Le tecniche per indurre e Quantificare cellulare senescenza

L'obiettivo generale di queste tecniche è quello di fornire una cassetta degli attrezzi per consentire l'induzione, il monitoraggio e la quantificazione della senescenza cellulare. Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave sull'identificazione e la quantificazione della senescenza cellulare e dei fattori biologici che regolano l'invecchiamento cellulare e dell'organismo. Il vantaggio principale di queste tecniche è che comprendono una varietà di metodi per monitorare la senescenza cellulare in diversi modelli, tessuti e tipi di cellule.

Iniziare impiattando le cellule proliferative di interesse a passaggio precoce a una densità sparsa nel piatto appropriato per l'analisi. E coltivare le cellule durante la notte in un incubatore per colture tissutali. Quando le cellule sono confluenti al 50-60%, aspirare il terreno di coltura e lavare le cellule con PBS due volte.

Dopo il secondo lavaggio, coprire le celle con un sottile strato di PBS. Ed esporre le cellule a una singola dose di irradiazione gamma di 10 gradi. Sostituire il PBS con un terreno di coltura.

E rimetti le cellule nell'incubatrice. Cambio del fluido ogni 48-72 ore con monitoraggio giornaliero dei cambiamenti morfologici al microscopio ottico. Da sette a 10 giorni dopo l'irradiazione, scongelare tutti i reagenti da un kit commerciale per il dosaggio della beta-galattosidasi associata alla senescenza in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius.

Quando tutti i reagenti raggiungono la temperatura ambiente, preparare le soluzioni fissative e coloranti secondo le istruzioni del produttore. E lavare delicatamente ogni pozzetto con PBS a temperatura ambiente. Fare attenzione a sciacquare accuratamente le cellule poiché le cellule di senescenza non aderiscono bene e possono essere facilmente rimosse durante i lavaggi.

Fissare le cellule in ogni pozzetto con un millilitro di soluzione fissativa per pozzetto per 10-15 minuti a temperatura ambiente. Seguito da due lavaggi da due millilitri con PBS per pozzetto. Successivamente, aggiungere un millilitro di soluzione colorante beta-galattosidasi a ciascun pozzetto e coprire la piastra con un foglio di alluminio per una coltura da 24 a 48 ore in un incubatore a 37 gradi Celsius senza anidride carbonica.

Controllare le celle a 24 ore. Quando le cellule sono sufficientemente colorate, sostituire la soluzione beta-gal con PBS fresco ed esaminare le colture su un microscopio ottico con una fotocamera collegata a un obiettivo 10x o superiore. Le cellule beta-galattosidasi associate alla senescenza appariranno blu.

Quindi, ottenere almeno cinque immagini non sovrapposte per pozzetto. E conta manualmente il numero totale di cellule positive alla beta-galattosidasi associate alla senescenza e il numero totale di cellule per immagine per calcolare la percentuale di cellule beta-galattosidasi associate alla senescenza per pozzetto. 10 giorni dopo l'irradiazione gamma, lavare le cellule tre volte con PBS.

Dopo l'ultimo lavaggio, sostituire il PBS con 2,5 millilitri di terreno privo di siero, integrato con antibiotici per piastra di sei centimetri e rimettere le cellule nell'incubatore di coltura tissutale durante la notte. La mattina successiva, trasferisci il terreno in un tubo conico con ghiaccio. E lavare le celle due volte con PBS fresco.

Quindi, tripsinizzare e contare le cellule. Quindi, centrifugare il surnatante raccolto dalla piastra di coltura cellulare. E poi filtrarlo attraverso un colino a siringa da 0,45 micrometri e congelare il terreno in aliquote da 500 microlitri a 80 gradi Celsius fino alla loro analisi mediante ELISA.

L'aumento della senescenza associata alla colorazione beta-gal si verifica con la senescenza replicativa e indotta da danni al DNA. Si noti la forma piatta ingrandita delle cellule senescenti rispetto all'aspetto simile a un fuso dei fibroblasti proliferanti. In questo esperimento, le cellule giovani proliferanti o senescenti replicative sono state fissate come descritto nel protocollo scritto.

E colorato con un anticorpo contro un biomarcatore per le rotture del doppio filamento di DNA e DAPI. Con un apparente aumento del numero di fosi di rottura del doppio filamento di DNA osservati nelle cellule senescenti. L'analisi RT-qPCR dei fattori fenotipici secretori associati alla senescenza rivela che almeno alcuni fattori sono sovraregolati dopo la senescenza indotta dall'irradiazione gamma nei fibroblasti diploidi umani a basso passaggio a livello di MRNA.

Ciò è ulteriormente confermato dall'ELISA dei surnatanti di coltura cellulare irradiati con raggi gamma. Una volta padroneggiata, l'induzione del danno al DNA e la colorazione con SA beta-gal possono essere completate in circa 30 minuti di tempo pratico. I terreni di condizione per quantificare i livelli di proteina SASP possono essere preparati in circa 30 minuti.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di monitorare i cambiamenti morfologici nelle colture cellulari prima di procedere alla quantificazione del marcatore senescente. Dopo il suo sviluppo, queste tecniche hanno aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'invecchiamento e del cancro per esplorare la senescenza in una varietà di tessuti, colture cellulari e organismi modello. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come indurre, monitorare e quantificare la senescenza cellulare.