Name: Singolo Analisi Molecola di laser localizzati psoraleni addotti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Impara l'analisi di singola molecola per studiare i crosslink intercatenari localizzati al laser nel DNA genomico. Questo metodo consente l'imaging diretto delle lesioni e aiuta a comprendere le risposte cellulari al danno del DNA.

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Questa ricerca è stata sostenuta in parte dal programma di ricerca intramurale del NIH, National Institute on Aging (Z01 AG000746-08) e il Fondo di ricerca Anemia di Fanconi.

1. Preparazione di Dig-TMP <ol><li> Mescolare 50 mg (0,18 mmoli) di 4&#39;-clorometil-4,5&#39; , 8-trimethylpsoralen e 590 mg (2,7 mmoli) di 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanedi-ammina in 25 mL asciutto rotondo pallone -bottom sotto azoto. Aggiungere 10 ml di toluene e riflusso per 12 ore. Rimuovere il solvente in un evaporatore rotante sotto pressione ridotta. <ol><li> Purificare il residuo da cromatografia flash su colonna su gel di silice. Eluire la colonna con cloroformio, metanolo, e la soluzione di ammoniaca al 28% (9: 1: 0,5). Evaporare il solvente in un evaporatore rotante sotto pressione ridotta, e recuperare il puro 4 &#39;- [N- (13-ammino-4,7,10-trioxatrideca)] amminometil-4,5&#39;, 8-trimethylpsoralen come giallo paglierino viscoso liquido. </li><li> Mescolare 5,5 mg (0,012 mmoli) di 4 &#39;- [N- (13-ammino-4,7,10-trioxatrideca)] amminometil-4,5&#39;, 8-trimethylpsoralen con 5 mg (0,008 mmoli) di estere NHS in digossigenina asciutto pallone a fondo tondo sotto azoto. Aggiungere 0,5 ml di dimetil formammide anidra (DMF) und 3.4 ml di trimetilammina e agitare a 50 ° C per 18 h. </li><li> Rimuovere il solvente in un evaporatore rotante sotto pressione ridotta. </li><li> Sciogliere il residuo in quantità minima di diclorometano. Applicare la soluzione in 2 punti uL orizzontalmente lungo la parte inferiore di una piastra preparativa su strato sottile di gel di silice come fase stazionaria. Eseguire il TLC preparativa in cloroformio: metanolo: ammoniaca 28% (8: 1: 0,1). </li><li> Mascherare la piastra tranne per i bordi verticali e identificare la banda di prodotto con lunghezza d&#39;onda corta UV 254 nm lampada. Raschiare il prodotto dalla piastra con una spatola e isolare il prodotto puro con cloroformio: metanolo: idrossido di ammonio 28% (8: 1: 0,1) miscela. </li><li> Rimuovere solventi in evaporatore rotante sotto pressione ridotta. Sciogliere il pellet residuo in 1 ml di 50% EtOH: H 2 O, dispensare in aliquote di 50 microlitri in provette da 1,5 mL (~ 20 Aliquote) e secco in un evaporatore centrifugo finché tutto il solvente è evaporato (~ 3 h). </li><li>Riprendere ciascuna aliquota in 200 microlitri di 50% EtOH: H 2 O e asciugare nuovamente in un evaporatore centrifugo. Sciogliere ciascuna aliquota di nuovo in 200 ml di 50% EtOH: H 2 O, secco in un evaporatore e conservare centrifughe pellet a -20 ° C per una conservazione a lungo termine. </li></ol></li><li> Per l&#39;uso, sciogliere il precipitato in 50 ml di 50% EtOH: H 2 O. Preparare una diluizione 1: 100 del disciolto Dig-TMP in H 2 O e misurare OD a 250 nm. Il coefficiente di estinzione di Dig-TMP è 25.000. La soluzione è stabile per circa un mese se conservato a -20 ° C. Verificare la concentrazione misurando OD a 250 nm prima di ogni uso. <ol><li> Calcola concentrazione stock: Abs x 100 x10 6 / 25.000 = concentrazione (in micron). In genere la soluzione di riserva è di circa 3 mm. È importante essere in questo intervallo per ridurre al minimo il volume di EtOH aggiunto al mezzo. </li></ol></li></ol> 2. Laser localizzati Dig-TMP ICL <ol><li> Perform localizzazione laser con un microscopio confocale con un laser ad azoto SRS (337 nm) pompato attraverso una cella colorante che emette una linea di 365 nm e cottura 3 ns impulsi a 10 Hz, con una potenza di 0,7 nW. </li><li> Fare un segno verticale sul lato di un vetro 35 millimetri a fondo piatto di coltura cellulare con un pennarello. Graffiare il cross al centro del vetro sulla superficie cultura con una penna diamante tale che la striscia nera sul lato del piatto è nella parte superiore di un braccio della croce. La croce è segnata sulla superficie di crescita del vetro in modo che le cellule e sarà nello stesso piano focale. </li><li> Sterilizzare la piastra dopo marcatura con un risciacquo di 70% EtOH. Asciutto prima placcatura le cellule. </li><li> cellule piastra (ceppi di laboratorio standard come HeLa o U2OS) nella croce assegnati in piatti di coltura di uno o due giorni prima. Cellulare dovrebbe essere attivamente dividendo e il 50-70% confluenti il ​​giorno dell&#39;esperimento. Incubare 24 h con 1 uM 5-cloro-2-deossiuridina (CldU) per DNA etichetta uniformemente. </li><li> InserisciDig-TMP in 50% EtOH: H 2 O per mezzo di coltura cellulare ad una concentrazione finale di 20 pM. Portare il mezzo a 37 ° C. Cambiare il mezzo sulle cellule e posto in incubatore (37 ° C, 5% CO 2) per 30 min per permettere il Dig-TMP equilibrare. </li><li> Mentre le cellule sono incubando, stabilire le coordinate x / y del campo visivo in cui il laser è attivo. Seguire la procedura di calibrazione del produttore, in cui il laser è diretto dal software per incidere un vetrino a specchio lungo una linea orizzontale e diagonale. Le due linee definiscono i confini del campo in cui il laser può colpire un bersaglio. </li><li> Si pone la placca nella camera ambientale, a 37 ° C con controllata CO 2 ed umidità, sul palco microscopio e mettere a fuoco con l&#39;obiettivo 60X olio sulla intersezione della croce. </li><li> Dirigere il fascio laser 365 nm ad una ROI, stabilita dallo sperimentatore con lo strumento forma nel software, per formare una striscia di 3 &amp;# 181; mx 0,6 micron. Il contorno della ROI viene collocata dal cursore in nuclei delle cellule situate nelle immediate vicinanze dell&#39;intersezione della croce. Regolare il piano focale z per indirizzare la metà laser attraverso il nucleo. Utilizzare un laser nel range di 350-370 nm. 405 nm laser non possono indurre reticolazioni 19. NOTA: Noi individuare il ROI nelle zone nucleoplasmic fuori della nucleoli, che può essere distinto da nucleoplasm in contrasto interferenziale differenziale (DIC) imaging. </li><li> Verificare il focus e l&#39;attività del laser, aumentando l&#39;impostazione di potenza ad un livello sufficiente per cancellare una cella (la cella si scurisce e quindi scompaiono). Questo è un importante diagnostico per un percorso ottico senza ostacoli per il laser attraverso il microscopio e poi attraverso il vetrino e nelle cellule. <ol><li> Abbassare l&#39;impostazione della potenza di appena sufficiente per attivare il psoraleni e l&#39;ICL indotta DDR (questo deve essere determinato empiricamente per ogni laser / microfonoROSCOPE combinazione). Utilizzare un&#39;intensità del laser impostazione (1,7% qui) che non attiva il DDR in assenza di psoralene (monitorato dalla formazione di γ-H2AX). NOTA: Questa è una determinazione importante e le impostazioni possono richiedere una regolazione se la sorgente laser o di un componente nel percorso ottico è cambiato. Seguire l&#39;accumulo di GFP tag proteine ​​di riparazione come XPC o FAN1, entrambi i quali sono rapidamente reclutati (in secondi) alle strisce psoraleni laser, ma non al ROI esposto al solo laser. Alcune proteine ​​del DDR appaiono in pochi secondi, mentre diversi minuti possono essere richiesti per gli altri. E &#39;necessario effettuare determinazioni corso di tempo per ogni proteina di interesse. Si segnala altresì che in cellule che non sono stati esposti al laser non ci sono strisce di proteine ​​rispondere. </li></ol></li><li> Dopo che tutte le celle in un campo sono stati indirizzati spostare la piastra in un campo, rimanendo vicino alla intersezione della croce. </li><li> Negli esperimenti progettati per determine la distribuzione delle distanze tra l&#39;lesione esporre cellule al laser in 20-25 campi (4-5 cellule / campo) intorno all&#39;intersezione. Al fine di analizzare i modelli di replica in prossimità delle ICL localizzate incubare le cellule con 10 micron 5-iodo-2-deossiuridina (IDU) dopo la cottura del laser. NOTA: Il tempo di incubazione con Idu è un po &#39;arbitraria. Abbiamo usato il più corto di 20 minuti e fino a 60 minuti (vedi sotto). impulsi più lunghi (poche ore) spesso sfociano in molteplici tratti di replica coalescenza, perdendo così l&#39;opportunità di immagine il progresso di singole forcelle. In alcuni esperimenti ces sono etichettati con CldU per 24 ore in maniera uniforme DNA etichetta prima dell&#39;esposizione a Dig-TMP seguita da etichettatura impulso di tratti di replica. </li></ol> 3. Raccolta di cellule e di fibre Stretching DNA <ol><li> Rimuovere la piastra dal palco, rimuovere il terreno, e lavare con tampone fosfato (PBS). Rimuovere la soluzione PBS. Mettere una goccia 10 ml di un tripsina commerciale/ EDTA sulla intersezione della croce al centro della superficie del vetro. </li><li> Incubare per 3-4 minuti a temperatura ambiente (RT) e quindi disegnare la soluzione di tripsina con le cellule staccate nella punta della pipetta. Non v&#39;è alcuna necessità di neutralizzare la tripsina. </li><li> Posizionare la goccia di tripsina / EDTA con le cellule ad un&#39;estremità di un silanizzata vetrino per microscopio. Lisare le cellule e rilasciare il DNA mediante aggiunta di 10 ml di soluzione 0,5% SDS e incubare per 3-4 minuti a temperatura ambiente mescolando delicatamente con la punta della pipetta, consentendo la periferia della piscina ad asciugare. </li><li> Inclinare il vetrino 20 ° e consentire al liquido di scorrere fino alla fine. Le fibre di DNA vengono estesi / allungato dalle forze idrodinamiche del liquido che scorre. Lasciare asciugare i vetrini all&#39;aria (~ 10 min) e fissare in 3: 1 metanolo / acido acetico per 10 min. Rimuovere i vetrini dalla soluzione correzione e l&#39;aria secca di nuovo. A questo punto si possono conservare indefinitamente in 70% EtOH a -20 ° C. Rimozione dal EtOH 70% lasciare asciugare all&#39;aria prima della nestep xt. </li><li> Lavare i vetrini in PBS, e quindi denaturate in 2.5 M HCl per 1 ha RT. Questo trattamento depurinates messa nucleobasi alogenati incorporate accessibili agli anticorpi DNA. </li><li> Neutralizzare i vetrini in 0,4 M Tris-HCl, pH 7,4. Lavare due volte in PBS / 0.5% Tween-20 (PBST) per 5 minuti ciascuna. </li><li> Blocco vetrini con 5% di albumina sierica bovina (BSA) e 10% siero di capra in PBS. Coprire i vetrini delicatamente con un parafilm per diffondere la soluzione di saturazione uniformemente sul vetrino e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Pipettare 100 ml di 1: 200 diluizione in soluzione bloccante di ratto anti-bromodeossiuridina (rileva specificamente CldU) anticorpo primario per ogni diapositiva. Coprire i vetrini delicatamente con un parafilm per diffondere la diluizione uniformemente sul vetrino e incubare in una camera umidificata per 1 ha RT. Rimuovere il parafilm e lavare i vetrini tre volte in PBST per 5 minuti ciascuna. </li><li> Pipettare 100 ml di diluito (1: 100) di capra anti-topo Alexa Fluor 647 in soluzione bloccante per ogni diapositiva. coprire ilscivola delicatamente con un parafilm e incubare per 45 minuti a temperatura ambiente. Lavare i vetrini tre volte in PBST per 5 minuti ciascuno. </li><li> Pipettare 100 ml di diluito (01:40) topo anti-bromodeossiuridina (rileva ldu e CldU Questa doppia specificità richiede il blocco CldU dal ratto contro BrdU in incubazione precedente.) Anticorpo primario e coniglio anti-DIG anticorpi (1: 200 ) in soluzione bloccante per ogni diapositiva. Coprire i vetrini delicatamente con un parafilm e incubare in una camera umidificata per 1 ha RT. Lavare i vetrini tre volte in PBST per 5 minuti ciascuno. </li><li> Dispensare 100 ml di diluito (1: 100) capra anti-topo Alexa Fluor 488 ec (1: 5.000) sonda anti-coniglio di capra (ad esempio, Qdot 655) in soluzione bloccante per ogni diapositiva. Coprire i vetrini delicatamente con parafilm e incubare per 45 minuti a temperatura ambiente. Lavare i vetrini tre volte in PBST per 5 minuti ciascuno. </li><li> Drenare eccesso PBST su un tovagliolo di carta. Aggiungere 50 ml di antifade mezzo di montaggio su ciascun vetrino e coprire con un coprioggetto. Immagine o negozio pernon più di 48 ore a -20 ° C. </li></ol> 4. Imaging fibra da microscopia a fluorescenza <ol><li> Eseguire l&#39;acquisizione di immagini attraverso un obiettivo 63X su un microscopio invertito con annessa ruota portafiltri completamente motorizzato con FITC, Cy5 e Q Dot 655 rilevamento. Il filtro di eccitazione è 425 nm, e il filtro di emissione è 655 nm con 20 nm centrata in corrispondenza del picco di emissione 20. </li></ol>

<ol><li>Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Intrinsic+Fragility+of+DNA+%28Nobel+Lecture%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">The Intrinsic Fragility of DNA (Nobel Lecture).</a> Angew. Chem. Int. Ed Engl. 55 (30), 8528-8534 (2016).</li>
<li>Sirbu, B. M., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response%3A+three+levels+of+DNA+repair+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Perspect.+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA damage response: three levels of DNA repair regulation.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a01272(2013).</li>
<li>Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+protein+dynamics+and+DNA+repair+following+generation+of+DNA+double-strand+breaks+at+defined+genomic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites.</a> Nat. Protoc. 3 (5), 915-922 (2008).</li>
<li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li>
<li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+analysis+of+repair+processes+for+oxidative+DNA+damage+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13738-13743 (2004).</li>
<li>Reynolds, P., Botchway, S. W., Parker, A. W., O'Neill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+dynamics+of+DNA+repair+proteins+following+laser+microbeam+induced+DNA+damage+-+when+is+a+DSB+not+a+DSB%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal dynamics of DNA repair proteins following laser microbeam induced DNA damage - when is a DSB not a DSB?</a> Mutat. Res. 756, 14-20 (2013).</li>
<li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+DNA+double-strand+breaks%3A+production%2C+fidelity+of+repair%2C+and+induction+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12871-12876 (2003).</li>
<li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+dose-rate+effects%2C+endogenous+DNA+damage%2C+and+signaling+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Radiation dose-rate effects, endogenous DNA damage, and signaling resonance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17874-17879 (2006).</li>
<li>Aguilera, A., Garcia-Muse, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+of+genome+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Causes of genome instability.</a> Annu. Rev. Genet. 47, 1-32 (2013).</li>
<li>Swenberg, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+versus+exogenous+DNA+adducts%3A+their+role+in+carcinogenesis%2C+epidemiology%2C+and+risk+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Endogenous versus exogenous DNA adducts: their role in carcinogenesis, epidemiology, and risk assessment.</a> Toxicol. Sci. 120 (1), S130-S145 (2011).</li>
<li>Eichman, B. F., Mooers, B. H., Alberti, M., Hearst, J. E., Ho, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structures+of+psoralen+cross-linked+DNAs%3A+drug-dependent+formation+of+holliday+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The crystal structures of psoralen cross-linked DNAs: drug-dependent formation of holliday junctions.</a> J. Mol. Biol. 308, 15-26 (2001).</li>
<li>Lai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+DNA+interstrand+cross-links+and+monoadducts+formed+in+human+cells+induced+by+psoralens+and+UVA+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of DNA interstrand cross-links and monoadducts formed in human cells induced by psoralens and UVA irradiation.</a> Anal. Chem. 80, 8790-8798 (2008).</li>
<li>Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psoralen+conjugates+for+visualization+of+genomic+interstrand+cross-links+localized+by+laser+photoactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation.</a> Bioconjug. Chem. 18, 431-437 (2007).</li>
<li>Muniandy, P. A., Thapa, D., Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+laser-localized+DNA+interstrand+cross-links+in+G1+phase+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Repair of laser-localized DNA interstrand cross-links in G1 phase mammalian cells.</a> J Biol. Chem. 284 (41), 27908-27917 (2009).</li>
<li>Nowsheen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+oxidatively+induced+clustered+DNA+lesions+in+human+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Accumulation of oxidatively induced clustered DNA lesions in human tumor tissues.</a> Mutat. Res. 674, 131-136 (2009).</li>
<li>Meyer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustered+DNA+damage+induces+pan-nuclear+H2AX+phosphorylation+mediated+by+ATM+and+DNA-PK%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK.</a> Nucl Acids Res. 41, 6109-6118 (2013).</li>
<li>Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+DNA+replication+in+the+vertebrate+model+system+DT40+using+the+DNA+fiber+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique.</a> J Vis. Exp. (56), e3255(2011).</li>
<li>Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaborative+dynamic+DNA+scanning+by+nucleotide+excision+repair+proteins+investigated+by+single-+molecule+imaging+of+quantum-dot-labeled+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single- molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins.</a> Mol. Cell. 37 (5), 702-713 (2010).</li>
<li>Spielmann, H. P., Sastry, S. S., Hearst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+large-scale+synthesis+of+psoralen+furan-side+monoadducts+and+diadducts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Methods for the large-scale synthesis of psoralen furan-side monoadducts and diadducts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (10), 4514-4518 (1992).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+translocase+FANCM%2FMHF+promotes+replication+traverse+of+DNA+interstrand+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks.</a> Mol. Cell. 52, 434-446 (2013).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Analysis+of+Laser+Localized+Interstrand+Crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Analysis of Laser Localized Interstrand Crosslinks.</a> Front Genet. 7, 84(2016).</li>
<li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+damage+response%3A+making+it+safe+to+play+with+knives%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA damage response: making it safe to play with knives.</a> Mol. Cell. 40, 179-204 (2010).</li>
<li>Mori, T., Matsunaga, T., Hirose, T., Nikaido, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+monoclonal+antibody+recognizing+ultraviolet+light-induced+%286-4%29+photoproducts%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Establishment of a monoclonal antibody recognizing ultraviolet light-induced (6-4) photoproducts.</a> Mutat. Res. 194, 263-270 (1988).</li>
<li>Poirier, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisera+specific+for+carcinogen-DNA+adducts+and+carcinogen-modified+DNA%3A+applications+for+detection+of+xenobiotics+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Antisera specific for carcinogen-DNA adducts and carcinogen-modified DNA: applications for detection of xenobiotics in biological samples.</a> Mutat. Res. 288, 31-38 (1993).</li>
<li>Henderson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+G-quadruplex+DNA+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of G-quadruplex DNA in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 42, 860-869 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La tecnologia di localizzazione laser richiede l&#39;uso di cellule aderenti con nuclei che sono visibili in microscopia in campo chiaro. Abbiamo cercato di attaccare le cellule non aderenti, quali linfociti primari o cellule coltivate debolmente aderenti come AD293, alla superficie di vetro con preparazioni adesive cella come polilisina o collagene, o miscele più complesse. Anche se questi trattamenti possono legarsi alle cellule di superficie, troviamo che essi rimangono generalmente arrotondata che rende molto diffic...

DNA è sotto costante aggressione dagli agenti esogeni come radiazione, luce ultravioletta, tossine ambientali, prodotti di combustione, ecc Inoltre, è attaccato anche da specie radicaliche endogene prodotte dal metabolismo ossidativo. Tutti questi hanno il potenziale di distruggere chimicamente o fisicamente l&#39;integrità del DNA 1. Perturbazioni nel genoma possono attivare la risposta al danno del DNA (DDR), un reclutamento e post traslazionale modifica a cascata con centinaia, se non migliaia, di proteine ​​e microRNA coinvolti nella riparazione della lesione, regolazione del ciclo cellulare, apoptosi, senescenza e vie infiammatorie 2. La maggior parte delle nostre informazioni sulla DDR viene da studi con DSB. Ciò è in gran parte a causa della disponibilità di tecnologie per introdurre le pause, comprese le pause sequenza specifica, nel DNA genomico nelle cellule viventi 3. Inoltre, il propensity di pause per indurre foci di proteine ​​DDR, che possono essere visualizzati mediante immunofluorescenza, è stato molto utile per identificare la cinetica ei requisiti di proteine ​​rispondere. Una delle tecnologie chiave per lo studio della DDR è stato introdotto da Bonner e colleghi, che ha usato un raggio laser per dirigere una striscia di DSB in una &quot;regione di interesse&quot; (ROI) nei nuclei delle cellule viventi 4. In effetti, hanno creato un lungo fuoco in cui le proteine ​​del DDR potevano essere identificati mediante immunofluorescenza. Ciò è stato illustrato dalla loro dimostrazione della forte banda di fosforilata H2AX istone (γ-H2AX) nelle cellule esposte laser. Da allora, l&#39;approccio laser è stata impiegata in numerosi studi della DDR indotti da DSBs. Anche se potente e popolare, e la fonte di immagini di immunofluorescenza drammatiche, va notato che nella maggior parte degli esperimenti l&#39;intensità del laser viene regolata in modo da produrre risultati osservabili, senza preoccupazione per l&#39;identità della lesione,densità, o spaziatura. In effetti, può essere difficile fare queste stime. Così essi sono in gran parte ignorati, nonostante la molteplicità delle lesioni introdotte nel DNA da laser 5. Ciò contribuisce a molte contraddizioni nella letteratura 6. In contrasto DSB, la maggior parte delle modificazioni chimiche del DNA non stimolano la formazione di foci discreta di proteine ​​DDR. Questo è importante alla luce della nostra attuale comprensione delle frequenze lesione. È stato stimato che le cellule umane in coltura incorrere ben 50 DSBs per ciclo cellulare, formati principalmente durante la fase S 7, 8, 9. Meno sono formate in cellule non proliferanti. Ciò contrasta con il numero di perdite nucleobase o eventi di modifica, che sono nell&#39;ordine delle decine di migliaia per cellula / giorno 1, 10. Così, sappiamo di più diDDR indotta da eventi che sono relativamente rare, e molto meno di quelli indotti dalla elica distorsione lesioni, che complessivamente sono molto più comuni. Per affrontare domande circa la risposta cellulare al modificazioni covalenti di DNA genomico, abbiamo voluto lavorare con un&#39;elica distorcere addotto del DNA che ha avuto l&#39;attività DDR induzione intrinseca. Inoltre, per facilitare la progettazione sperimentale e interpretazione che sono interessati una struttura la cui introduzione potrebbe essere controllato rispetto al tempo ed era suscettibile di visualizzazione. Di conseguenza, abbiamo sviluppato una strategia basata su psoraleni. Psoraleni sono ben caratterizzati intercalanti del DNA fotoattivi favorendo 5&#39; TA: AT siti. A differenza di altri agenti reticolanti quali mostarde azotate e mitomicina C (MMC) non sono DNA reattivi meno esposta a onde lunghe luce UV (UVA). Le molecole intercalate reagiscono con basi timina su filamenti opposti per produrre elica distorsione reticolazioni interstrand (ICL) 11. Con la psoralen trimetil utilizzato nei nostri esperimenti maggior parte dei prodotti sono ICL, relativamente pochi monoadducts vengono generati (meno del 10%), 12 e reticola intraelicoidali tra basi adiacenti su un filo non si formano. Perché sono potenti blocchi di replicazione e la trascrizione, psoraleni e altri agenti di reticolazione, come cis-platino e MMC, sono comunemente utilizzati in chemioterapia. Così psoralen abilitato studi che hanno seguito l&#39;attivazione del DDR da una struttura distorsione elica, e anche fornito informazioni sulla risposta cellulare ad un composto con importanza clinica. Abbiamo sintetizzato un reagente in cui trimetil psoraleni era legato alla digossigenina (DIG), uno steroli vegetali non trovato nelle cellule di mammifero e spesso usato come immunotag. Il requisito di fotoattivazione consente localizzazione dalla luce laser (365 nm) di ICLs psoraleni in ROI definita nei nuclei nelle cellule viventi. Questi possono essere visualizzati immunofluorescence contro il tag Dig. La riparazione del DNA e le proteine DDR apparsi nelle strisce di laser localizzati ICL 13, 14. DDR attivato dalle intensità laser elevate utilizzate per produrre DSB potrebbe essere causa di danni isolati o cluster 15, 16. Di conseguenza, la pertinenza dei risultati di questi esperimenti presenti in natura, lesioni presenti a concentrazioni molto più basse, è incerto. Per far fronte a domande simili sulla frequenza addotto psoraleni e spaziatura in DNA, abbiamo approfittato della tecnologia in fibra DNA 17 e puntini immunoquantum. punti quantici sono molto maggiori coloranti fluorescenti e non sono sbiancati dall&#39;esposizione alla luce. Così essi sono spesso utilizzati per l&#39;imaging singola molecola 18, un&#39;applicazione per cui coloranti fluorescenti sono sufficientemente brillante. fibre di DNA individuali possono essere allungati su gscivoli lass e possono essere visualizzati mediante immunofluorescenza contro analoghi nucleosidici incorporati durante l&#39;incubazione prima alla cella raccolto. Abbiamo trattato cellule con Dig-psoralene e esposti ROI fino micro laser irradiazione. Fibre sono state preparate dalle cellule e singoli addotti Dig-psoralene potrebbe essere visualizzato con i puntini immunoquantum. Esponendo le cellule ad analoghi nucleosidici per tempi relativamente brevi (20-60 min) permette la visualizzazione dei tratti di replica in prossimità del laser localizzato ICL.

<table><tbody><tr><td>Digoxigenina NHS estere</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11333054001</td><td></td></tr><tr><td>Cloro-psoralene</td><td>Berry and Associates</td><td>PS 5000</td><td></td></tr><tr><td>diaminoglicole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>369519</td><td>4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiammina</td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Acros Organics</td><td>423550040</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4524</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di ammonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5002</td><td></td></tr><tr><td>TLC piastre</td><td>Analtech, Inc.</td><td>P02511</td><td></td></tr><tr><td>Colonna in vetro Flass 24/40, 100 mL</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CG-1196-02</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale a disco rotante Nikon T2000_E2, dotato di tavolino automatizzato e camera di controllo ambientale e portapiastra</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>con software Volocity</td></tr><tr><td>Micropoint Galvo&nbsp;</td><td>Andor Technologies</td><td></td><td>con un laser pulsato all'azoto&nbsp;</td></tr><tr><td>cella di colorante</td><td>Andor Technologies</td><td>MP-2250-2-365</td><td></td></tr><tr><td>365 colorante</td><td>Andor Technologies</td><td>MP-27-365-DYE</td><td></td></tr><tr><td>IdU&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17125</td><td></td></tr><tr><td>Lastre botomm in vetro da 35 mm 1,5 vetrino, diametro vetro 10 mm, vetrini per</td> microscopio <td>Matek</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td>non rivestiti</tr><tr><td>New</td><td>Comer Supply</td><td>Part # 5070</td><td>Nuovi vetrini silani</td></tr><tr><td>Anticorpo anticorpo BrdU del topo (IdU)</td><td>BD Biosciences</td><td>347580</td><td>1 su 40</td></tr><tr><td>Anticorpo anti BrdU per ratto (CldU)</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>1 su 200& nbsp;</td></tr><tr><td>Coniglio anti Dig anticorpo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>710019</td><td>1 su 200</td></tr><tr><td>Q-dot 655 capra anti Coniglio IgG</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q-11421MP</td><td>1 su 5.000</td></tr><tr><td>AF647- capra anti Rat IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>112-605-167</td><td>1 su 100</td></tr><tr><td>AF488-capra anti topo IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-545-166</td><td>1 su 100</td></tr><tr><td>Zeiss epifluorescente microscopio A200</td><td>Zeiss</td><td></td><td> con software Axiovision</td></tr><tr><td>Filtro Q-dot 655</td><td>Chroma</td><td>39107</td><td></td></tr></tbody></table>

singolo analisi molecola di laser localizzati psoraleni addotti

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

La risposta al danno del DNA (DDR) è stato ampiamente caratterizzato in studi di rotture dei filamenti doppi (DSB) indotta dal laser micro irradiazione con fascio di cellule vive. DDR a Helix distorsione modificazioni covalenti DNA, tra interstrand legami crociati DNA (ICL), non è così ben definita. Abbiamo studiato la DDR stimolato da ICL, localizzato dalla fotoattivazione laser di psoraleni immunotagged, nei nuclei delle cellule vive. Per affrontare domande fondamentali sulla distribuzione addotto e incontri replica forcella, abbiamo combinato localizzazione laser con altre due tecnologie. fibre di DNA sono spesso utilizzati per visualizzare l&#39;avanzamento delle forche di replicazione mediante immunofluorescenza di analoghi nucleosidici, incorporati durante impulsi brevi. puntini Immunoquantum sono stati ampiamente utilizzati per l&#39;imaging singola molecola. Nel nuovo approccio, fibre di DNA da cellule portatrici laser localizzato ICLs sono distribuite su vetrini da microscopio. Le targhette ICL vengono visualizzati con punti immunoquantum e the distanze tra le lesioni determinate. collisioni replica forcella con ICL possono essere visualizzati e diversi modelli incontro identificate e quantificate.

Localizzate Dig-TMP (Figura 1A) ICLs laser possono essere visualizzati mediante immunofluorescenza contro la Dig-tag collegato al psoraleni. Anche se il laser può essere diretto a colpire in un&#39;area di qualsiasi contorno, le strisce non sono forme &quot;naturali&quot; nelle cellule, e segnali legittimi possono essere facilmente distinguibili da artefatti dovuti al legame non specifico degli anticorpi primari o secondari. Questa funzione è utile quando si utilizzano g...

I laser sono spesso utilizzati in studi di risposta cellulare al danno del DNA. Tuttavia, essi generano lesioni la cui spaziatura, frequenza, e collisioni con forcine di replicazione sono raramente caratterizzati. Qui, descriviamo un approccio che consente la determinazione di questi parametri con laser localizzato legami crociati interstrand.

Singolo Analisi Molecola di laser localizzati psoraleni addotti

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire un'analisi a livello di singola molecola della distribuzione di legami crociati intercatena localizzati mediante laser nel DNA genomico, al fine di studiare le risposte cellulari ai legami intercatena nel DNA. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della riparazione del DNA, relative alla distribuzione delle lesioni del DNA indotte dalla tecnologia laser, uno strumento sperimentale ampiamente utilizzato. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente l'imaging diretto delle lesioni del DNA indotte dal composto attivato dal laser nel DNA genomico.Questo non era possibile in precedenza. La procedura sarà dimostrata da Julia Gichimu e Hima Gali del nostro laboratorio. Ogni volta che si utilizza il laser di puntamento, è importante eseguire una calibrazione con la lamella specchio per verificare che il laser colpisca le coordinate XYZ appropriate e per definire l'area del campo catturata dalla telecamera in cui il laser può essere impostato per colpire.Trova un'area sul vetrino che è stata precedentemente incisa. Imposta il tempo di esposizione e la potenza del laser. Quindi regola il fuoco per spostarsi in un'area vicina non bersaglio sul vetrino a specchio.Avviare la procedura di calibrazione. Il software attiverà il laser per incidere la lametta specchio lungo una linea orizzontale e una diagonale. Queste linee definiscono i limiti del campo in cui il laser può colpire una cellula bersaglio.Impostare diverse regioni di interesse, o ROI, all'interno del campo e attivare il laser per verificare che colpisca le aree selezionate e quindi le coordinate XYZ appropriate. Deve inoltre essere eseguita una calibrazione biologica durante la configurazione del sistema laser per il puntamento del microscopio. Il primo passaggio consiste nel definire la potenza minima del laser necessaria per fotoattivare il trimetilpsoralene, o TMP, indurre legami incrociati tra le due eliche e provocare il reclutamento di un fattore di riparazione marcato con GFP, le cui cinetiche possono essere state precedentemente caratterizzate.In questo laboratorio viene utilizzata una linea cellulare U2OS stabilmente transfettata con un plasmide che esprime GFP fan one. Come mostrato qui, quando le cellule sono esposte a sei micromolar di TMP e al 1,2% di laser per 10 minuti, la visualizzazione della sequenza di immagini come video conferma il reclutamento di GFP fan one nella regione di interesse (ROI) target. Il secondo passaggio consiste nel verificare che questa impostazione di potenza non induca il reclutamento in assenza del composto.Come mostrato qui, quando le cellule sono esposte al solo laser all'1,2% per 10 minuti e l'immagine viene visualizzata come video, non si osserva il reclutamento di GFP fan one nell'area di interesse (ROI) bersaglio. In terzo luogo, è importante definire la potenza minima in grado di distruggere una cellula. La capacità di distruggere una cellula a questo livello di potenza dovrebbe essere testata come calibrazione biologica di routine ogni giorno in cui si utilizza il laser di puntamento.Impostare l'area di interesse all'interno del nucleo evitando i nucleoli. Regolare la messa a fuoco. Impostare la potenza del laser al 12% e attivare.Infine, è essenziale impostare il piano focale al centro della cellula per ottenere un targeting corretto. Per dimostrare questo, tre cellule vengono bersagliate a tre diversi piani focali. Centro della cellula.Troppo alto. E troppo basso. Tre minuti dopo il posizionamento, viene generata una serie di immagini che coprono un intervallo di tre micron per esaminare la distribuzione del ventaglio GFP in una singola striscia lungo il piano focale acquisito.Solo la cellula bersaglio al centro della cellula mostra un ventaglio di GFP con una striscia in tutti i piani Z. Prima di eseguire la localizzazione laser, preparare una piastra per colture cellulari con fondo in vetro da 35 millimetri per la crescita delle cellule. Con un pennarello indelebile, fare un segno verticale sul lato di ogni piastra.Utilizzare una penna a punta di diamante per tracciare una croce al centro del vetro sulla superficie di coltura, in modo che la striscia nera sul lato della piastra si trovi in alto rispetto a uno dei bracci della croce. La croce viene segnata sulla superficie di crescita del vetro in modo che essa e le cellule si trovino nello stesso piano focale. Seminare le cellule su piastre di coltura sterili con la croce precedentemente segnata e incubare per 24 ore in presenza di un micromolare di cinque cloro deossiuridina per etichettare in modo uniforme il DNA.Nel giorno dell'esperimento, aggiungere il TMP legato alla digossigenina o il dig TMP in etanolo al 50% al mezzo di coltura cellulare per ottenere una concentrazione finale di 20 micromolare. Portare il mezzo a 37 gradi Celsius. Sostituire il mezzo nei piatti di coltura con mezzo contenente dig TMP e incubare a 37 gradi Celsius e 5% CO2 per 30 minuti, in modo da permettere al dig TMP di raggiungere l'equilibrio.Mentre le cellule sono in incubazione, eseguire la calibrazione del vetrino specchio e il 12% di fuoriuscita delle cellule come dimostrato in precedenza. Posizionare la piastra nella camera ambientale a 37 gradi Celsius con CO2 e umidità controllati sul palchetto del microscopio. Mettere a fuoco con l'obiettivo a immersione in olio 60X sull'incrocio della croce.Selezionare il primo campo da analizzare e utilizzare lo strumento di selezione per definire le aree di interesse (ROI) nelle singole cellule situate nelle immediate vicinanze dell'incrocio della croce. Selezionare aree del nucleoplasma esterne ai nucleoli. Regolare il piano focale Z in modo da indirizzare il laser a metà del nucleo.Impostare successivamente la potenza al minimo necessario per attivare la psoralene nella risposta al danno del DNA indotto da legami crociati intercatena. Qui si utilizza l'1,2%. Attivare il laser.Dopo aver preso di mira tutte le cellule in un campo, spostare la piastra su un nuovo campo, rimanendo vicino all'intersezione della croce. Ripetere la procedura appena illustrata in 12-18 campi per prendere di mira un totale di 80-100 cellule. Per raccogliere le cellule, rimuovere la piastra di coltura dal palco.Rimuovere il mezzo e lavare le cellule con soluzione PBS. Rimuovere il PBS e posizionare una goccia di 10 microlitri di una soluzione commerciale di tripsina EDTA sull'incrocio della croce al centro della superficie di vetro. Incubare per tre o quattro minuti a temperatura ambiente, quindi aspirare la soluzione di tripsina con le cellule staccate in una punta di pipetta.Posizionare la goccia di tripsina EDTA con le cellule a un'estremità di un vetrino microscopico silanizzato. Per lisare le cellule e rilasciare il DNA, aggiungere 10 microlitri di soluzione di SDS al 5% e incubare per tre o quattro minuti a temperatura ambiente, mescolando delicatamente con la punta della pipetta, permettendo al bordo della goccia di asciugarsi. Inclinare il vetrino di 20 gradi e lasciare scorrere il liquido verso l'estremità.Le forze idrodinamiche del liquido in movimento estenderanno e allungheranno le fibre di DNA. Lasciare asciugare l'oggetto all'aria per 10 minuti. Immergere l'oggetto in una soluzione di metanolo e acido acetico in rapporto tre a uno e fissare per 10 minuti.Quindi rimuovere il vetrino dalla soluzione fissante e farlo asciugare all'aria nuovamente. A questo punto, il vetrino può essere conservato indefinitamente in etanolo al 70% a 20 gradi Celsius. Per processare il vetrino al fine di rilevare i segnali dig sulle fibre di DNA mediante microscopia a fluorescenza, rimuovere il vetrino con il DNA allungato dalla soluzione di etanolo al 70% e lasciarlo asciugare all'aria.Successivamente denaturare le fibre di DNA in acido cloridrico e quindi trasferirle in un contenitore di tris cloridrico a pH otto per la neutralizzazione. Lavare poi i campioni in PBS. E infine, colorarli con gli anticorpi appropriati seguendo una procedura pubblicata in precedenza.Viene mostrata la struttura del trimetilpsoralene con un marcatore di dioxigenina. I legami crociati intercatena del DNA, o ICL, possono essere visualizzati mediante immunofluorescenza contro dig TMP. Questo esempio mostra cellule con un accumulo di un noto marcatore della risposta al danno del DNA, gamma H2AX, visualizzato in verde, in aree di interesse (ROI) contenenti ICL localizzati con laser, visualizzati in rosso.Il nucleo colorato con DAPI è in blu. Il campo chiaro mostra una cellula parzialmente posizionata sul segno lasciato dalla penna al diamante. Si noti che le aree di interesse (ROI) sono posizionate al di fuori dei nucleoli.Per determinare la frequenza e il distanziamento degli addotti, le cellule sono state incubate per 24 ore in cinque clorodeossiuridina prima dell'introduzione dei legami crociati intercatena (ICL). Dopo la raccolta delle cellule e lo stendimento delle fibre di DNA, i segnali dig sono stati rilevati mediante punti quantici amminici, visualizzati in rosso nella cinque clorodeossiuridina, e mediante fluorescenza amminica, visualizzata in verde. L'analisi dei segnali dig sulle fibre rivela che le distanze inter-ICL variano da meno di 10 KB a oltre 160 KB. Non è stata osservata alcuna evidenza di addotti raggruppati.Seguendo queste linee guida, dovrebbe essere possibile estendere questo approccio ad altri addotti del DNA, come le lesioni ossidative che possono essere localizzate mediante laser di lunghezza d'onda appropriata.

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Questo video mostra la risonanza plasmonica di superficie localizzata per rilevare le secrezioni proteiche da una singola cellula. Utilizzando una configurazione microfluidica e un chip di nanostruttura plasmonica legata a peptidi, i cambiamenti nell'intensità della luce riflessa all'angolo di risonanza rivelano interazioni con le proteine secrete da una singola cellula.

Risonanza plasmonica di superficie localizzata per rilevare le secrezioni proteiche da una singola cellula

Riportiamo un processo di alterazione in situ di HF trattata Si (001) superficie in uno stato idrofilo o idrofobo irradiando campioni in camere microfluidica riempiti con H 2 O 2 / H 2 O soluzione (0,01% -0,5%) o soluzioni di metanolo per mezzo del laser pulsato UV di un parente a bassa fluenza impulso.

Area selettiva Modifica della Silicon bagnabilità della superficie da impulsi laser UV irradiazione in ambiente liquido

L'imaging spettroscopico elettronico può visualizzare e distinguere l'acido nucleico dalle proteine con una risoluzione nanometrica. Può essere combinato con il sistema miniSOG, che è in grado di marcare in modo specifico le proteine marcate in campioni di microscopia elettronica a trasmissione. Illustriamo l'uso di queste tecnologie utilizzando come esempio i fuochi di riparazione della rottura a doppio filamento.

Visualizzazione di miniSOG Tagged proteine ​​di riparazione del DNA, in combinazione con Electron spettroscopica Imaging (ESI)

L'obiettivo del presente protocollo è quello di descrivere come utilizzare laser microirradiation per indurre diversi tipi di danno del DNA, compreso le rotture del filo relativamente semplici e danno complesso, per studiare assieme di fattore DNA danni segnalazione e riparazione presso siti di danno in vivo .

Laser Microirradiation per lo Studio In Vivo delle risposte cellulari al danno al DNA semplici e complesse

Fluorescenza confocale microscopia e laser micro-irradiazione offrire strumenti per indurre il danno del DNA e monitoraggio della risposta delle proteine di riparazione del DNA in determinate aree sub-nucleare. Questa tecnica ha avanzato significativamente la nostra conoscenza di rilevamento dei danni, di segnalazione e di reclutamento. Questo manoscritto viene illustrato queste tecnologie per esaminare riparazione singola e doppia uscita.

Applicazione di Micro-irradiazione del Laser per l'esame di Single e Double Strand Break Repair in cellule di mammifero

Studiare la cinetica di riparazione danni del DNA richiede un sistema di indurre lesioni alle regioni definite sub-nucleare. Descriviamo un metodo per creare interruzioni di double-stranded localizzate utilizzando un microscopio confocale a scansione laser, dotato di un laser di 405 nm e forniscono procedure automatizzate per quantificare la dinamica di fattori di riparazione a queste lesioni.

Indagine di assunzione di proteine per lesioni del DNA utilizzando 405 Nm Laser Micro-irradiazione

Qui, presentiamo un protocollo per valutare l'omogeneità d'etichettatura per ogni specie di proteine in un campione di proteina complessa a livello di singola molecola.

Quantificazione di tutto il proteoma di etichettatura omogeneità a livello di singola molecola

Descriviamo qui metodi per la quantificazione sensibile e accurata delle lesioni 8-oxo-7, 8-diidro-2'-deossiguanosina (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-deossiadenosina (1,n6-dAdo) e 1,n2- etheno-2a '-deossiguanosina (1,N2-DGUO) nel DNA. I metodi sono stati applicati alla valutazione degli effetti del particolato fine ambientale (PM2,5) nei tessuti (polmone, fegato e rene) dei topi a/J esposti.

Quantificazione di tre lesioni del DNA mediante spettrometria di massa e valutazione dei loro livelli nei tessuti di topi esposti a particolato fine ambientale

Questo protocollo presenta un metodo per utilizzare la dosimetria radicale in linea e una sorgente di luce plasmatica per eseguire l'impronta proteica di ossidazione flash. Questo metodo sostituisce il pericoloso laser UV per semplificare e migliorare la riproducibilità dell'ossidazione fotochimica veloce degli studi sulle proteine.

Impronta proteica radicale idrossile senza laser per eseguire analisi strutturali di ordine superiore delle proteine

Questo protocollo descrive un metodo non invasivo per identificare in modo efficiente le cellule in fase S per studi di microscopia a valle, come la misurazione del reclutamento di proteine di riparazione del DNA mediante microirraggiamento laser.

Microirraggiamento laser per studiare il reclutamento del DNA durante la fase S

Un robusto protocollo è presentato qui per isolare i granuli di neuromelanina dal tessuto umano post-mortem substantia nigra pars compacta tramite microdissezione laser. Questo protocollo rivisto e ottimizzato riduce drasticamente il tempo necessario per la raccolta dei campioni, riduce la quantità di campione richiesta e migliora l'identificazione e la quantificazione delle proteine mediante analisi LC-MS/MS.

Protocollo basato sulla microdissezione laser per l'analisi LC-MS/MS del profilo proteomico dei granuli di neuromelanina

Impara l'analisi di singola molecola per studiare i crosslink intercatenari localizzati al laser nel DNA genomico. Questo metodo consente l'imaging diretto delle lesioni e aiuta a comprendere le risposte cellulari al danno del DNA.

Singolo Analisi Molecola di laser localizzati psoraleni addotti

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