione di controllo negativo. Ottimizza il segnale osservato per il nucleo e regola il segnale di FITC e Alexa 546 in modo che sia vicino allo zero. Quindi, utilizzando gli stessi parametri, visualizzare i campioni trattati.

Scartare l'intero terreno da tutti e sette i pozzetti di una piastra di coltura seminata. Quindi, aggiungere un millilitro di terreno completo preriscaldato nel pozzetto di controllo negativo e un millilitro di mezzo di trattamento preriscaldato nei restanti sei pozzetti. Incubare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius, cinque percento di anidride carbonica per cinque ore.

Dopo aver scartato il terreno da tutti i pozzetti, lavare accuratamente le celle due volte con due millilitri di PBS. Rimuovere il PBS e quindi aggiungere 500 microlitri di soluzione di tripsina EDTA in ciascun pozzetto. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius fino al distacco delle cellule, operazione che richiederà circa 10 minuti.

Utilizzando un millilitro di terreno completo, neutralizzare la tripsina in ogni pozzetto e agitare la piastra. Successivamente, sospendere le cellule mediante pipettaggio delicato. Trasferire le sospensioni in provette FACS separate e centrifugare i campioni a 150 volte G a quattro gradi Celsius per quattro minuti.

Decantare accuratamente i surnatanti. Quindi, aggiungere 500 microlitri di PBS ghiacciato in ciascuna provetta FACS e risospendere delicatamente le cellule. Tenere le provette in ghiaccio fino all'analisi da parte del FACS.

Qui viene presentata l'analisi dell'assorbimento del GnRH nelle cellule di carcinoma della faringe. Il trattamento di cinque ore con un micromolare di complesso fluorescente di GnRH ha determinato un'assunzione lieve, ma distinguibile, manifestata come segnale fluorescente verde localizzato nelle cellule tumorali della faringe. Un ulteriore aumento del dosaggio complesso ha portato a un aumento dell'assorbimento, dimostrando la dipendenza dalla dose dell'assorbimento del GnRH nelle cellule di carcinoma della faringe.

L'assorbimento del GnRH dipendente dal recettore e la distribuzione cellulare del ligando nel suo recettore nelle cellule di cancro del polmone sono stati analizzati mediante trattamento simultaneo con complesso GnRH fluorescente e colorazione del recettore GnRH di tipo uno e dei nuclei. I risultati mostrano che il recettore del GnRH di tipo uno è associato alla membrana cellulare mentre la proteina GnRH viene internalizzata nelle cellule e rimane nel loro citoplasma. L'assorbimento del GnRH nelle cellule di carcinoma della faringe è stato studiato anche utilizzando l'analisi FACS.

I risultati mostrano che l'assorbimento di GnRH osservato quando le cellule sono state trattate con un micromolare di coniugato di GnRH è stato fortemente aumentato quando la dose applicata alle cellule è stata aumentata a 10 micromolari. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in otto ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di proteggere i campioni trattati e i coloranti fluorescenti dalla luce diretta.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la vitalità cellulare o i saggi di apoptosi, al fine di rispondere a ulteriori domande, come l'efficienza con cui il farmaco mirato al GnRH può inibire la crescita di un determinato tipo di cancro. Dopo questo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della terapia del cancro per esplorare l'efficacia dei sistemi di somministrazione di farmaci basati sul GnRH nelle cellule tumorali aderenti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare questi coniugati GnRH marcati in fluorescenza per esplorare la suscettibilità delle cellule tumorali alle terapie mirate al GnRH.