Radice dorsale Ganglion iniezione e dorsale radice Lesioni Crush come un modello per sensoriale Axon Regeneration

L'obiettivo di questo approccio chirurgico è quello di applicare direttamente i trattamenti a livello del corpo cellulare neuronale e valutare la rigenerazione degli assoni dopo l'intervento terapeutico, senza dover eseguire una lesione più dannosa all'interno del sistema nervoso centrale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della rigenerazione degli assoni, come ad esempio: gli assoni trattati terapeuticamente possono rigenerarsi nel midollo spinale e possibilmente raggiungere gli obiettivi del tronco encefalico? Il vantaggio principale di questa tecnica è che i ricercatori possono esaminare la rigenerazione degli assoni del SNC senza dover danneggiare direttamente il midollo spinale.

Ciò riduce le complicanze post-chirurgiche e migliora il benessere degli animali. Inizia anestetizzando adeguatamente l'animale. Confermare un piano chirurgico di anestesia mediante l'assenza di una reazione a un pizzicamento del dito del piede.

Quindi pesare l'animale e registrare il peso preoperatorio. Per un'iniezione chirurgica di DRG, radere il pelo del collo tra le orecchie fino a poco sotto gli scapuli. Disinfettare l'area rasata con un prodotto antisettico.

Iniettare due millilitri di soluzione salina per via sottocutanea sul fianco dell'animale, insieme a una dose appropriata di analgesico e antibiotico. Applicare un unguento per gli occhi su entrambi gli occhi per prevenire l'essiccazione corneale durante la procedura. Posiziona l'animale in un telaio stereotassico spinale e posiziona un termoforo a 37 gradi Celsius sotto l'animale.

Inizia l'intervento chirurgico individuando i processi spinosi C2 e T2 prominenti sulla pelle. Quindi utilizzare un bisturi numero 10 per praticare un'incisione cutanea tra i processi spinosi C2 e T2. Una volta aperta la pelle, una linea mediana di tessuto fibroso bianco dovrebbe essere visibile sul primo strato del muscolo, che ha una consistenza gelatinosa.

Fai un'incisione di dimensioni simili sul primo strato di muscolo lungo la linea mediana bianca. Non andare oltre il primo processo spinoso T2 prominente, poiché c'è un vaso sanguigno principale situato nelle vicinanze. Ritrarre il primo strato di muscolo utilizzando due divaricatori, uno posizionato rostralmente e uno caudalmente.

Il secondo strato di muscolo con un aspetto striato dovrebbe ora essere visibile. Individua la linea mediana del secondo strato muscolare, dove si possono osservare due muscoli longitudinali, collegati da un sottile tessuto membranoso. Quindi usa un paio di micro forbici per sezionare il tessuto membranoso e separare i due muscoli longitudinali.

Regolare i divaricatori per esporre il terzo strato di muscolo sottile che copre la colonna vertebrale. I processi spinosi possono essere avvertiti toccando leggermente con un paio di pinze sopra il terzo strato del muscolo. Usa le micro forbici per fare una piccola incisione sul terzo strato del muscolo e raschia delicatamente il muscolo dall'osso, usando una curette o un bisturi in modo laterale, per esporre chiaramente le vertebre.

Per esporre i DRG da C5 a C8 sinistri, utilizzare un paio di cesoie ossee sottili per eseguire l'emi-laminectomia sinistra sulle vertebre da C4 a T1, rimuovendo con cura parte della lamina e del peduncolo. Una volta che una quantità sufficiente di DRG è stata esposta per l'iniezione, preparare la siringa posizionando la siringa da microlitri riempita di virus dotata di un ago smussato calibro 33 su misura sul supporto della siringa stereotassica. Quindi, utilizzare un ago smussato calibro 30 per creare una piccola apertura superficiale su ciascuno dei DRG mirati per facilitare l'inserimento dell'ago per iniezione.

Regolare delicatamente le coordinate stereotassiche per inserire l'ago calibro 33 al centro del DRG. Idealmente, l'ago dovrebbe essere posizionato al centro del DRG per garantire una diffusione uniforme della soluzione dell'iniettore in tutto il DRG. Una volta inserito l'ago, utilizzare la pompa a siringa per infusione per iniettare un microlitro di virus in ciascun DRG.

Durante l'iniezione, il DRG cambierà lentamente colore se la soluzione virale contiene un colorante colorato. Non inserire eccessivamente l'ago, poiché ciò potrebbe causare la fuoriuscita di liquido dal lato ventrale del DRG. In caso di perdite durante l'iniezione, regolare immediatamente la posizione dell'ago.

Tre minuti dopo la fine dell'iniezione, estrarre l'ago per iniezione. Per eseguire una lesione da schiacciamento della radice dorsale da C5 a C8 concomitante, schiacciare ciascuna radice tre volte per 10 secondi, utilizzando un paio di pinze a punta fine. Opporsi completamente alle estremità del forcipe.

Una linea bianca nel tessuto dovrebbe apparire nel sito di schiacciamento. Dopo gli interventi chirurgici, assicurarsi che non rimangano sanguinamenti o piccoli frammenti ossei nel sito dell'incisione prima di chiudere. Se si preferisce, posizionare un piccolo pezzo di spugna chirurgica riassorbibile sopra il midollo spinale esposto e il DRG.

Lascia che il terzo strato del muscolo si ritragga naturalmente sulla colonna vertebrale, senza suturare. Suturare liberamente i due muscoli longitudinali sul secondo strato con materiale di sutura assorbibile 6-0. Sutura il primo strato del muscolo con materiale di sutura assorbibile 6-0.

Sutura la pelle con materiale di sutura riassorbibile 5-0. Se durante l'intervento chirurgico si è verificato un forte sanguinamento, iniettare per via sottocutanea uno o due millilitri di soluzione salina per reintegrare la perdita di liquidi dall'animale, come consentito dalle normative locali. Fornire un gel idratante commestibile e consentire all'animale di riprendersi completamente dall'anestesia.

Monitorare frequentemente l'animale per almeno un'ora prima di tornare nell'area di attesa. Le immagini seguenti mostrano il recupero degli animali post-chirurgici al primo giorno, al settimo giorno, dopo la rimozione della sutura cutanea e al giorno 14. Una settimana prima della raccolta dei tessuti, anestetizzare adeguatamente l'animale come prima, quindi stabilizzare la zampa anteriore sinistra fissando l'arto al tavolo con del nastro adesivo.

Prima dell'iniezione di CTB, utilizzare un ago smussato calibro 30 per praticare una piccola apertura superficiale sulla pelle per facilitare l'inserimento dell'ago per iniezione. Quindi utilizzare una siringa da microlitro dotata di un ago corto calibro 33 su misura, per iniettare lentamente un microlitro di 1% CTB per via sottocutanea al centro del cuscinetto glabro e delle quattro dita. Lasciare che l'animale si riprenda completamente dall'anestesia, prima di tornare nell'area di attesa.

Questa immagine mostra il risultato dell'iniezione di DRG senza lesioni da schiacciamento della radice dorsale. I corpi cellulari e gli assoni positivi alla GFP nel midollo spinale sono chiaramente visibili quattro settimane dopo l'iniezione di AAV5GFP. Questa immagine con ingrandimento maggiore mostra gli assoni nella colonna dorsale e nel corno dorsale.

I corpi cellulari marcati con GFP nel DRG sono visti qui. Questa immagine mostra i terminali assonali positivi al CTB nel nucleo cuneato una settimana dopo l'iniezione del CTB. Le immagini seguenti mostrano i risultati di una lesione completa da schiacciamento della radice dorsale.

Come si vede qui, gli assoni sensoriali assotomizzati marcati con GFP possono rigenerarsi fino alla zona di ingresso della radice dorsale, ma non nel midollo spinale dopo una lesione. Questa è un'immagine del nucleo cuneato nello stesso animale. I terminali assonali positivi CTB sono assenti a seguito di una lesione completa da schiacciamento della radice dorsale.

La presenza di assoni marcati nel midollo spinale dopo una lesione rappresenta una lesione incompleta o una rigenerazione. La presenza di terminali CTB positivi nel nucleo cuneato suggerisce una lesione incompleta, mentre la loro assenza suggerisce una lesione completa e una rigenerazione potenzialmente parziale nel midollo spinale. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante rimuovere la giusta quantità di ossa delle vertebre per esporre il DRG e la radice dorsale, senza indurre danni indesiderati, soprattutto al midollo spinale.

In caso contrario, ciò potrebbe causare complicazioni post-chirurgiche impreviste. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un'iniezione di DRG. È possibile incorporare altre tecniche come la lesione spinale centrale, l'elettrofisiologia, i test comportamentali e l'analisi anatomica per esaminare le rigenerazioni degli assoni.