Name: Espressione, purificazione e attività antimicrobica di S100A12 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Impara l'espressione e la purificazione di S100A12 per studiare l'attività antimicrobica contro H. pylori. Questo protocollo ottimizzato fornisce alte rese di dimero puro stabile per la ricerca sui peptidi antimicrobici.

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Questa ricerca è stata sostenuta dal Dipartimento per i Premi Veterans Affairs Award di sviluppo professionale 1IK2BX001701, il premio CTSA UL1TR000445 dal Centro Nazionale per l&#39;Avanzamento delle Scienze Traslazionali, il National Science Foundation Award Numbers 1547757 e 1400969 e NIH concede GM05551. Il suo contenuto è esclusivamente responsabile degli autori e non rappresenta necessariamente una visione ufficiale del Centro Nazionale per l&#39;Avanzamento delle Scienze Traslazionali o degli Istituti Nazionali di Salute.

1. Espressione di S100A12 <ol><li> Trasformare le competenti BL21 DE3 con un plasmide pGEMEX-S100a12 utilizzando un protocollo di scossa termica standard 18 . Aggiungere 1 a 5 μL di plasmide a 50 μL di batteri in un tubo di microcentrifuga sul ghiaccio. Incubare per 20 min. </li><li> Scoppio di calore le cellule a 42 ° C per 30 s. </li><li> Incubare le celle sul ghiaccio per 2 min. </li><li> Aggiungere 500 μL di supporti SOC alle cellule. Incubare a 37 ° C con agitazione a 250 giri / min su un agitatore orbitale per 1 h. </li><li> Piastra 150 μL della reazione di trasformazione sul supporto LB-agar (integrato con 100 μg / mL ampicillina). Incubare per 12-16 h a 37 ° C. </li><li> Scegli una colonia. Inoculare 2 mL di LB (integrato con 100 μg / mL ampicillina). </li><li> Incubare per 4-6 h a 37 ° C su un agitatore orbitale (300 rpm). L&#39;OD 600 dovrebbe leggere tra 1-3 unità di assorbanza. </li><li> Aggiungere 500 μl di coltura d&#39;avviamento a 50 ml di autoinduzione ZYM-5052Cazione media 26 integrata con 100 μg / mL di ampicillina. Per una migliore aerazione e massima espressione, utilizzare un pallone Erlenmeyer confuso da 250 mL. Agitare (300 giri / min) per 24 h, a 37 ° C. </li><li> Trasferire la sospensione batterica in un tubo di centrifuga. Pellet le cellule per centrifugazione (4.000 xg, 10 min) a 4 ° C. </li><li> Decantare il supporto, il campione di registro e memorizzare la pasta cellulare a -80 ° C. Il campione è stabile per anni. </li></ol> 2. Purificazione di S100A12 utilizzando la cromatografia a bassa pressione <ol><li> Riposizionare le cellule in 30 mL di 20 mM Tris, pH 8,0. </li><li> Sonicare la sospensione sul ghiaccio per lire le cellule. Usare ~ 20 W uscita, 5 s su e 5 s fuori ciclo per 5 min. </li><li> Trasferire la soluzione ai tubi centrifughi ad alta velocità. Chiarire il lisato cellulare per centrifugazione, 20.000 xg per 30 minuti a 4 ° C. </li><li> Decantare il surnatante e trasferire in un bicchiere da 100 ml di polipropilene pulito. Raffreddare la soluzione posando il bicchiere sul ghiaccio. Aggiungete un agitatoreR e aggiungere lentamente 11,20 g di solfato di ammonio. Lasciare agire la soluzione su ghiaccio per altri 1 h. Questo creerà una soluzione al 60% di solfato di ammonio e precipita la maggior parte delle proteine ​​endogene di E. coli . S100A12 resterà solubile. </li><li> Centrifugare la soluzione a 4 ° C, 20.000 xg per 20 minuti per far pelliccare la proteina precipitata. </li><li> Decantare il surnatante e trasferire in tubo di dialisi (MWCO 3.500 kDa). Dializzare contro 1 L di 20 mM Tris, pH 8,0 a 4 ° C. Cambiare due volte il buffer di dialisi. Permettono 4 ore tra le modifiche. </li><li> Cianografia cromatica anionica <ol><li> Eseguire la cromatografia su un sistema a bassa pressione. La portata tipica è di 1 mL / min. </li><li> Equilibrare una colonna di Sepharose da 5 ml con 10 mi di 20 mM Tris, pH 8,0. </li><li> Caricare la ~ 40 mL di soluzione S100A12 utilizzando la pompa di campionamento (raccogliere il flusso attraverso). </li><li> Lavare la colonna con 10 ml di 20 mM Tris, pH 8. </li><li> Sviluppare la colonna con una gradiente 0-30% (BuFfer B è 20 mM Tris, pH 8,0, 1 M NaCl) su 19 volumi di colonna (CV, 95 mL). Raccogliere 5 ml di frazioni. </li><li> Prendere un&#39; aliquota di 10 μl di ciascuna frazione e analizzare utilizzando MES SDS PAGE con la colorazione di Coomassie. Eseguire il gel con tensione costante (20 V / cm) per 30 min. </li><li> Frazioni di pool contenenti S100A12. S100A12 funziona a ~ 10 kDa proteina su un gel di denaturazione. </li><li> Frazioni concentrate a 5 mL utilizzando un dispositivo di ultrasuono (MWCO 10 kDa). Centrifugare a 3.000 xg per ~ 8 min. Prendi la frazione superiore. </li></ol></li><li> Cromatografia di esclusione di dimensioni <ol><li> Equilibrare la colonna S75 con 1 CV (120 mL) di 20 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl. </li><li> Iniettare &lt;5 mL di frazioni concentrate S100A12 (dalla cromatografia di scambio ionico). </li><li> Sviluppare la colonna con una portata di 1 mL / m su 120 mL. Raccogliere 5 ml di frazioni. </li><li> Prendere un&#39; aliquota di 10 μl di ciascuna frazione e analizzare usando SDS PAGE con la colorazione di Coomassie. Convalida l&#39;identità di proteine ​​utilizzandoWestern blot o spettrometria di massa (massa molecolare calcolata di subunità monomerica 10.575.0 Da, misurata 10575.4 Da). </li></ol></li><li> Frazioni di pool <ol><li> Misurare l&#39;assorbanza della proteina A 280 utilizzando uno spettrofotometro. Utilizzare il buffer SEC come un vuoto. Il coefficiente di estinzione calcolato per l&#39;omodimero S100A12 è di 5960 M -1 cm -1 . NOTA: Le rese tipiche sono 35-45 mg di S100A12 per 50 ml di coltura. </li><li> Aliquot S100A12 in 1,5 mL di microcentrifuga (1 mg / tubo), congelare in azoto liquido e conservare a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 3. Analisi di attività antimicrobiche <ol><li> Streak H. pylori ceppo G27 su piatti triplici di agar di soia integrati con 5% di sangue di pecora (piastre agarico di sangue). Crescere 2-3 giorni a 37 ° C in aria ambiente integrata con 5% di anidride carbonica. </li><li> Inoculare H. pylori nel brodo Brucella integrato con 1x colesterolo. Cultura oltreScuotendo la notte (250 rpm) a 37 ° C in aria ambiente integrata con 5% di anidride carbonica. </li><li> Diluire H. pylori 1:10 in brodo Brucella al 50%, 50% tampone di calprotectina più 1x colesterolo e coltura in mezzo solo o integrato con 100 μM cloruro di zinco più 0, 100 o 1.000 μg / mL di S100A12 purificato. La cultura si scuota durante la notte (250 rpm) a 37 ° C in aria ambiente integrata con il 5% di anidride carbonica. </li><li> Il giorno successivo, eseguire le diluizioni e la piastra seriali sulle piastre di agar sangue. Lasciare colonie batteriche a crescere per 2-3 giorni a 37 ° C in aria ambiente integrata con 5% di anidride carbonica. Enumerare le unità formanti colonia per calcolare la crescita batterica in presenza o in assenza di S100A12 e / o di zinco esogeno. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Viene presentato un protocollo efficiente sia per l&#39;espressione che per la purificazione dell&#39;uomo S100A12. Il sistema di espressione E. coli è lo strumento più comune per la produzione di proteine ​​ricombinanti, in particolare quando sono necessari quantitativi di mg per studi biochimici e biofisici. Un valorizzazione chiave della procedura qui descritta è l&#39;uso di mezzi autoinduttivi 26 che aumentano la resa della proteina purificata di un fattore di quasi trenta rispetto ...

Le proteine ​​S100 sono una classe della famiglia EF di proteine ​​legate al calcio con una varietà di funzioni 1 . Essi vengono espressi in maniera specifica per tessuti e cellule e regolano un ampio spettro di funzioni cellulari 2 , 3 . Uniche alle proteine ​​legate al calcio, le proteine ​​S100 presentano sia funzioni intracellulari che extracellulari 4 , 5 . All&#39;interno della cellula, il legame Ca 2+ induce un cambiamento conformazionale che espone una superficie idrofobica che specifica targeting partner legati alla proteina 6 . Questo meccanismo intracellulare regola processi importanti come la proliferazione cellulare, la differenziazione e il metabolismo energetico. Nell&#39;ambiente extracellulare, le proteine ​​S100 presentano due funzioni 7 . In uno, agiscono come proteine ​​del modello molecolare associate a danni (DAMP) e iniziano un pro-inflammRisposta immunitaria atorica attraverso l&#39;interazione con i recettori di riconoscimento del pattern 8 , 9 . Inoltre, diversi membri dei metalli di transizione sequenziali delle proteine ​​S100, una funzione che serve a morire di fame gli agenti patogeni microbiali in un processo chiamato immunità nutrizionale 10 , 11 . S100A12 (noto anche come calgranulina C e EN-RAGE) è altamente espresso in macrofagi e neutrofili ed è stato identificato come potenziale biomarker per le malattie infiammatorie 12 , 13 . Oltre a legare il calcio nei suoi siti EF-Hand, S100A12 presenta due siti di rilascio di metallo di transizione ad alta affinità situati alle estremità opposte dell&#39;interfaccia dimerica 14 , 15 . Ogni sito di legame è costituito da tre residui di istidina e un residuo di acido aspartico e può chelare zinco o rameSup class = &quot;xref&quot;&gt; 16 , 17 . Recentemente, abbiamo riportato che la fame di zinco dipendente da S100A12 è importante per la regolazione della crescita di Helicobacter pylori e l&#39;attività dei fattori di virulenza pro-infiammatoria 18 . H. pylori infetta lo stomaco di circa la metà della popolazione umana del mondo; Rendendo probabilmente uno dei patogeni batterici più riusciti 19 . L&#39;infezione con H. pylori può portare a risultati significativi della malattia gastrica, tra cui gastrite, ulcera peptica e duodenale, linfoma associato a linfoma associata alla mucosa (MALT) e adenocarcinoma gastrico invasivo (tumore dello stomaco). Il cancro allo stomaco è la causa principale della morte associata a cancro non cardiaca nel mondo e il più grande fattore di rischio associato per il cancro allo stomaco è l&#39;infezione da H. pylori . H. pylori persiste nella nicchia gastrica nonostante un robuSt rispondendo alla risposta immunitaria al patogeno sottolineando la necessità di una migliore comprensione dei meccanismi immunitari di controllo di questa infezione batterica 20 , 21 , 22 , 23 . L&#39; infiammazione associata a H. pylori è caratterizzata da una profonda infiltrazione di cellule polimorfonucleari, o neutrofili, che depositano un repertorio di proteine ​​antimicrobiche, tra cui S100A12, nel sito dell&#39;infezione 18 , 24 , 25 . Nel tentativo di comprendere il complesso dialogo tra host e agenti patogeni, abbiamo cercato di perfezionare la tecnica per purificare S100A12 e utilizzarlo per studiare l&#39;effetto antimicrobico che esercita su questo patogeno medico rilevante. Il protocollo sottostante descrive una tecnica migliorata per la purificazione del S100A12 nel suo stato biologicamente attivo; Capace di legare metalli nutrienti ad alta affiniChe li ha allontanati dai microrganismi invasori. Inoltre, i metodi sottostanti evidenziano l&#39;utilità di questa proteina come reagente critico per studiare il meccanismo in base alle quali le innate molecole antimicrobiche restringono la crescita di patogeni batterici. Le proteine ​​della famiglia S100A hanno guadagnato l&#39;apprezzamento come un importante gruppo di molecole innate del sistema immunitario che partecipano al segnalamento immunitario e alla difesa dell&#39;ospite 27 . Il più ben studiato di questi è la calprotectina (MRP-8/14, calgranulina A / B, S100A8 / A9) 28 , 29 , 30 . La calprotectina è una proteina associata a neutrofili che forma un eterodimero delle sottounità S100A8 e S100A9 che lega i metalli di transizione all&#39;interfaccia dimerica 31 . La calprotectina ha dimostrato di possedere due siti di legame metallico: il sito 1 può legare Zn 2+ , Mn 2+ o Fe 2+ e il sito 2 può<html> Lega Zn 2+ 31 , 32 . Numerose relazioni hanno dimostrato che la calprotectina ha attività antimicrobiche contro diversi agenti patogeni tra cui Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli e H. pylori e che gli effetti inibitori sono dovuti all&#39;attività di chelazione metallica della calprotectina 25,28 , 29 . Il lavoro precedente ha dimostrato che la calprotectina esercita numerose attività su H. pylori, tra cui alterare la struttura lipidica A nella membrana esterna, reprimendo il sistema di secrezione cag -Type IV (che è un fattore importante della virulenza di proinfiammazione all&#39;interno di H. pylori ), inducendo la formazione del biofilm e reprimendo La crescita e la vitalità di H. pylori in modo dose-dipendenteClass = &quot;xref&quot;&gt; 25 , 33 . Inoltre, i test genetici e biochimici hanno rivelato l&#39;attività antibatterica della calprotectina contro H. pylori è stata in gran parte derivata dalla sua capacità di legare lo zinco nutrizionale 25 . H. pylori richiede lo zinco, come è stato determinato dalla ricerca precedente che ha utilizzato un mezzo chimicamente definito per accertare i requisiti micronutrienti per questo patogeno per crescere e proliferare 34 . Inoltre, la calprotectina era altamente abbondante nei tessuti H. pylori- infettati e associata a infiltrati neutrofili, indicando che l&#39;ospite può impiegare calprotectina come strategia antimicrobica durante l&#39;infezione e successiva infiammazione 25 , 35 . Recenti evidenze da tecniche di screening proteomiche impareggiabili suggeriscono che in condizioni in cui le specie reattive di ossigeno sono abbondanti, calprotecLa stagna subisce modificazioni post-traslazionali che alterano il sito di legame ad esa-istidina, inibendo così l&#39;attività legante del metallo della proteina 36 . Come tale, abbiamo ipotizzato che altre proteine ​​della famiglia S100A tra l&#39;ampio repertorio di queste molecole potrebbero potenzialmente agire come chelatori metallici ausiliari. Abbiamo selezionato S100A12 per ulteriori studi perché non è stato identificato nello schermo di cui sopra per la modifica post-traslatoria, ha la capacità di legare lo zinco ed è altamente abbondante nei tessuti umani derivanti da individui infetti da H. pylori . Il nostro lavoro indica che S100A12 può inibire la crescita e la vitalità di H. pylori in maniera dose-dipendente nel ceppo G27 di H. pylori e che l&#39;attività antimicrobica di questa proteina può essere invertita con l&#39;aggiunta di zinco in eccesso di nutrienti. Questo lavoro completa il nostro precedente lavoro che indica l&#39;attività antimicrobica S100A12 contro PMSS1 e 7.13 ceppi di H. pylori , dimostrando la sua vasta attività antibatterica contro numerosi isolati clinici e ceppi adattati al laboratorio di H. pylori 18 . Insieme, questi risultati confermano l&#39;importanza di S100A12 come meccanismo di controllo della crescita batterica e della proliferazione attraverso l&#39;immunità nutrizionale. Studi futuri di questa importante interazione batterica possono includere lo sfruttamento dell&#39;attività di S100A12 per ridurre il carico batterico nei tessuti dell&#39;host, o determinare il contributo di questa proteina alla segnalazione immunitaria nel contesto dell&#39;infezione da H. pylori .

<table><tbody><tr><td><forte>S100A12 Espressione</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Cellule di espressione</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BL 21 (DE3) cellule competenti</td><td>New England Biolabs</td><td>C25271</td><td></td></tr><tr><td>Componenti</td><td></td><td></td><td></td>del mezzo di autoinduzione</tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Prodotti di ricerca internazionali</td><td>Y20020-250.0</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Research Products International</td><td>S23020-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Research Products International</td><td>T60060-250.0</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2877</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Research Products International</td><td>M65240-100.0</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Research Products International</td><td>S23100-500.0</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Research Products International</td><td>P41200-500.0</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Research Products International</td><td>A20424-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Research Products International</td><td>S25150-500.0</td><td></td></tr><tr>Prodotti <td>per la ricerca sul</td><td>glicerolo</td> International <td>G22020-1.0</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosio</td><td>Research Products International</td><td>G32040-500.0</td><td></td></tr><tr><td>lattosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2643</td><td></td></tr><tr><td>Selection agent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ampicillin</td><td>Research Products International</td><td>A40040-5.0</td><td></td></tr><tr><td>S100A12 Purificazione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKTA Sistema di cromatografia iniziale</td><td>GE</td><td>29-220-94</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Q Sepharaose Fast Flow</td><td>GE</td><td>17-5156-01</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 16/60 S-200 HR</td><td>GE</td><td>17-1166-01</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro Nanodrop lite</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-LITE</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Research Products International</td><td>T60040-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>H. pylori Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastre di agar sanguigno</td><td>Forniture di laboratorio Azienda</td><td>BBL221261</td><td></td></tr><tr><td>Brodo Brucella</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3051</td><td></td></tr><tr><td>Colesterolo (250x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12531018</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di zinco</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>229997</td><td></td></tr></tbody></table>

espressione, purificazione e attività antimicrobica di s100a12

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Le proteine ​​di Calgranulina sono importanti mediatori dell&#39;immunità innata e sono membri della classe S100 della famiglia EF di proteine ​​legate al calcio. Alcune proteine ​​S100 hanno la capacità di legare i metalli di transizione con elevata affinità e di bloccarli in modo efficace dagli invasori di patogeni microbici in un processo chiamato &quot;immunitario nutrizionale&quot;. S100A12 (EN-RAGE) lega sia lo zinco che il rame ed è altamente abbondante nelle cellule immunitarie innate come macrofagi e neutrofili. Riconosciamo un metodo raffinato per l&#39;espressione, l&#39;arricchimento e la purificazione di S100A12 nella sua attiva configurazione metallica. L&#39;utilizzo di questa proteina in analisi della crescita batterica e della vitalità rivela che S100A12 ha un&#39;attività antimicrobica contro il patogeno batterico , Helicobacter pylori . L&#39;attività antimicrobica è basata sull&#39;attività di legame di zinco di S100A12, cheelato lo zinco nutritivo, affamando così H. pylori che richiede zinco per la crescita e proliferation.

S100A12 espressione e purificazione Una depurazione a tre fasi ha prodotto ~ 40 mg di S100A12 ricombinante da 50 ml di coltura batterica. Il primo passo era una precipitazione di solfato di ammonio di proteine ​​endogene di E. coli . Questa fase è stata seguita da una cromatografia di anion-exchange ( figura 1A ). La proteina è tracciata da una SDS-PAGE macchiata con Coomassie Brilliant ...

Qui, presentiamo un metodo per esprimere e purificare S100A12 (calgranulina C). Descriviamo un protocollo per misurare la sua attività antimicrobica contro il patogeno umano H. pylori .

Espressione, purificazione e attività antimicrobica di S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è facilitare l'isolamento e la purificazione di S100A12 nella sua forma attiva, in modo che possa essere utilizzato per saggi antimicrobici. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della microbiologia, ad esempio quale sia il ruolo di S100A12, un peptide antimicrobico prodotto in risposta all'infezione da batteri patogeni. Il principale vantaggio di questa tecnica è che il nostro protocollo ottimizzato fornisce rese elevate di dimero di S100A12 puro e stabile, in grado di legare e sequestrare metalli nutrienti.Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà perché la S100A12 forma oligomeri di dimensioni variabili in determinate condizioni, e questi oligomeri presentano un'attività antimicrobica ridotta in vitro. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo iniziato a purificare e studiare l'attività antimicrobica di una proteina correlata della famiglia S100A chiamata calprotectina. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale per le fasi finali di purificazione riguardanti le dimensioni e la colonna.E i saggi antimicrobici sono importanti per il successo di questo processo. Per iniziare questa procedura, trasformare cellule BL21 DE3 competenti come descritto nel protocollo testuale. Successivamente, aggiungere da uno a cinque microlitri di plasmide a 50 microlitri di batteri in un tubo da microcentrifuga posto sul ghiaccio.Incubare per 20 minuti. Successivamente, sottoporre le cellule a shock termico a 42 gradi Celsius per 30 secondi. Incubare sul ghiaccio per due minuti.Quindi, aggiungere 500 microlitri di mezzo SOC. Incubare a 37 gradi Celsius su un agitatore orbitale a 250 giri al minuto per un'ora. Successivamente, piastrare 150 microlitri della reazione di trasformazione su mezzo LB agar, integrato con 100 microgrammi per millilitro di ampicillina.Incubare per 12-16 ore a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, selezionare una singola colonia e inoculare due millilitri di terreno LB integrato con ampicillina. Incubare a 37 gradi Celsius su un agitatore orbitale a 300 giri al minuto per quattro-sei ore.Successivamente, aggiungere 500 microlitri di coltura iniziale a 50 millilitri di terreno di induzione automatica ZYM 5052 supplementato con ampicillina. Agitare a 300 rpm per 24 ore a 37 gradi Celsius. Quindi, trasferire la sospensione batterica in un tubo da centrifuga.Centrifugare a 4.000 × g e a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Dopo la centrifugazione, decantare il mezzo, registrare il campione e conservare il pellet cellulare a meno 80 gradi Celsius. Per iniziare, risospendere il pellet cellulare in 30 millilitri di tris 20 millimolare, a pH 8,0. Successivamente, sottoporre la sospensione a sonicazione in ghiaccio a 20 watt, con cicli di cinque secondi accesi e cinque secondi spenti, per cinque minuti, al fine di lisare le cellule.Trasferire la soluzione sonificata in provette per centrifugazione ad alta velocità. Centrifugare a 20.000 ×g a quattro gradi Celsius per 30 minuti per chiarificare il lisato cellulare. Successivamente, decantare il soprannatante in un becher pulito da 100 millilitri in polipropilene.Posizionare il becher su ghiaccio per raffreddare la soluzione. Aggiungere una bacchetta magnetica e aggiungere lentamente 11,20 grammi di solfato di ammonio. Mescolare la soluzione su ghiaccio per un'ora.Successivamente, trasferire la soluzione in provette da centrifuga e centrifugare a 20.000 × g a quattro gradi Celsius per 20 minuti al fine di ottenere un pellet delle proteine precipitate. Decantare il soprannatante in tubi da dialisi. Eseguire la dialisi contro un litro di tris 20 millimolare a quattro gradi Celsius e pH 8,0. Cambiare il buffer di dialisi due volte, con un intervallo di quattro ore tra un cambio e l'altro.Successivamente, equilibrare una colonna di sepharosio da cinque millilitri con 10 millilitri di tris 20 millimolare. Utilizzando la pompa del campione, caricare circa 40 millilitri di soluzione di S100A12. Raccogliere il flusso in uscita.Successivamente, lavare la colonna con tris 20 millimolari. Sviluppare la colonna utilizzando un gradiente da zero a 30% in 19 volumi di colonna. Raccogliere frazioni da cinque millilitri.Utilizzare una gelatina SDS-PAGE con colorazione al Comassie per analizzare un'aliquote di 10 microlitri di ciascuna frazione. Successivamente, raccogliere le frazioni contenenti S100A12. Mediante un dispositivo di ultrafiltrazione, concentrare le frazioni fino a cinque millilitri.Successivamente, equilibrare una colonna S75 con una soluzione di 120 millilitri di tris 20 millimolari e cloruro di sodio 100 millimolari. Iniettare il campione di cinque millilitri costituito dalle frazioni concentrate. Successivamente, sviluppare la colonna a una velocità di flusso di un millilitro al minuto su un volume di 120 millilitri.Raccogliere frazioni da cinque millilitri. Analizzare un'aliquota da 20 microlitri di ciascun campione mediante SDS-PAGE con colorazione coomassica. Successivamente, confermare l'identità della proteina ed eluere le frazioni come descritto nel protocollo testuale.Per iniziare, effettuare un’isolazione di H.pylori in brodo di brucella integrato con colesterolo 1X. Coltivare per tutta la notte a 37 gradi Celsius con agitazione a 250 giri al minuto in aria arricchita con il 5% di anidride carbonica. Diluire l’H.pylori in rapporto 1:10 in una miscela composta da 50% di brodo di brucella e 50% di tampone calprotectina, aggiungendo colesterolo 1X.Aggiungere la proteina S100A12 e/o metalli esogeni secondo necessità. I saggi antimicrobici rappresentano un punto critico. È importante utilizzare un tampone di calprotectina per garantire la stabilità dei dimeri di S100A12 e fornire un mezzo minerale carente di metalli per i saggi di crescita batterica, in modo che la proteina non venga sopraffatta da un eccesso di micronutrienti, comunemente presenti nei mezzi batteriologici complessi e ricchi.Il giorno seguente, effettuare diluizioni seriali dei campioni. Successivamente, seminare su piastre di agar sangue. Lasciare crescere le colonie batteriche per due o tre giorni a 37 gradi Celsius in aria arricchita con il 5% di anidride carbonica.Dopo questo, calcolare la crescita batterica come indicato nel protocollo testuale. In questo studio viene presentato un metodo migliorato per esprimere e purificare S100A12 nella sua configurazione attiva di legame con metalli. Il processo di purificazione in tre fasi inizia con una precipitazione mediante solfato di ammonio delle proteine endogene di E.coli, seguita da cromatografia a scambio anionico.Dopo aver tracciato la proteina mediante elettroforesi SDS-PAGE con colorazione coomassica brillante blu, le frazioni contenenti S100A12 vengono raccolte per la cromatografia a esclusione dimensionale. S100A12 è un omodimero con 92 amminoacidi per subunità e ha un peso molecolare totale di circa 21 chilodalton.L'attività antimicrobica di S100A12 viene quindi studiata mediante tecniche quantitative di coltura microbiologica. Il conteggio delle cellule batteriche rivela che l'esposizione a 100 microgrammi per millilitro di S100A12 in presenza o assenza di una fonte esogena di zinco non inibisce significativamente la vitalità batterica. Tuttavia, l'esposizione a 1.000 microgrammi per millilitro di S100A12 nel mezzo in assenza di nutrienti aggiuntivi determina una riduzione di 69 volte della vitalità batterica.L'aggiunta di una fonte esogena di zinco come nutriente annulla questo risultato, dimostrando che l'attività antimicrobica della S100A12 dipende dalla sua capacità di sequestrare lo zinco. Una volta acquisita padronanza, l'espressione e la purificazione della proteina possono essere completate in tre o quattro giorni, se eseguite correttamente. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi come la spettrometria di massa con accoppiamento induttivo possono essere utilizzati per rispondere a ulteriori domande.Come fa il sequestro di metalli a limitare la crescita microbica? Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della microbiologia per esplorare l'immunità nutrizionale di H.pylori. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come esprimere, purificare e quantificare l'attività della proteina antimicrobica S100A12.Non dimenticare che lavorare con H.pylori può essere estremamente pericoloso. È sempre necessario adottare precauzioni, come lavorare in uno spazio certificato di livello BS2, quando si esegue questa procedura. Le implicazioni di questa tecnica riguardano le malattie gastriche, tra cui ulcera, gastrite e carcinoma adnexale invasivo.Comprendendo questi processi, saremo meglio preparati a sviluppare nuove molecole antimicrobiche che li prendono di mira. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla biochimica delle proteine della famiglia S100A, può anche essere applicato allo studio del loro ruolo nella segnalazione immunitaria e in numerosi processi patologici come il cancro, l'artrite e le malattie infettive.

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Purificazione delle proteine basata sulla cromatografia a scambio anionico: una tecnica di separazione per isolare una proteina di interesse dal lisato batterico dializzato basato sulla carica netta

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Espressione, purificazione e attività antimicrobica di S100A12

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