Piccolo RNA trasfezione in cellule primarie Th17 Human Next Generation elettroporazione

L'obiettivo generale di questa procedura è trasfettare in modo efficiente linfociti T umani primari con reagenti a RNA di piccole dimensioni utilizzando l'elettroporazione di nuova generazione. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella biologia dei linfociti T, come ad esempio il modo in cui specifici prodotti genici regolano la differenziazione e la funzione immunitaria dei linfociti T. Il principale vantaggio di questa tecnica è che si tratta di un metodo altamente efficiente e affidabile per trasfettare linfociti T umani primari con sRNA e altri reagenti sintetici a RNA di piccole dimensioni.

Questo metodo può fornire informazioni sulla biologia delle cellule Th17 umane, ma può essere applicato anche ad altri sistemi, come ad esempio altri linfociti provenienti da esseri umani o da topi. Al giorno zero, rivestire le piastre per colture cellulari a sei pozzetti con 1,5 millilitri per pozzetto di anticorpi anti-CD3 umano e anti-CD28 umano in PBS con calcio e magnesio, per almeno due ore a 37 gradi Celsius. Una volta isolate e lavate le cellule mononucleate del sangue del cordone, o CBMC, procedere all'isolamento delle cellule T CD4 positive mediante selezione negativa utilizzando un kit commerciale per cellule T CD4 positive umane.

Aggiungere il buffer di isolamento e risospendere le cellule mononucleate. Trasferire le cellule in un nuovo tubo da cinque millilitri, quindi aggiungere 100 microlitri di siero bovino fetale, o FBS, e 100 microlitri della miscela di anticorpi per ogni tubo, quindi incubare ogni tubo a quattro gradi Celsius per 20 minuti su un agitatore orbitale per favorire un buon mescolamento. Al termine dell'incubazione, aggiungere tre-quattro millilitri di buffer di isolamento per lavare le cellule.

Centrifugare le cellule a 300 ×g per otto minuti a quattro gradi Celsius per ottenere il pellet cellulare. Aspirare con attenzione il soprannatante. Trasferire le microsferette magnetiche in un nuovo tubo e aggiungere un volume uguale di buffer di isolamento per lavare le microsferette.

Utilizzare una micropipetta da un millilitro per mescolare accuratamente le perle e quindi posizionare il tubo sul magnete per almeno un minuto. Aspirare con attenzione il soprannatante e ri-sospendere le perle magnetiche nello stesso volume inizialmente trasferito prima del lavaggio. Aggiungere 500 microlitri di tampone di isolamento a ciascun tubo e ri-sospendere le cellule, quindi aggiungere 500 microlitri di perle magnetiche prelavate.

Incubare le cellule con le microsfere magnetiche per 15 minuti su un agitatore orbitale a temperatura ambiente per favorire un'adeguata miscelazione. Al termine dell'incubazione, utilizzando una micropipetta da un millilitro, pipettare accuratamente le cellule almeno 10 volte, quindi aggiungere da tre a quattro millilitri di buffer di isolamento e posizionare ogni provetta sul magnete per due minuti. Trasferire con attenzione le cellule T CD4 positive, selezionate negativamente, presenti nel surnatante in un nuovo tubo.

Una volta completata l'isolazione delle cellule T positive per CD4, mantenere le cellule sul ghiaccio e contare le cellule utilizzando un emocitometro. Lavare le piastre rivestite con anticorpo due volte con PBS, quindi aggiungere 1,5 millilitri di mix 2X di mezzo polarizzante per Th17 in ogni pozzetto. Successivamente, centrifugare le cellule T umane positive per CD4 per formare il pellet cellulare.

Aspirare con attenzione il soprannatante e scartarlo, quindi risospendere le cellule in un mezzo basale senza siero e seminare le cellule in modo che il volume finale sia di tre millilitri per pozzetto e che le citochine polarizzanti raggiungano ora una concentrazione finale di 1X; quindi posizionare le piastre in un incubatore con 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per due giorni. Al secondo giorno, ricoprire le piastre da coltura tissutale a 48 pozzetti con 250 microlitri per pozzetto di anti-CD3 umano e anti-CD28 umano in PBS con calcio e magnesio, per almeno due ore a 37 gradi Celsius. Per preparare i piccoli RNA da trasfettare, aliquotare un microlitro di una soluzione madre di siRNA cinque micromolare in un tubo microcentrifugo da 1,5 millilitri per ogni trasfezione.

Mantenere tutte le provette sul ghiaccio. Successivamente, lavare le piastre rivestite con anticorpo due volte con PBS, quindi aggiungere 500 microlitri di mezzo polarizzante Th17 1X in ogni pozzetto. Dopo aver preparato le piastre di coltura e i reagenti per la trasfezione, risospendere le cellule utilizzando una micropipetta da un millilitro, pipettando delicatamente ma assicurandosi che tutte le cellule siano staccate dal fondo dei pozzetti.

Raccogliere le cellule in un tubo conico e centrifugare i tubi a 500 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Aspirare con attenzione il soprannatante, quindi risospendere le cellule in almeno un millilitro di PBS per il lavaggio. Contare le cellule Th17 vitali con un emocitometro, utilizzando l’esclusione al blu di tripano per valutare la vitalità, quindi pellettizzare le cellule in un tubo da microcentrifuga.

Aspirare con attenzione il soprannatante e risospendere le cellule utilizzando il tampone di risospensione fornito nel kit. Mantenere le cellule a temperatura ambiente. Aggiungere nove microlitri di cellule a un microlitro di RNA di piccole dimensioni in ogni provetta per microcentrifuga.

Pipettare una volta per mescolare le cellule e gli RNA piccoli per la trasfezione, quindi caricare le cellule nella punta elettrodo fornita. Per garantire una trasfezione ottimale, evitare di introdurre bolle d'aria nella punta elettrodo prima della trasfezione. Aggiungiamo 9,5 microlitri di sospensione cellulare per assicurare un quantitativo sufficiente di miscela e prevenire la formazione di bolle nella pipetta per elettroporazione.

Riempire la cuvetta fornita con tre millilitri di tampone elettrolitico a temperatura ambiente. Posizionare la cuvetta all'interno della stazione per pipetta neon e quindi inserire la pipetta nella posizione corretta all'interno della cuvetta. Elettroporare immediatamente ogni miscela di 10 microlitri di cellule e RNA interferente a interferenza genica.

Al termine dell'elettroporazione, aggiungere direttamente la miscela cellulare a 500 microlitri di mezzo polarizzante per Th17 1X presente in pozzetti preparati di una piastra per colture. Infine, posizionare le piastre in un incubatore a 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius per altri due giorni. Lavorare con attenzione ma rapidamente per prevenire la morte cellulare.

Se è necessario elettroporare un numero elevato di campioni, le cellule possono essere raccolte e trasfettate in lotti. Questo grafico di contorno mostra che le cellule T coltivate in condizioni di polarizzazione Th17 esprimevano il recettore per chemochine CCR6 e il fattore di trascrizione ROR gamma T, che non erano espressi quando le cellule T venivano coltivate in condizioni non polarizzanti. Le cellule T coltivate in condizioni di polarizzazione Th17 producevano inoltre IL-17A dopo la ri-stimolazione, ma non nelle condizioni ThN.

La differenziazione delle cellule Th17 avviene comunque dopo la trasfezione con piccole RNA, ma in alcuni esperimenti si osserva una riduzione della frequenza di produzione di IL-17A. Questo dimostra l'importanza di utilizzare un controllo costituito da piccole RNA con chimica abbinata, da confrontare in ciascun esperimento. La vitalità cellulare viene mantenuta dopo la trasfezione con piccole RNA ed è tipicamente superiore al 70%. La trasfezione di cellule Th17 umane al secondo giorno con un pool di siRNA mirato al gene PTPRC, che codifica per CD45, ha ridotto fortemente l'espressione di CD45 rispetto a un siRNA di controllo con chimica abbinata.

La variazione unimodale nell'espressione di CD45, visibile qui, indica un'efficienza di trasfezione prossima al 100%. La riduzione dell'espressione di ROR gamma T mediante RNAi ha prodotto un effetto funzionale, poiché queste cellule hanno mostrato una produzione ridotta di IL-17A rispetto alle cellule trasfettate con un siRNA di controllo. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come trasfettare cellule Th17 umane polarizzate in vitro con piccoli RNA utilizzando l'elettroporazione di nuova generazione.