Name: Piccolo RNA trasfezione in cellule primarie Th17 Human Next Generation elettroporazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Scopri l'elettroporazione di nuova generazione per trasfettare cellule T primarie umane con piccoli RNA. Questo metodo efficiente permette di studiare la differenziazione Th17 e la funzione immunitaria in immunologia.

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Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni del National Institutes of Health degli Stati Uniti (R01HL109102, P01HL107202, U19CA179512, F31HL131361), da un premio della Leukemia & Lymphoma Society (K.M.A.) e dal National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Medical Scientist Training Program (Grant #T32GM007618) (M.M.).

Questo protocollo aderisce alle linee guida del UCSF per l&#39;etica della ricerca umana. 1. Preparazione di T coltura cellulare, Isolamento di cellule T CD4 + e Th17 polarizzazione <ol><li> Al giorno 0, cappotto 6 pozzetti di coltura tissutale con 1,5 ml per pozzetto di anti-umana CD3 (2 ug / mL) e CD28 anti-umano (4 ug / ml) in PBS con calcio e magnesio per almeno 2 ore a 37 ° C. <ol><li> In alternativa, ricoprire le piastre per una notte a 4 ° C. Avvolgere le piastre in parafilm. </li></ol></li><li> Preparare le cellule mononucleate del sangue del cordone (CBMCs) di densità centrifugazione in gradiente le istruzioni del produttore. ATTENZIONE: Lavorare con cura e garantire la corretta dispositivi di protezione individuale (DPI) è indossare durante la manipolazione del sangue umano per evitare ogni rischio di esposizione ad agenti patogeni. </li><li> Una volta che le cellule mononucleate sono state isolate e lavati, eseguire isolamento delle cellule T CD4 + umano sele negativoction utilizzando un kit commerciale di cellule T CD4 + umana. NOTA: Se c&#39;è contaminazione globuli rossi dopo l&#39;isolamento di cellule mononucleate, una lisi dei globuli rossi opzionale può essere eseguita prima delle fasi di isolamento delle cellule T CD4 +. Risospendere le cellule mononucleari in 1 ml di tampone di isolamento (2% FBS in PBS). Aggiungere 5 ml di soluzione di lisi 1x. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere quindi 5 ml di tampone di isolamento e centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C per sedimentare le cellule. <ol><li> Risospendere le cellule mononucleari ad una densità di 50 x 10 6 per 500 microlitri nel buffer isolamento in una nuova provetta 5 ml. </li><li> Aggiungere 100 ml di FBS e 100 microlitri della miscela di anticorpi per provetta poi incubare ciascun tubo a 4 ° C per 20 minuti in un agitatore orbitale per mescolare bene. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, aggiungere 3-4 mL di tampone isolamento per lavare le cellule. Centrifugare le cellule a 300 xg per 8 minuti a 4 ° C per sedimentare le cellule. aspirare accuratamente la supernatant. </li><li> Durante questo spin, pre-lavare le sfere magnetiche. Trasferire la quantità desiderata di perline magnetiche in un nuovo tubo (usato a 1: 1 con le cellule) e aggiungere un uguale volume di tampone di isolamento per lavare le perline. Mescolare bene con una micropipetta mL 1 e quindi inserire il tubo nel magnete per almeno 1 min. Con attenzione aspirare il surnatante. Risospendere le sfere magnetiche nello stesso volume inizialmente ceduto prima del lavaggio. </li><li> Risospendere le cellule in ciascuna provetta con 500 ml di tampone di isolamento e aggiungere 500 ml di perline magnetiche pre-lavati. </li><li> Incubare le cellule con le perline magnetiche per 15 minuti su un agitatore orbitale a temperatura ambiente (18 ° C a 25 ° C) miscelare bene. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, pipettare accuratamente le cellule utilizzando una micropipetta 1 mL almeno 10 volte. Quindi aggiungere 3-4 ml di tampone isolamento e posizionare ciascun tubo nel magnete per 2 min. </li><li> Trasferire accuratamente le cellule T CD4 + negativamente selezionati che sonoil surnatante in una nuova provetta. </li></ol></li><li> Una volta che l&#39;isolamento delle cellule T CD4 + è stata completata, contare le cellule con un emocitometro e mantenere le cellule in ghiaccio. </li><li> Lavare le piastre rivestite con anticorpo due volte con PBS. Quindi aggiungere 1,5 mL di 2x mix di media Th17-polarizzazione in ciascun pozzetto: IFNy anti-umana (20 mg / ml), anti-IL-4 (20 mg / ml), TGF umana (10 ng / mL), umano IL-1β (40 ng / ml), IL-23 (40 ng / ml), IL-6 umana (50 ng / mL) tutti diluita in un mezzo di base privo di siero (integrato con 2 mM di L-glutammina, 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml streptomicina, 10 mM HEPES, 1 mM sodio piruvato e 100 pM 2-mercaptoetanolo). NOTA: Transfection e RNA interference fa il lavoro in supporto contenente siero. Lo scopo di utilizzare supporti privo di siero con questo protocollo è quello di ottenere una migliore produzione di IL-17A. </li><li> Centrifugare le cellule umane T CD4 + a 500 xg per 5 min a 4 ° C a pellet cellule. Aspirare accuratamente la supernatformica. Poi risospendere le cellule in base privo di siero e piastra le cellule ad una densità di 3 x 10 6 in 1,5 ml per pozzetto in modo che il volume finale è di 3 ml per pozzetto e citochine polarizzanti sono ora ad una concentrazione finale 1x. <ol><li> Posizionare le piastre in 5% CO 2, 37 ° C incubatore per due giorni. </li></ol></li></ol> 2. Le cellule elettroporazione di In Vitro polarizzato Th17 umana <ol><li> Il giorno 2, cappotto 48-pozzetti di coltura tissutale con 250 microlitri per pozzetto di anti-umana CD3 (2 ug / mL) e CD28 anti-umano (4 ug / ml) in PBS con calcio e magnesio per almeno 2 ore a 37 ° C. <ol><li> In alternativa, ricoprire le piastre per una notte a 4 ° C. Avvolgere le piastre in parafilm. </li></ol></li><li> Preparare piccoli RNA per la trasfezione. Per ogni trasfezione, aliquota 1 ml di 5 mM soluzione stock di siRNA in una provetta da microcentrifuga da 1,5. Includi appropriata chimica-abbinato piccolo contr RNAolo. Tenere tutti i tubi in ghiaccio. </li><li> Lavare le piastre rivestite con anticorpo due volte con PBS. Quindi aggiungere 500 ml di 1X Th17-polarizzazione media per ogni pozzetto: IFNy anti-umana (10 mg / ml), anti-IL-4 (10 mg / ml), TGF umano (5 ng / mL), IL-umano 1β (20 ng / ml), IL-23 (20 ng / ml), IL-6 umana (25 ng / mL) tutti diluita in un mezzo di base privo di siero (integrato con 2 mM di L-glutammina, 100 U / mL di penicillina, 100 ug / ml streptomicina, 10 mM HEPES, 1 mM sodio piruvato e 100 pM 2-mercaptoetanolo). </li><li> Dopo che le piastre di coltura e reagenti di trasfezione sono preparati, risospendere le cellule con 1 ml micropipetta, pipettando gentilmente ma assicurando che tutte le cellule sono staccate dal fondo dei pozzetti. Raggruppare le cellule in una provetta conica e centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. NOTA: Per periodi più lunghi di cultura del protocollo di quattro giorni qui presentate, le cellule devono essere trasfettate circa ogni 3 giorni usando lo stesso protocollo. Passo 2.4 dovrebbe essere modificato tuttavia, poiché le cellule trattate con differenti piccoli RNA non dovrebbero essere convogliati. Tutte le condizioni in fase di test devono essere raccolti, contati e trasfettate separatamente. </li><li> aspirare accuratamente il surnatante e quindi risospendere le cellule in almeno 1 ml di PBS per lavare. Contare le cellule Th17 vive (ad esempio con un emocitometro utilizzando Trypan Blue esclusione per valutare la vitalità) e poi trasferire le cellule in una provetta. </li><li> Centrifugare a 500 xg per 5 min a temperatura ambiente per agglomerare le cellule. </li><li> Aspirare accuratamente il surnatante e quindi risospendere le cellule usando il tampone di risospensione fornito dal sistema di transfezione 10 microlitri kit ad una densità di 2,5-4 x 10 7 cellule per ml. Mantenere le cellule a temperatura ambiente. NOTA: Come linea guida, provare a preparare solo il maggior numero di cellule, come si può transfettate entro 30 min. lotti multipli possono essere confrontati. </li><li> Aggiungere 9 ml di cellule per 1 ml di piccoli RNA in ogni MicroCtubo entrifuge. Dispensare una volta per mescolare le cellule e piccoli RNA per trasfezione quindi caricare nella punta dell&#39;elettrodo pipetta. NOTA: Tipicamente, aggiungere 9,5 ml di sospensione cellulare per garantire il della miscela per evitare la creazione di bolle nella punta dell&#39;elettrodo pipetta prima trasfezione. </li><li> Riempire la vaschetta fornito con 3 ml di temperatura ambiente elettrolitico Buffer E. Posizionare la cuvetta all&#39;interno della stazione pipetta e quindi inserire la pipetta in posizione all&#39;interno della provetta. </li><li> elettroporazione immediatamente ogni 10 ml mix di cellule e piccoli RNA utilizzando i seguenti parametri: tensione ad impulsi 1,500-1,550 V, larghezza di impulso di 10 ms, e 3 impulsi totale sul dispositivo trasfezione. </li><li> Dopo l&#39;elettroporazione è completa, aggiungere direttamente la miscela di cellule per 500 ml di 1X Th17-polarizzante media in pozzetti preparati dei piastra di coltura. Piastre posto in un 5% di CO 2, 37 ° C incubatore per altri due giorni. NOTA: Lavare l&#39;elettrodo pipetta pipettandosu e giù in PBS tra ogni trasfezione. </li></ol> 3. Cellule raccolta Th17 umane <ol><li> Risospendere le cellule in coltura con una micropipetta, pipettando gentilmente ma garantire che tutte le cellule sono staccate dal fondo dei pozzetti. Preparare le cellule per analisi di espressione funzionale e / o geni. NOTA: Di routine, abbastanza cellule vengono ceduti da un singolo pozzo di cellule Th17 trasfettate da utilizzare per l&#39;analisi di citometria di flusso del marcatore di superficie e intracellulare di citochine e fattori di trascrizione colorazione o per la preparazione di RNA per l&#39;analisi di espressione genica. </li></ol>

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<li>Pua, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+24+and+27+Suppress+Allergic+Inflammation+and+Target+a+Network+of+Regulators+of+T+Helper+2+Cell-Associated+Cytokine+Production%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs 24 and 27 Suppress Allergic Inflammation and Target a Network of Regulators of T Helper 2 Cell-Associated Cytokine Production.</a> Immunity. 44 (4), 821-832 (2016).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo fornisce un metodo migliorato per la consegna di piccoli RNA in cellule Th17 umane. Sebbene le cellule Th17 umane sono stati usati qui, questo metodo di elettroporazione con piccoli RNA può essere utilizzato con altri sottoinsiemi helper umana primaria T, come Th1, Th2 e Tregs. Esso non funziona bene per le cellule T CD4 + naive quindi le cellule devono essere attivati in coltura prima della trasfezione. Per questo protocollo, abbiamo prima ottimizzato il sistema di coltura in vitro in</...

Cellule T CD4 + sono orchestrators cruciali della risposta immunitaria adattativa. Naive cellule T CD4 + sono capaci di svilupparsi in diversi cellule T effettrici (es Th1, Th2, Th17, ecc), ciascuno con la propria serie di citochine e fattori di trascrizione caratteristici, a seconda del microambiente locale 1. Le decisioni lignaggio che le cellule T fanno sono fondamentali sia per l&#39;immunità protettiva e la tolleranza per sé. Cellule Th17 sono un sottogruppo di cellule T conosciuti per combattere batteri extracellulari e funghi, ma le loro risposte improprie sono anche implicati nella patogenesi di più malattie autoimmuni e infiammatorie come la sclerosi multipla e psoriasi 2, 3. Cellule Th17 umane possono essere generati da cellule T CD4 + naive in vitro fornendo loro un appropriato ambiente polarizzazione 4. Vario<html> ci combinazioni delle citochine IL-1β, IL-23, TGF, e IL-6 sono stati utilizzati per lo sviluppo delle cellule Th17 umane. Cellule Th17 umane esprimono CCR6, un recettore delle chemochine che viene comunemente utilizzato per identificare questa popolazione cellulare e sono definite dall&#39;espressione del loro fattore di trascrizione principale, RORγt (codificata dal RORC) 5, 6. cellule Th17 hanno la capacità di esprimere molteplici citochine, ma IL-17A è la citochina effettore lignaggio definizione prodotta da queste cellule. Abbiamo esaminato l&#39;espressione di tutti i tre marcatori Th17-associato (CCR6, RORγt, IL-17A) per valutare la robustezza della nostra analisi umana Th17 in vitro differenziazione. Inoltre, abbiamo coltivato le cellule T CD4 + umane in condizioni non polarizzante, in cui sono stati aggiunti citochine o anticorpi bloccanti al mezzo di coltura da usare come controllo negativo in quanto espressione di questi marcatori Th17 dovrebbe essere molto bassa o assente. ve_content &quot;&gt; Un modo per studiare il normale sviluppo delle cellule T umane e la biologia è quello di manipolare l&#39;espressione genica durante il loro sviluppo. A breve RNA interferenti (siRNA) sono sintetici piccole molecole di RNA che hanno come target mRNA codificanti proteine ​​e possono essere utilizzati per ridurre l&#39;espressione genica specifica . I microRNA (miRNA) sono endogeni non codificanti piccoli RNA noti per modulare l&#39;espressione genica post-trascrizionale. miRNA hanno dimostrato di svolgere un ruolo importante sia murine e biologia delle cellule T umane, anche in cellule Th17 7, 8, 9. e &#39; è fondamentale avere metodi affidabili di manipolare piccola attività di RNA nelle cellule T umane per studiare i loro effetti sulla espressione genica e, infine, sulla biologia delle cellule T umano. Qui, descriviamo un protocollo facile da usare, affidabile e coerente che abbiamo sviluppato per l&#39;introduzione piccoli RNA sintetici e acidi nucleici bloccati (LNA, chimicamente modificati acidi nucleici con maggiore stabilità)nelle cellule del sistema immunitario, e in particolare nelle cellule Th17 umane. Ci sono diversi metodi alternativi di introdurre piccoli RNA in cellule di mammifero, che generalmente rientrano in chimici, biologici o fisici categorie 10. metodi chimici comunemente usati, tra trasfezioni base di lipidi e trasfezioni calcio-fosfato, si basano sulla creazione di complessi chimico-DNA che vengono più efficacemente assorbiti dalle cellule. In generale, i metodi chimici non sono efficienti per la trasfezione di cellule T primarie. Il metodo biologico più comune è quella di utilizzare un vettore virale (ad esempio retrovirus o lentivirus), che inserisce direttamente RNA estraneo in un host come parte del suo ciclo di replica naturale. trasduzione virale richiede in genere più tempo per completare, soprattutto quando si tiene conto in tempo per la clonazione molecolare di plasmidi provirale. Inoltre, i vettori di trasduzione virali possono essere potenzialmente dannosi per i ricercatori umani. L&#39;elettroporazione è una m fisicoetodo di indurre permeabilizzazione della membrana sottoponendo cellule di impulsi di alta tensione, permettendo agli acidi nucleici di entrare transientemente nella cella dove possono agire per suo bersaglio. strumenti elettroporazione tradizionali non sono stati efficaci per trasfezione linfociti primari. Tuttavia, ottimizzato generazione elettroporazione accanto ha dimostrato di essere in grado di trasfettare cellule T ad altissima efficienza, specialmente quando il materiale da transfettate è piccolo RNA. La prossima generazione termine è genericamente usato per differenziare le due piattaforme più recenti (ad esempio, neon, Amaxa) dalle macchine tradizionali elettroporazione. Inoltre, questo metodo è facilmente scalabile per schermi di throughput moderati con fino a circa 120 piccoli RNA in un singolo esperimento, spesso utilizzando reagenti convalidati sintetici. Soprattutto, trasfezioni successo può essere raggiunto in appena 16 h dopo l&#39;attivazione delle cellule T. Lo svantaggio di questo metodo, tuttavia, è che non comporti stabile incorporati genomicasu, ed è quindi transitoria. Quindi, vale la pena lo sforzo supplementare per creare un costrutto di espressione stabile che può essere confezionato in un vettore virale ed espresso con successo in cellule T nei casi in cui è richiesta l&#39;espressione a lungo termine di un piccolo RNA. Abbiamo utilizzato un trasfezione prossima generazione (ad esempio, neon) per fornire diversi strumenti semplice o doppio filamento di RNA o LNA oligonucleotidici per scopi diversi 11, 12, 13. RNA interferenza efficiente può essere indotta nel topo primaria e cellule T umane usando RNA corto interferenti doppio filamento (siRNA). Questo protocollo descrive condizioni ottimizzate per l&#39;utilizzo di questa tecnica in cellule Th17 umane. Oltre a siRNA, disponibili in commercio imita miRNA sintetiche e inibitori possono essere utilizzati per studiare guadagno miRNA e perdita di funzione. imita miRNA sono molecole di RNA a doppio filamento molto simili a siRNA, ma designed con la sequenza dei miRNA maturi endogeni. inibitori miRNA sono chimicamente modificati RNA e / o LNA basato oligonucleotidi cavo rigido che si legano a miRNA nativi e antagonizzano la loro funzione. Abbiamo scoperto che tutti questi strumenti possono essere utilizzati efficacemente in coltura i linfociti T primari, compreso ma non limitato alle cellule Th17 umane.

<table><tbody><tr><td>anti-umano IL-17A PE</td><td>ebioscience</td><td>12-7179-42&nbsp;</td><td>Clone: eBio64DEC17</td></tr><tr><td>anti-umano IFNg FITC</td><td>ebioscience</td><td>11-7319-82</td><td>Clone: 4S. B3</td></tr><tr><td>anti-umano CD4 eVolve605</td><td>ebioscience</td><td>83-0047-42</td><td>Clone: SK3</td></tr><tr><td>topo anti-umano CD196 (CCR6) BV421</td><td>BD biosciences</td><td>562515</td><td>Clone: 11A9</td></tr><tr><td>anti-umano RORgt AF647</td><td>BD biosciences</td><td>563620</td><td>Clone: Q21-559</td></tr><tr><td>anti-umano CD45 eFluor450</td><td>ebioscience</td><td>48-9459-42</td><td>Clone: 2D1</td></tr><tr><td>Foxp3/Colorazione del fattore di trascrizione Set di tamponi</td><td>ebioscience</td><td>00-5523-00</td><td>Per la colorazione con citometria a flusso con fattore di trascrizione intracellulare</td></tr><tr><td>Inibitore del legame Hu FcR Purificato</td><td>ebioscience</td><td>14-9161-71</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium</td><td>Stemcell Technologies</td><td>10981</td><td>"Terreno di base senza siero"</td></tr><tr><td>MACS CD28 grado funzionale puro,</td> clone umano <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-375</td><td>: 15E8</td></tr><tr><td>anti-umano CD3 Purificato</td><td>UCSF nucleo di anticorpi monoclonali</td><td>N/A</td><td>Clone: OKT-3</td></tr><tr><td>LEAF purificato anti-umano IL-4</td><td>Biolegend</td><td>500815</td><td>Clone: MP4-25D2</td></tr><tr><td>anti-umano IFNg, grado funzionale purificato</td><td>ebioscience</td><td>16-7318-85</td><td>Clone: NIB42</td></tr><tr><td>Ricombinante umano IL-23</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>200-23</td><td></td></tr><tr><td>IL-1 umana ricombinante&beta;</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>200-01B</td><td></td></tr><tr><td>TGF umano ricombinante-&beta; 1</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>100-21C</td><td></td></tr><tr><td>IL-6 umano ricombinante</td><td>Peprotech</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>Pool di controllo siGENOME, non mirato #2</td><td>Dharmacon</td><td>D-001206-14-05</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME SMARTpool RORC umano Dharmacon</td><td></td><td>M-003442-00</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME SMARTpool PTPRC umano</td><td>Dharmacon</td><td>M-008067-01</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Kit di cellule T CD4 umane intatte</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11346D</td><td>CD4+ cellula T umana Kit di isolamento</td></tr><tr><td>Neon Tranfection System</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td>Strumento di elettroporazione di nuova generazione</td></tr><tr><td>Neon Tranfection System 10 &mu; L Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di risospensione T</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Fornito nel kit (MPK1096)</td><td>"Tampone di risospensione per trasfezione"</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>#07801</td><td>Gradiente di densità Medium</td></tr><tr><td>costar Piastre trattate per colture tissutali a 6 pozzetti</td><td>Piastre</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>a fondo piatto Corning 3516costar Piastre trattate per colture tissutali a 48 pozzetti</td><td>Piastre a fondo piatto</td><td>Corning</td><td>3548</td></tr><tr><td>Tampone di lisi BD Pharm Lyse, 10x</td><td>BD biosciences</td><td>555899</td><td>Deve preparare 1x soluzione con acqua distillata prima dell'uso</td></tr></tbody></table>

piccolo rna trasfezione in cellule primarie th17 human next generation elettroporazione

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

CD4+ Le cellule T possono differenziarsi in diversi sottogruppi di cellule T helper effettrici a seconda dell'ambiente citochinico circostante. Le cellule Th17 possono essere generate da cellule T CD4+ naive in vitro attivandole in presenza delle citochine polarizzanti IL-1β, IL-6, IL-23 e TGFβ. Le cellule Th17 orchestrano l'immunità contro batteri e funghi extracellulari, ma la loro attività aberrante è stata anche associata a diverse malattie autoimmuni e infiammatorie. Le cellule Th17 sono identificate dal recettore delle chemochine CCR6 e definite dal loro fattore di trascrizione principale, RORγt, e dalla citochina effettrice caratteristica, IL-17A. Le condizioni di coltura ottimizzate per la differenziazione delle cellule Th17 facilitano gli studi meccanicistici della biologia delle cellule T umane in un ambiente controllato. Forniscono inoltre un ambiente per lo studio dell'importanza di geni specifici e programmi di espressione genica attraverso l'interferenza dell'RNA o l'introduzione di imitatori o inibitori di microRNA (miRNA). Questo protocollo fornisce un metodo facile da usare, riproducibile e altamente efficiente per la trasfezione transitoria di cellule Th17 umane primarie differenzianti con piccoli RNA utilizzando un dispositivo di elettroporazione di nuova generazione.

Il primo passo per lo sviluppo di un sistema affidabile di electroporating successo cellule Th17 umane era di generare robusta in vitro differenziato colture di cellule Th17 umane. Le cellule T coltivate in condizioni Th17 polarizzabili espresso il recettore delle chemochine CCR6 e il fattore di trascrizione RORγt (Figura 1A, sinistra). Questi marcatori non sono stati espressi quando le cellule T sono state coltivate in condizioni non polarizzante (THN) ...

L'elettroporazione di nuova generazione è un metodo efficiente per trasfettare cellule Th17 umane con piccoli RNA per alterare l'espressione genica e il comportamento cellulare.

Piccolo RNA trasfezione in cellule primarie Th17 Human Next Generation elettroporazione

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

L'obiettivo generale di questa procedura è trasfettare in modo efficiente linfociti T umani primari con reagenti a RNA di piccole dimensioni utilizzando l'elettroporazione di nuova generazione. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella biologia dei linfociti T, come ad esempio il modo in cui specifici prodotti genici regolano la differenziazione e la funzione immunitaria dei linfociti T. Il principale vantaggio di questa tecnica è che si tratta di un metodo altamente efficiente e affidabile per trasfettare linfociti T umani primari con sRNA e altri reagenti sintetici a RNA di piccole dimensioni.Questo metodo può fornire informazioni sulla biologia delle cellule Th17 umane, ma può essere applicato anche ad altri sistemi, come ad esempio altri linfociti provenienti da esseri umani o da topi. Al giorno zero, rivestire le piastre per colture cellulari a sei pozzetti con 1,5 millilitri per pozzetto di anticorpi anti-CD3 umano e anti-CD28 umano in PBS con calcio e magnesio, per almeno due ore a 37 gradi Celsius. Una volta isolate e lavate le cellule mononucleate del sangue del cordone, o CBMC, procedere all'isolamento delle cellule T CD4 positive mediante se

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questa procedura descrive come stabilire colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino ed è seguita dalla trasfezione con il gene Pulser sistema di elettroporazione MXCell.

La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione

Vi presentiamo il nostro sito ottimizzato high-throughput protocollo nucleofection come un modo efficace di trasfezione delle cellule dendritiche umane primarie derivate da monociti sia con DNA plasmidico o siRNA senza provocare la maturazione delle cellule. Abbiamo inoltre fornire le prove per il silenziamento del gene siRNA successo mirati RIG-I, sia a livelli di mRNA e proteine.

Protocollo ottimizzato per Transfection efficiente delle cellule dendritiche, senza la maturazione delle cellule

Questo protocollo rappresenta un metodo efficiente e affidabile per transfettare umani THP-1 macrofagi con siRNA o il DNA plasmidico mediante elettroporazione con alta efficienza di trasfezione, pur mantenendo alta la vitalità delle cellule e la piena capacità dei macrofagi per la differenziazione e la polarizzazione.

Trasfezione altamente efficiente di umani THP-1 da macrofagi Nucleofection

Utilizzando un Cas9 preassemblati complesso ribonucleoproteico (RNP) è un metodo potente per l'editing genomico precisa, efficiente. Qui, si evidenzia sua utilità in una vasta gamma delle cellule e degli organismi, tra cui cellule umane primarie e classico ed emergenti organismi modello.

Enhanced Genome Editing con Cas9 ribonucleoproteina nelle Diverse cellule e degli organismi

Abbiamo sviluppato un protocollo per trasfettare le cellule epiteliali pigmentate umane primarie mediante elettroporazione con il gene che codifica il fattore derivato dall'epitelio pigmentato (PEDF) utilizzando il sistema di trasposone della Bella Addormentata (SB). Il successo della trasfezione è stato dimostrato mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR), immunoblotting e saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA).

Modificazione genetica basata sull'elettroporazione delle cellule epiteliali pigmentate umane primarie utilizzando il sistema di trasposone della bella addormentata nel bosco

Presentiamo un metodo per la coltura e l'editing genetico delle cellule B primarie del macaco rhesus utilizzando CRISPR / Cas9 e il sierotipo 6 del virus adeno-associato ricombinante per lo studio delle terapie con cellule B.

Editing genetico delle cellule B del macaco rhesus primario

Presentiamo un protocollo per la trasduzione retrovirale dell'RNA guida in cellule T primarie da topi transgenici Cas9, fornendo un'alternativa efficiente per l'editing genetico nello studio del differenziamento Th17.

Targeting genico retrovirale mediato da CRISPR/Cas9 per lo studio della differenziazione Th17 in vitro

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro semplificato per generare e testare cellule T regolatorie del recettore dell'antigene chimerico umano (CAR Tregs).

Generazione di cellule T regolatorie del recettore dell'antigene chimerico umano

Viene fornito un protocollo dettagliato per l'utilizzo della tecnologia CRISPR/Cas9 per ottenere un knock-in mirato altamente efficiente di grandi costrutti multicistronici in cellule T umane primarie attraverso la via di riparazione del DNA HMEJ (omologia-mediata da end joining). Le cellule T ingegnerizzate con questo protocollo adattabile alle cGMP mantengono un'eccellente espansione cellulare, citotossicità e produzione di citochine.

Ingegnerizzazione non virale di cellule T umane primarie tramite integrazione mirata di giunzione terminale mediata da omologia di grandi modelli di DNA

Questo protocollo descrive la miniaturizzazione del genoma CRISPR–Cas9 del recettore TCRα/β nelle cellule T umane primarie utilizzando 'DMF-ection', una piattaforma di elettroporazione microfluidica digitale (DMF). Il metodo consente l'editing genico parallelo e a basso input con alta vitalità ed è ulteriormente adattabile per la somministrazione di mRNA in sferoidi 3D multicellulari.

Una piattaforma digitale di elettroporazione microfluidica per l'editing del genoma CRISPR a basso input e la trasfezione di mRNA in cellule T in sospensione e modelli di celle 3D

La somministrazione degli editori genomici come RNA è un mezzo particolarmente potente per modificare i genomi delle cellule e delle linee cellulari primarie dei mammiferi. L'obiettivo di questo protocollo è fornire editori genomici come mRNA nelle cellule e linee cellulari primarie dei mammiferi, seguiti da sequenziamento e analisi mirati di Illumina per quantificare gli esiti di editing.

Editing genomico nelle cellule primarie di mammiferi tramite elettroporazione dell'RNA editor

Scopri l'elettroporazione di nuova generazione per trasfettare cellule T primarie umane con piccoli RNA. Questo metodo efficiente permette di studiare la differenziazione Th17 e la funzione immunitaria in immunologia.

Piccolo RNA trasfezione in cellule primarie Th17 Human Next Generation elettroporazione

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