Il WinCF Modello - Un Microcosmo Economico e Tractable di un muco bronchiale Plugged per studiare la Microbiologia del polmone Infezioni

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di simulare l'ambiente polmonare e coltivare i patogeni in modo più simile a quello in cui causano la malattia. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della microbiologia delle vie aeree, come ad esempio, come diversi patogeni batterici interagiscono nel polmone di un paziente affetto da fibrosi cistica. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente una facile manipolazione delle condizioni sperimentali.

Per osservare le risposte microbiche in modo simile a come si verificherebbero in un reale bronchio polmonare. A illustrare la procedura, sarà Will Comstock del nostro laboratorio. Per preparare il mezzo di coltura artificiale simile al muco, unire 16 millilitri di soluzione madre di muco precedentemente preparata, due millilitri di soluzione madre di cloruro di potassio, due millilitri di soluzione madre di cloruro di sodio, 200 microlitri di emulsione di tuorlo d'uovo, 5,6 millilitri di soluzione madre di DNA, 120 microlitri di soluzione madre di ferritina, 5,78 millilitri di soluzione di aminoacidi essenziali, 5,78 millilitri di soluzione di aminoacidi non essenziali e 2,44 millilitri di acqua sterile.

La preparazione accurata di un mezzo artificiale sterile per espettorato è estremamente importante. Infatti, qualsiasi contaminazione potrebbe alterare l'attività batterica nei capillari incubati, in una fase successiva. Dopo aver agitato delicatamente per mescolare, trasferire con una pipetta cinque millilitri del mezzo in otto tubi da centrifuga sterili da 15 millilitri.

Ora il mezzo può essere modificato per ottenere le condizioni chimiche desiderate. Ad esempio, i mezzi mostrati qui hanno avuto il loro pH alterato e sono stati aggiunti coloranti per riflettere le diverse acidità. Successivamente, sotto una cappa bio-sicura sterile, aggiungere 900 microlitri di mezzo in ciascuna delle otto provette sterili da 1,5 millilitro.

Omogeneizzare i campioni di espettorato precedentemente raccolti utilizzando una siringa da tre millilitri per prelevare ed espellere ripetutamente l’espettorato fino a quando non raggiunge una consistenza uniforme. Aggiungere 100 microlitri di espettorato omogeneizzato in ciascuna delle otto provette per microcentrifuga. Successivamente, vortexare le provette per mescolare adeguatamente.

Etichettare altri otto tubi sterili da 15 millilitri per centrifuga in base ai tubi da microcentrifuga con mezzo precedentemente preparati. Questi saranno i tubi di incubazione. Utilizzare una soluzione di etanolo al 70% per sterilizzare un tovagliolo di carta e lasciarlo asciugare.

Strappare il tovagliolo in pezzi di circa quattro pollici quadrati ciascuno. Quindi sminuzzare un pezzo sul fondo di ogni provetta di incubazione. Con un batuffolo di carta sul fondo di ogni provetta, utilizzare 1 millilitro di acqua sterile per inumidire leggermente ciascun batuffolo, creando così un ambiente umido all'interno della provetta.

Per ogni provetta di mezzo, riempire tre tubi capillari di vetro con il mezzo tenendo un'estremità del tubo nel mezzo e inclinandolo orizzontalmente, permettendo all'azione capillare di far entrare il mezzo nel tubo. Arrestare il riempimento ponendo delicatamente un dito guantato sull'estremità aperta del tubo, quindi sigillare l'altra estremità premendola in un blocco di sigillante per capillari.

Posizionare ogni set di tre tubi capillari in provette da incubazione da 15 millilitri, con il lato sigillato con pasta rivolto verso il basso. Quindi chiudere le provette e assicurarsi che siano etichettate. Questi tre tubi capillari sono previsti per la replicazione di ciascuna condizione di controllo.

Una volta riempiti tutti i tubi di incubazione con i rispettivi tubi capillari, posizionare i portatubi a 37 gradi Celsius in modo che i tubi vengano incubati in posizione orizzontale, affinché qualsiasi gas prodotto non possa fuoriuscire dall'estremità aperta. Incubare i tubi per 48 ore.

Rimuovere i tubi dall'incubatrice assicurandosi di mantenerli in posizione orizzontale. Estrarre con attenzione i tubi capillari dai tubi di incubazione, tenendo ogni serie di tre separata dalle altre serie. Disporre i tubi capillari uno accanto all'altro su una scatola luminosa, allineandoli in modo che il contenuto dei tubi sia visibile e illuminato dal basso.

Creare un'apertura ogni tre provette per separare diverse condizioni chimiche. Successivamente, focalizzare la fotocamera direttamente sulle provette in modo che tutte siano visibili nel campo visivo e la luce dalla scatola luminosa garantisca un contrasto sufficiente e una buona visualizzazione del colore dei coloranti nelle provette. Per estrarre il contenuto delle provette per analisi successive, rimuovere un set alla volta delle provette triplicate dalla scatola luminosa. Inserire un ago da 25 gauge lungo 0,5 pollici con estremità smussata nell'estremità tappata della provetta capillare per rompere il sigillo.

Quindi capovolgere il tubo capillare per permettere al mezzo di gocciolare dalla parte superiore in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. Se il mezzo non gocciola, utilizzare una pipetta da 200 microlitri per espellere il mezzo dal tubo premendo il pistone della pipetta quando è inserito nell'estremità del tubo capillare. Come mostrato qui, quando nessun campione di espettorato è stato aggiunto al mezzo, l'unico cambiamento osservato nell'intero spettro di pH dopo 48 ore di incubazione è stata una leggera diminuzione del volume del mezzo, risultante da una minima evaporazione.

Le provette capillari inoculate hanno mostrato variazioni di volume, comparsa di bolle di gas, alterazioni del colore e formazione di depositi opachi. Questi risultati indicano che i batteri e altri microrganismi presenti nell'espettorato aggiunto sono in grado di crescere e modificarsi all'interno del mezzo artificiale. Dopo l'incubazione, possono essere eseguiti altri metodi, come metabolomica e sequenziamento del DNA, per rispondere ad ulteriori domande sul comportamento dei microrganismi che crescono nelle provette capillari.

Il sistema winCF è un metodo innovativo per studiare l'attività del microbioma polmonare; importante per numerose malattie tra cui la fibrosi cistica, la BPCO, l'asma e altre.