Name: Le tecniche per indurre e Quantificare cellulare senescenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-01T11:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Impara le tecniche per indurre e quantificare la senescenza cellulare nei modelli di invecchiamento. Questi metodi permettono di monitorare i marcatori di senescenza e studiare i fattori biologici che regolano l'invecchiamento cellulare.

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Questo studio è stato sostenuto dal programma di ricerca intramurale del National Institutes of Health, National Institute on Aging. Gli autori desiderano ringraziare Myriam Gorospe e Kotb Abdelmohsen per molte discussioni utili su senescenza e Kotb Abdelmohsen per anche criticamente la lettura del manoscritto. Ringraziamo anche i nostri membri di laboratorio, in particolare Douglas Dluzen per la lettura critica del manoscritto.

<ol><li>Hayflick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Limited+in+Vitro+Lifetime+of+Human+Diploid+Cell+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains.</a> Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).</li>
<li>van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+senescent+cells+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of senescent cells in ageing.</a> Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).</li>
<li>Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence%3A+when+bad+things+happen+to+good+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence: when bad things happen to good cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (9), 729-740 (2007).</li>
<li>Dimri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 9363-9367 (1995).</li>
<li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essence+of+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The essence of senescence.</a> Genes Dev. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li>
<li>Pospelova, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudo-DNA+damage+response+in+senescent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Pseudo-DNA damage response in senescent cells.</a> Cell Cycle. 8 (24), 4112-4118 (2009).</li>
<li>Narita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rb-mediated+heterochromatin+formation+and+silencing+of+E2F+target+genes+during+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence.</a> Cell. 113 (6), 703-716 (2003).</li>
<li>Ben-Porath, I., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signals+and+pathways+activating+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The signals and pathways activating cellular senescence.</a> Int J Biochem Cell Biol. 37 (5), 961-976 (2005).</li>
<li>Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+cells%2C+tumor+suppression%2C+and+organismal+aging%3A+good+citizens%2C+bad+neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Senescent cells, tumor suppression, and organismal aging: good citizens, bad neighbors.</a> Cell. 120 (4), 513-522 (2005).</li>
<li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biol. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li>
<li>Tominaga-Yamanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF90+coordinately+represses+the+senescence-associated+secretory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">NF90 coordinately represses the senescence-associated secretory phenotype.</a> Aging (Albany NY). 4 (10), 695-708 (2012).</li>
<li>Wiley, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Dysfunction+Induces+Senescence+with+a+Distinct+Secretory+Phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Dysfunction Induces Senescence with a Distinct Secretory Phenotype.</a> Cell Metab. 23 (2), 303-314 (2016).</li>
<li>Hoare, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOTCH1+mediates+a+switch+between+two+distinct+secretomes+during+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">NOTCH1 mediates a switch between two distinct secretomes during senescence.</a> Nat Cell Biol. 18 (9), 979-992 (2016).</li>
<li>Rodier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+the+senescence-associated+secretory+phenotype+%28SASP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of the senescence-associated secretory phenotype (SASP).</a> Methods Mol Biol. 965, 165-173 (2013).</li>
<li>Srikantan, S., Marasa, B. S., Becker, K. G., Gorospe, M., Abdelmohsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+microRNAs%3A+individual+gene+repressors%2C+global+translation+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Paradoxical microRNAs: individual gene repressors, global translation enhancers.</a> Cell Cycle. 10 (5), 751-759 (2011).</li>
<li>Abdelmohsen, K., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncoding+RNA+control+of+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Noncoding RNA control of cellular senescence.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2015).</li>
<li>Bhaumik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+miR-146a%2Fb+negatively+modulate+the+senescence-associated+inflammatory+mediators+IL-6+and+IL-8%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs miR-146a/b negatively modulate the senescence-associated inflammatory mediators IL-6 and IL-8.</a> Aging. 1 (4), 402-411 (2009).</li>
<li>Rodier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-SCARS%3A+distinct+nuclear+structures+that+sustain+damage-induced+senescence+growth+arrest+and+inflammatory+cytokine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">DNA-SCARS: distinct nuclear structures that sustain damage-induced senescence growth arrest and inflammatory cytokine secretion.</a> J Cell Sci. 124 (PT 1), 68-81 (2011).</li>
<li>Bernardes de Jesus, B., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+cell+and+organ+senescence+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Assessing cell and organ senescence biomarkers.</a> Circ Res. 111 (1), 97-109 (2012).</li>
<li>Sharpless, N. E., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forging+a+signature+of+in+vivo+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Forging a signature of in vivo senescence.</a> Nat Rev Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).</li>
<li>Rubio, M. A., Kim, S. -H., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+Manipulation+of+Telomerase+Expression+and+Telomere+Length%3A+implications+for+the+ionizing+radiation+response+and+replicative+senescence+of+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Reversible Manipulation of Telomerase Expression and Telomere Length: implications for the ionizing radiation response and replicative senescence of human cells.</a> J Biol Chem. 277 (32), 28609-28617 (2002).</li>
<li>Chen, Q. M., Prowse, K. R., Tu, V. C., Purdom, S., Linskens, M. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+the+Senescent+Phenotype+from+Telomere+Shortening+in+Hydrogen+Peroxide-Treated+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Uncoupling the Senescent Phenotype from Telomere Shortening in Hydrogen Peroxide-Treated Fibroblasts.</a> Experimental Cell Research. 265 (2), 294-303 (2001).</li>
<li>Dumont, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+replicative+senescence+biomarkers+by+sublethal+oxidative+stresses+in+normal+human+fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast.</a> Free Radic Biol Med. 28 (3), 361-373 (2000).</li>
<li>Roninson, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Cell+Senescence+in+Cancer+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor Cell Senescence in Cancer Treatment.</a> Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).</li>
<li>Nyunoya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+Smoke+Induces+Cellular+Senescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cigarette Smoke Induces Cellular Senescence.</a> J Respir Cell Mol Biol. 35 (6), 681-688 (2006).</li>
<li>Bai, H., Gao, Y., Hoyle, D. L., Cheng, T., Wang, Z. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Transforming+Growth+Factor-%CE%B2+Signaling+Delays+Cellular+Senescence+and+Preserves+the+Function+of+Endothelial+Cells+Derived+From+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Suppression of Transforming Growth Factor-β Signaling Delays Cellular Senescence and Preserves the Function of Endothelial Cells Derived From Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cells Transl Med. , (2016).</li>
<li>Senturk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta+induces+senescence+in+hepatocellular+carcinoma+cells+and+inhibits+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta induces senescence in hepatocellular carcinoma cells and inhibits tumor growth.</a> Hepatology. 52 (3), 966-974 (2010).</li>
<li>Aird, K. M., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+senescence-associated+heterochromatin+foci+%28SAHF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF).</a> Methods Mol Biol. 965, 185-196 (2013).</li>
<li>Pospelova, T. V., Chitikova, Z. V., Pospelov, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+approach+for+monitoring+cell+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An integrated approach for monitoring cell senescence.</a> Methods Mol Biol. 965, 383-408 (2013).</li>
<li>Di Micco, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+oncogene-induced+DNA+damage+response+and+heterochromatin+in+senescence+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer.</a> Nat Cell Biol. 13 (3), 292-302 (2011).</li>
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<li>Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-galactosidase+staining+on+bone+marrow.+The+osteoclast+pitfall%5BTitle%5D)+AND+%22Histol+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall.</a> Histol Histopathol. 22 (9), 971-976 (2007).</li>
<li>Witkiewicz, A. K., Knudsen, K. E., Dicker, A. P., Knudsen, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meaning+of+p16%28ink4a%29+expression+in+tumors%3A+functional+significance%2C+clinical+associations+and+future+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">The meaning of p16(ink4a) expression in tumors: functional significance, clinical associations and future developments.</a> Cell Cycle. 10 (15), 2497-2503 (2011).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+p16%28Ink4a%29-positive+cells+shorten+healthy+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan.</a> Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+p16Ink4a-positive+senescent+cells+delays+ageing-associated+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders.</a> Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).</li>
<li>Demaria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Essential+Role+for+Senescent+Cells+in+Optimal+Wound+Healing+through+Secretion+of+PDGF-AA%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">An Essential Role for Senescent Cells in Optimal Wound Healing through Secretion of PDGF-AA.</a> Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).</li>
<li>Noren Hooten, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin-mediated+increase+in+DICER1+regulates+microRNA+expression+and+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Metformin-mediated increase in DICER1 regulates microRNA expression and cellular senescence.</a> Aging Cell. 15 (3), 572-581 (2016).</li>
<li>Barzilai, N., Crandall, J. P., Kritchevsky, S. B., Espeland, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+as+a+Tool+to+Target+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Metformin as a Tool to Target Aging.</a> Cell Metab. 23 (6), 1060-1065 (2016).</li>
<li>Foretz, M., Guigas, B., Bertrand, L., Pollak, M., Viollet, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin%3A+from+mechanisms+of+action+to+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Metformin: from mechanisms of action to therapies.</a> Cell Metab. 20 (6), 953-966 (2014).</li>
<li>Cahu, J., Sola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+method+to+quantify+senescent+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A sensitive method to quantify senescent cancer cells.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li>
<li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+%28SA-betagal%29+activity%2C+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).</li>
<li>Noppe, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+flow+cytometric+method+for+measuring+senescence+associated+beta-galactosidase+activity+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts.</a> Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).</li>
<li>Bassaneze, V., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemiluminescent+detection+of+senescence-associated+beta+galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemiluminescent detection of senescence-associated beta galactosidase.</a> Methods Mol Biol. 965, 157-163 (2013).</li>
<li>Redon, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-H2AX+detection+in+peripheral+blood+lymphocytes%2C+splenocytes%2C+bone+marrow%2C+xenografts%2C+and+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">gamma-H2AX detection in peripheral blood lymphocytes, splenocytes, bone marrow, xenografts, and skin.</a> Methods Mol Biol. 682, 249-270 (2011).</li>
<li>Kosar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+heterochromatin+foci+are+dispensable+for+cellular+senescence%2C+occur+in+a+cell+type-+and+insult-dependent+manner+and+follow+expression+of+p16%28ink4a%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a).</a> Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).</li>
<li>Kennedy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+mouse+cells+fail+to+overtly+regulate+the+HIRA+histone+chaperone+and+do+not+form+robust+Senescence+Associated+Heterochromatin+Foci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Div%22%5BJournal%5D)">Senescent mouse cells fail to overtly regulate the HIRA histone chaperone and do not form robust Senescence Associated Heterochromatin Foci.</a> Cell Div. 5, 16(2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui, abbiamo descritto metodi per replicativo e danno del DNA senescenza indotta utilizzando fibroblasti diploidi umane. Inoltre, le tecniche di quantificazione delle proteine ​​e livelli di mRNA di varie proteine ​​senescenza associate sono inclusi, così come colorazione per SA-β-gal e per il marcatore DNA-danneggiamento γ-H2AX. Questi protocolli possono essere ampiamente utilizzati per valutare fenotipi senescenti sia in vitro che in vivo, sebbene esistano molti avvertimenti per la caratterizzazione ...

Più di mezzo secolo fa, Hayflick e colleghi hanno descritto come le cellule proliferano non trasformata in cultura, ma solo per un periodo limitato di tempo 1. coltura a lungo termine di fibroblasti umani ha causato le cellule per fermare la proliferazione; tuttavia, erano metabolicamente attiva, e questo è stato chiamato senescenza cellulare. Senescenza può essere utile per inibire la tumorigenesi, ma può anche essere dannoso, in quanto si ritiene contribuiscano alla perdita di capacità rigenerativa che si verifica con l&#39;invecchiamento 2, 3. Cellule senescenti hanno dimostrato di accumularsi nei tessuti come esseri umani 4 anni e sono stati implicati in una serie di processi biologici, tra cui lo sviluppo embrionale, la guarigione delle ferite, la riparazione dei tessuti e l&#39;infiammazione legata all&#39;età 2. passaging continuo di cellule in coltura induce senescenza replicativa, che è stato collegatodi telomero attrito e instabilità genomica. Varie sollecitazioni cellulari, comprese danno al DNA e oncogeni, possono anche causare senescenza 3. Senescenza causata da fattori diversi telomere attrito è spesso chiamato da stress o senescenza prematura e dipende generalmente dalla p16 INK4A / Rb pathway 5. Sebbene proliferanti, cellule non trasformate compaiono tipicamente mandrino in forma, cellule senescenti possono essere identificati come aventi determinate caratteristiche, tra cui una TV, ampio morfologia e una maggiore attività β-galattosidasi senescenza-associato (SA-β-gal) (Figure 1 e 2). Cellule senescenti accumulano anche marcatori di danno del DNA, tra cui γ-H2AX (figura 3) 6, e, potenzialmente, senescenza associata eterocromatina foci (SAHF) (Figura 4) 7. cellule senescenti hanno livelli elevati di regolatori del ciclo cellulare, tra cui p<html> 16 (INK4A p16) e / o p21 e p53 (Figura 5) 8, 9. Inoltre, i dati recenti hanno dimostrato che le cellule senescenti possono avere effetti non autonomi secernendo un numero di citochine pro-infiammatorie e chemochine chiamato senescenza associata secretoria fenotipo (PSAS) 10. Sebbene questo fenomeno SASP può variare da tipo cellulare a tipo cellulare, in generale, è dimostrato da un aumento di interleuchina-6 (IL-6), IL-8, fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF), alla crescita α regolata oncogene (GRO-α) e GRO-β, tra gli altri (Figura 6). Lo stress particolare o danni che induce senescenza possono anche influenzare il fenotipo secretorio 11, 12, 13. SASP può essere rilevata misurando i livelli di proteine ​​secrete mediante ELISA o array citochine / proteinas = &quot;xref&quot;&gt; 10, 14. Sebbene i meccanismi post-trascrizionali possono regolare i livelli proteici SASP 11, 15, 16, 17, cambiamenti nei livelli di mRNA possono essere rilevati anche in molti casi. Questi cambiamenti sono generalmente più sensibili e più facile da quantificare rispetto misurazioni del livello di proteine. Altri marcatori senescenti possono anche essere valutati, compresi persistente danno al DNA foci nucleari, detti segmenti di DNA con alterazioni della cromatina rinforzo senescenza (DNA-SCARS) 18, e vari altri marcatori 3, 19, 20. Qui, descriviamo comuni tecniche per indurre senescenza in cellule in coltura e per la misura diversi marcatori di senescenza, tra SA-β-Gal, γ-H2AX, SAHF, e la proteina e mRNA di senescemolecole SNO-associata.

<table><tbody><tr><td>16% Gel di tris-glicina</td><td>Invitrogen</td><td>XP00160BOX</td><td></td></tr><tr><td>Acido-Fenolo ChCl3</td><td>Ambion</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 568 capra anticorpo di topo</td><td>Invitrogen</td><td>A11031</td><td>Diluizione 1:300</td></tr><tr><td>Sollevatori cellulari</td><td>Corning Inc.</td><td>3008</td><td>Raschietto cellulare</td></tr><tr><td>ECL anti-topo anticorpo collegato HRP</td><td>Amersham</td><td>NA931V</td><td></td></tr><tr><td>ECL Plus Western Blotting Substrato</td><td>Pierce</td><td>32132</td><td>ECL</td></tr><tr><td></td><td>DAPI Sonde molecolari</td><td>MP01306</td><td>stock 5 mg/mL in dH2O</td></tr><tr><td>Anticorpo GAPDH</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-32233</td><td>1:1.000 - 5.000 diluizione</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td></td></tr><tr><td>Histone H3 dimetil K9 anticorpo monoclonale</td><td>Abcam</td><td>1220</td><td>diluizione 1:500</td></tr><tr><td>Saggio ELISA umano IL-6 Quantikine</td><td>R& D systems</td><td>D6050</td><td></td></tr> Human <tr><td>IL-8 Quantikine ELISA test</td><td>R& D systems</td><td>D8000C</td><td></td></tr><tr><td>Human GROa Quantikine ELISA assay</td><td>R& Sistemi D</td><td>DRG00</td><td></td></tr><tr><td>N-N-dimetilformammide&nbsp;</td><td>Anticorpo</td> monoclonale Sigma <td>D4551</td><td>DMF</td></tr><tr><td>p16</td><td>BD Biosciences</td><td>51-1325gr</td><td>diluizione 1:500</td></tr><tr><td>anticorpo monoclonale p21</td><td>Millipore</td><td>05-345</td><td>diluizione 1:750 diluizione</td></tr><tr><td>p53 anticorpo monoclonale</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td>diluizione 1:500 clone DO-1</td></tr><tr><td>fosfo-H2AX (Ser139) FITC coniugato anticorpo</td><td>Cell Signaling</td><td>9719</td><td>1:2.000 diluizione</td></tr><tr><td>POWER SYBR-green PCR master mix&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>Marcatori di peso molecolare pre-colorati</td><td>Biorad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade&nbsp;</td><td>Membrana Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>PVDF&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>Kit di colorazione per senescenza &beta;-galattosidasi</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Ambion/Life Tech</td><td>10296028</td><td></td></tr></tbody></table>

le tecniche per indurre e quantificare cellulare senescenza

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

In risposta allo stress cellulare o danno, le cellule proliferanti possono indurre un programma specifico che avvia uno stato di arresto del ciclo cellulare a lungo termine, chiamato senescenza cellulare. Accumulo di cellule senescenti verifica con l&#39;invecchiamento organismal e mediante coltura continua in vitro. cellule senescenti influenzano molti processi biologici, compreso lo sviluppo embrionale, la riparazione dei tessuti e la rigenerazione, soppressione del tumore, e l&#39;invecchiamento. Caratteristiche di cellule senescenti includono, ma non sono limitati a, maggiore attività β-galattosidasi senescenza-associato (SA-β-gal); p16 INK4a, p53, p21 e livelli; Livelli più elevati di danno al DNA, tra γ-H2AX; la formazione di senescenza associata Eterocromatina Foci (SAHF); e l&#39;acquisizione di un senescenza associata secretoria fenotipo (SASP), un fenomeno caratterizzato dalla secrezione di alcune citochine pro-infiammatorie e molecole di segnalazione. Qui, descriviamo i protocolli sia per replicativo esenescenza DNA danno-indotta in cellule coltivate. Inoltre, si segnalano tecniche per monitorare il fenotipo senescente utilizzando diversi marcatori senescenza-associata, tra SA-β-gal, γ-H2AX e SAHF colorazione, e per quantificare i livelli di proteine ​​e mRNA di regolatori del ciclo cellulare e fattori SASP. Questi metodi possono essere applicati alla valutazione della senescenza in vari modelli e tessuti.

Le figure 2 - 6 mostrano risultati rappresentativi SA-β-gal colorazione; colorazione per γ-H2AX e SAHF; valutazione dei livelli di proteina di p16 INK4A, p21, e p53; e mRNA e di proteina di molecole senescenti-associata. Aumento della colorazione SA-β-gal verifica con replicativa e danni al DNA indotto senescenza. Inoltre, osservare i cambiamenti morfologici che si verificano con senescenza. Cellule diventano allargata e piatta rispetto alla comparsa del mandr...

senescenza cellulare, lo stato irreversibile di arresto del ciclo cellulare, può essere indotta da vari stress cellulari. Qui, descriviamo i protocolli per indurre la senescenza e metodi per valutare cellulare marcatori di senescenza.

Le tecniche per indurre e Quantificare cellulare senescenza

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

L'obiettivo generale di queste tecniche è quello di fornire una cassetta degli attrezzi per consentire l'induzione, il monitoraggio e la quantificazione della senescenza cellulare. Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave sull'identificazione e la quantificazione della senescenza cellulare e dei fattori biologici che regolano l'invecchiamento cellulare e dell'organismo. Il vantaggio principale di queste tecniche è che comprendono una varietà di metodi per monitorare la senescenza cellulare in diversi modelli, tessuti e tipi di cellule.Iniziare impiattando le cellule proliferative di interesse a passaggio precoce a una densità sparsa nel piatto appropriato per l'analisi. E coltivare le cellule durante la notte in un incubatore per colture tissutali. Quando le cellule sono confluenti al 50-60%, aspirare il terreno di coltura e lavare le cellule con PBS due volte.Dopo il secondo lavaggio, coprire le celle con un sottile strato di PBS. Ed esporre le cellule a una singola dose di irradiazione gamma di 10 gradi. Sostituire il PBS con un terreno di coltura.E rimetti le cellule nell'incubatrice. Cambio del fluido ogni 48-72 ore con monitoraggio giornaliero dei cambiamenti morfologici al microscopio ottico. Da sette a 10 giorni dopo l'irradiazione, scongelare tutti i reagenti da un kit commerciale per il dosaggio della beta-galattosidasi associata alla senescenza in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius.Quando tutti i reagenti raggiungono la temperatura ambiente, preparare le soluzioni fissative e coloranti secondo le istruzioni del produttore. E lavare delicatamente ogni pozzetto con PBS a temperatura ambiente. Fare attenzione a sciacquare accuratamente le cellule poiché le cellule di senescenza non aderiscono bene e possono essere facilmente rimosse durante i lavaggi.Fissare le cellule in ogni pozzetto con un millilitro di soluzione fissativa per pozzetto per 10-15 minuti a temperatura ambiente. Seguito da due lavaggi da due millilitri con PBS per pozzetto. Successivamente, aggiungere un millilitro di soluzione colorante beta-galattosidasi a ciascun pozzetto e coprire la piastra con un foglio di alluminio per una coltura da 24 a 48 ore in un incubatore a 37 gradi Celsius senza anidride carbonica.Controllare le celle a 24 ore. Quando le cellule sono sufficientemente colorate, sostituire la soluzione beta-gal con PBS fresco ed esaminare le colture su un microscopio ottico con una fotocamera collegata a un obiettivo 10x o superiore. Le cellule beta-galattosidasi associate alla senescenza appariranno blu.Quindi, ottenere almeno cinque immagini non sovrapposte per pozzetto. E conta manualmente il numero totale di cellule positive alla beta-galattosidasi associate alla senescenza e il numero totale di cellule per immagine per calcolare la percentuale di cellule beta-galattosidasi associate alla senescenza per pozzetto. 10 giorni dopo l'irradiazione gamma, lavare le cellule tre volte con PBS.Dopo l'ultimo lavaggio, sostituire il PBS con 2,5 millilitri di terreno privo di siero, integrato con antibiotici per piastra di sei centimetri e rimettere le cellule nell'incubatore di coltura tissutale durante la notte. La mattina successiva, trasferisci il terreno in un tubo conico con ghiaccio. E lavare le celle due volte con PBS fresco.Quindi, tripsinizzare e contare le cellule. Quindi, centrifugare il surnatante raccolto dalla piastra di coltura cellulare. E poi filtrarlo attraverso un colino a siringa da 0,45 micrometri e congelare il terreno in aliquote da 500 microlitri a 80 gradi Celsius fino alla loro analisi mediante ELISA.L'aumento della senescenza associata alla colorazione beta-gal si verifica con la senescenza replicativa e indotta da danni al DNA. Si noti la forma piatta ingrandita delle cellule senescenti rispetto all'aspetto simile a un fuso dei fibroblasti proliferanti. In questo esperimento, le cellule giovani proliferanti o senescenti replicative sono state fissate come descritto nel protocollo scritto.E colorato con un anticorpo contro un biomarcatore per le rotture del doppio filamento di DNA e DAPI. Con un apparente aumento del numero di fosi di rottura del doppio filamento di DNA osservati nelle cellule senescenti. L'analisi RT-qPCR dei fattori fenotipici secretori associati alla senescenza rivela che almeno alcuni fattori sono sovraregolati dopo la senescenza indotta dall'irradiazione gamma nei fibroblasti diploidi umani a basso passaggio a livello di MRNA.Ciò è ulteriormente confermato dall'ELISA dei surnatanti di coltura cellulare irradiati con raggi gamma. Una volta padroneggiata, l'induzione del danno al DNA e la colorazione con SA beta-gal possono essere completate in circa 30 minuti di tempo pratico. I terreni di condizione per quantificare i livelli di proteina SASP possono essere preparati in circa 30 minuti.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di monitorare i cambiamenti morfologici nelle colture cellulari prima di procedere alla quantificazione del marcatore senescente. Dopo il suo sviluppo, queste tecniche hanno aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'invecchiamento e del cancro per esplorare la senescenza in una varietà di tessuti, colture cellulari e organismi modello. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come indurre, monitorare e quantificare la senescenza cellulare.

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Sia senescenza impedisce o promuove la tumorigenesi rimane controverso. Poiché i farmaci chemioterapici possono indurre le cellule tumorali a senesce, studiando la senescenza è essenziale per proporre nuove terapie. Tuttavia, il dosaggio standard di β-galattosidasi e ampiamente utilizzato presenta gravi inconvenienti. Proponiamo qui un saggio di citometria di flusso basato rapido e sensibile per quantificare senescenza.

Un metodo sensibile per quantificare le cellule tumorali senescenti

Qui presentiamo un protocollo dettagliato per rilevare entrambi senescenti e cellule staminali pluripotenti in muscolo scheletrico dopo un danno mentre induce in vivo riprogrammazione. Questo metodo è adatto per valutare il ruolo della senescenza cellulare durante rigenerazione tissutale e riprogrammazione in vivo.

Valutazione delle lesioni-indotta senescenza e In Vivo riprogrammazione nel muscolo scheletrico

Andremo a discutere una serie di protocolli per l'induzione e la convalida della senescenza cellulare in cellule coltivate. Ci concentriamo sui diversi stimoli che inducono la senescenza e descrivere la quantificazione degli indicatori comuni di senescenza-collegata. Forniamo dettagli tecnici usando i fibroblasti come un modello, ma i protocolli possono essere adattati a vari modelli di cellulari.

Induzione e convalida della senescenza cellulare in cellule umane primarie

ROS intracellulari è stato indicato per svolgere un ruolo importante nell'induzione della senescenza cellulare. Qui, descriviamo un test sensibile per quantificare i livelli di ROS durante la senescenza cellulare. Forniamo anche i protocolli per la valutazione del fenotipo secretivo senescenza-collegata, che secondo come riferito contribuisce a varie disfunzioni relative all'età.

Una misura quantitativa di specie reattive dell'ossigeno e senescenza-collegata di fenotipo secretivo in fibroblasti umani normali durante la senescenza indotta da Oncogene

La senescenza cellulare è il fattore chiave nello sviluppo di patologie croniche legate all'età. L'identificazione delle terapie che colpisce le cellule senescenti è promettente per estendere l'invecchiamento sano. Qui, presentiamo un nuovo saggio da vagliare per l'identificazione delle senoterapie sulla base della misurazione dell'attività di senescenza associata a z-Galactosidase in singole cellule.

Saggio di screening basato su SA-Galactosidase per l'identificazione dei farmaci senoterapici

Questo protocollo descrive il flusso di lavoro per l'etichettatura metabolica di cellule senescenti e non in divisione con SILAC pulsato, analisi di spettrometria di massa non mirata e un calcolo semplificato delle emivite proteiche.

Misurazione dei tassi di turnover proteico in cellule coltivate senescenti e non in divisione con etichettatura metabolica e spettrometria di massa

Qui presentiamo un metodo basato sulla citometria a flusso per la visualizzazione e la quantificazione di più marcatori associati alla senescenza in singole cellule.

Imaging simultaneo e rilevamento basato sulla citometria a flusso di marcatori di senescenza fluorescenti multipli in cellule tumorali senescenti indotte dalla terapia

Viene presentato un protocollo per la quantificazione fluorescente citometrica a flusso di cellule tumorali senescenti indotte da farmaci chemioterapici in colture cellulari o in modelli tumorali murini. Le procedure opzionali includono la co-immunocolorazione, la fissazione del campione per facilitare l'analisi di grandi lotti o punti temporali e l'arricchimento di cellule senescenti vitali mediante selezione citometrica a flusso.

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L'immunofluorescenza multiplexata consente l'etichettatura sequenziale di più marcatori anticorpali all'interno di una singola sezione tissutale per supportare l'analisi spaziale dell'architettura tissutale e delle popolazioni cellulari. Qui viene presentato un flusso di lavoro per la rilevazione multiplex di marcatori strutturali, associati alla senescenza e immunologici, inclusa la preparazione manuale e automatizzata delle vetrine, l'imaging iterativo e l'analisi di singole cellule...

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Questo articolo presenta un protocollo LysoTracker per cellule vive per misurare il rimodellamento lisosomico durante la senescenza nei fibroblasti umani IMR-90.

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Questo metodo studia come i fibroblasti cutanei senescenti influenzino quelli sani. La senescenza viene indotta tramite esposizione agli UVB e il mezzo condizionato viene applicato ai fibroblasti normali. Aiuta a valutare i composti bioattivi che mirano alla comunicazione cellula a cellula alterata nell'invecchiamento della pelle.

Nuova combinazione di antiossidanti per ripristinare una comunicazione intercellulare sana in un modello in vitro utilizzando un mezzo condizionato da cellule senescenti

Impara le tecniche per indurre e quantificare la senescenza cellulare nei modelli di invecchiamento. Questi metodi permettono di monitorare i marcatori di senescenza e studiare i fattori biologici che regolano l'invecchiamento cellulare.

Le tecniche per indurre e Quantificare cellulare senescenza

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