Name: Un In vitro Test di rilascio di Caseum che prevede la penetrazione di farmaci nelle lesioni della tubercolosi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Scopri il metodo RED per misurare il legame dei farmaci al caseum nelle lesioni tubercolari. Questa tecnica di dialisi rapida sostituisce i modelli animali e offre un'alternativa economica per studiare la penetrazione antimicrobica.

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Desideriamo ringraziare Johnson &amp; Johnson, la TB Alliance, Astra Zeneca, Rib-X e Trius Therapeutics per la fornitura di bedaquiline, PA-824 (pretomanid), AZD5847, radezolid e tedizolid, rispettivamente. Brendan Prideaux, Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin, Emma Rey-Jurado, Nancy Ruel, Leyan Li e Danielle Weiner fornito supporto con analisi MALDI, metodi bioanalitici, preparazione del surrogato caseum, sintesi chimica, e l&#39;isolamento di coniglio caseum. Questo lavoro è stato condotto con il finanziamento del Fondazione Bill e Melinda, premio # OPP1044966 e OPP1024050 a V. Dartois, NIH Shared Strumentazione di Grant S10OD018072, così come il finanziamento congiunto da parte della Fondazione Bill e Melinda Gates e Wellcome Trust per un centro di eccellenza per l&#39;ottimizzazione di piombo per malattie del mondo in via di sviluppo di P. Wyatt.

Tutti gli studi sugli animali sono stati eseguiti in conformità alla Guida per la cura e l&#39;uso degli animali da laboratorio degli Istituti Nazionali di Salute con l&#39;approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l&#39;uso degli animali della NIAID (NIH) di Bethesda, MD. Tutti gli studi riguardanti la M. tuberculosis sono stati eseguiti in un laboratorio con livello di contenimento della biosicurezza 3 (BSL-3). 1. Modello di infezione del coniglio e collezione di Caseum <ol><li> Infettare conigli bianchi della Nuova Zelanda con M. tuberculosis utilizzando un sistema di esposizione agli aerosol solo a naso come descritto in precedenza. 12 , 13 Lasciare che l&#39;infezione progredisca per 12-16 settimane. Sedate i conigli con 35 mg / kg di ketamina e 5 mg / kg di xilazina intramuscolare, eutanalizzare i conigli con 0,22 mL / kg di pentobarbital sodico e fenytoina sodico per via endovenosa e procedere con le necropsie. </li><li> Usando le pinzette e un bisturi, rimuovi i polmoni dalla cassa caVITY. Da ogni lobo del polmone, disseccare singole cavità e grandi granulomi necrotici utilizzando un bisturi. Raschiare correttamente il caseum dalla parete di cavità e granuloma. Pesare, registrare e conservare campioni in 2 mL tubi a vite a -20 ° C fino all&#39;uso pronto. </li><li> Gamma-irradia i campioni infetti di caso in 3 MegaRad su ghiaccio secco per renderli ininfluenti e sicuri per l&#39;uso in un laboratorio BSL-2. </li></ol> 2. In vitro generazione di Caseum Surrogate da cellule THP-1 <ol><li> Crescono monociti THP-1 nel mezzo RPMI 1640 (2 mM L-glutamina e 10% siero fetale bovino) in tazze di coltura T175 (80 mL / pallone). Incubare le fiasche in un&#39;atmosfera al 5% di CO 2 a 37 ° C per 3-4 giorni. </li><li> Centrifugare la coltura da una fiala T175 in due tubi conici da 50 mL a 150 xg per 5 min. Scartare il surnatante e sospendere il pellet in 10 ml di supporti RPMI 1640. </li><li> Pipettare 5 μL di questa coltura in un tubo da 1,5 mL contenente 45 μL di tblu rypan. Mescolare accuratamente pipettando. Trasferimento 10 microlitri ad un emocitometro e contare il numero di vitali THP-1 monociti (non colorati) utilizzando un microscopio ottico (ingrandimento 10X). Calcolare il numero di cellule vitali per ml della cultura. Diluire con mezzi RPMI alla densità finale di 1,25 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Carico 40 mL di coltura su una grande piastra di coltura cellulare (50 x 10 6 cellule / piastra). Aggiungere 40 ml di 100 mM PMA (forbolo 12-myristate13-acetato preparata in etanolo) e consentono alle cellule di aderire durante la notte in incubatrice. NOTA: concentrazione finale di PMA è 100 nm. </li><li> Diluire acido oleico puro (OA) (0,89 g / ml) in etanolo alla concentrazione di 0,1 M (cioè 31,7 microlitri OA a 968,3 ml di etanolo). Diluire questa soluzione in acqua dolce dei media RMPI pre-riscaldato a una concentrazione di 10 mm. Diluire questa sospensione OA di 0,4 mM (concentrazione finale di lavoro) in terreno RPMI pre-riscaldato a 37 ° C. </li><li> Rimuovere i media e non esistenticellule -adhered dalle piastre di coltura cellulare e delicatamente aggiungono 40 mL di 0,4 mM OA ai macrofagi THP-1 (THP-M). Incubare a 37 ° C in incubatore notte. </li><li> Utilizzare un microscopio ottico a 40 ingrandimenti per confermare visivamente la presenza di numerose inclusioni lipidiche corpo in ogni THP-M. Rimuovere tutti mezzo RPMI dalle piastre di coltura cellulare e lavare delicatamente le cellule aderenti due volte con tampone fosfato isotonico (PBS) usando una pipetta sierologica 50 mL. NOTA: corpi lipidici appaiono come piccole, chiare, strutture sferiche nel citoplasma della THP-M. </li><li> Aggiungere 40 ml di 5 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) in PBS per ciascuna piastra. Incubare per 15 minuti a 37 ° C. </li><li> Staccare i macrofagi schiumosi (FM) ripetutamente pipettando su e giù sulla superficie di tutta la piastra usando una pipetta sierologica 10 mL. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 50 ml e centrifugare a 150 xg per 5 min. </li><li> Risospendere il pellet cellulare in 10 ml di PBS (terzo lavaggio PBS) unIl trasferimento in un tubo conico pre-pesato da 15 ml. Spin giù di nuovo a 150 xg per 5 minuti. Aspira attentamente il surnatante usando una pipetta sierologica e scartare. </li><li> Sostituire i pellet FM a 3 cicli di congelamento-scongelamento per liscivare le cellule e incubarle a 75 ° C per 20-30 min per denaturare proteine ​​nella matrice. Conservare i pellet a -20 ° C fino a quando non sarà pronto per l&#39;uso. </li></ol> 3. Analisi della dialisi rapida di equilibrazione (RED) <ol><li> Preparare soluzioni di 10 mM di tutti i composti di prova in dimetilsolfossido (DMSO). Diluire fino a 500 μM soluzioni di lavoro in DMSO prima di ogni dosaggio. </li><li> Pesare il tubo contenente il pellet surrogato di caso. Sottrai il peso del tubo vuoto per ottenere il peso del pellet da sola. Aggiungere 2-3 branelli metallici per tubo e, utilizzando un omogeneizzatore a 1,200 colpi / min per 1 min, interrompere il caso o la matrice surrogata in PBS (1: 9 w / v) per ottenere una sospensione diluita di 10 volte di ciascuna matrice. </li><li> Spike 6.5 μL del 500ΜM del composto in esame in 643,5 μL dell&#39;omogenato per ottenere la concentrazione finale di 5 μM (≤1% DMSO) e vortex. </li><li> Posizionare gli inserti ROSSI nella piastra di base. Aggiungere in una camera di ricevente 200 μL della matrice a spruzzo a farmaci nella camera donatrice (anello rosso) di ciascun inserto RED e 350 μL di PBS. Preparare 3 inserti per ciascun composto di prova (campioni triplicati). Piastra di tenuta con una guarnizione di piastra adesiva e incubare a 37 ° C sul termomexer a 200 giri / min (1 g) per 4 h. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, mescolare delicatamente il contenuto della camera donatore e ricevente pipettando su e giù 2-3 volte. Pipettare 20 μL aliquote di omogeneate dalle camere donatrici e aggiungere 20 μl di PBS pulito in un tubo da 1,5 ml (1: 1). Allo stesso modo, pipettare 20 μL aliquote di campioni PBS dalle camere ricevitore e aggiungere 20 μL di homogenate pulito (corrispondenza matrice). 8 NOTA: la corrispondenza matrice elimina il nePer 2 curve separate di calibrazione (in omogeneo e PBS) da effettuare per l&#39;analisi quantitativa. Il contenuto della camera donatrice può sedimentarsi nel tempo. Mescolare delicatamente il contenuto pipettando prima di rimuovere le aliquote. </li></ol> 4. Quantificazione LC-MS e analisi dei dati <ol><li> Aggiungere 160 μl di metanolo 1: 1: acetonitrile contenente 500 ng / ml diclofenac o 10 ng / mL verapamil (standard interno) ad ogni tubo e vortex per precipitare le proteine. Centrifugare a 10.000 xg per 5 minuti per sedimentare il precipitato e trasferire i supernatanti in piatti a pozzetto a 96 pozzetti per l&#39;analisi di spettrometria di massa cromatografica-massa (LCMS). 7 </li><li> Creare curve di calibrazione da 1-1.000 nM per ogni composto di prova mantenendo la stessa composizione della matrice come i campioni di cui sopra. Quantificare la concentrazione del composto di prova nei campioni provenienti dalle camere donatori e riceventi utilizzando un metodo LC-MS. </li><li> Calcola la frazione non legata ( f u ) of farmaco nella matrice diluito utilizzando l&#39;equazione 1. Calcolare il f u in matrice diluito con l&#39;equazione 2 (D = fattore di diluizione di 10). 14 <img alt="equazione 1" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq1.jpg" /> <img alt="equazione 2" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq2.jpg" /></li><li> Controllare il recupero (bilancio di massa) di ciascun composto usando l&#39;equazione 3 per identificare i composti con la stabilità / metabolismo / non specifici problemi vincolanti. NOTA: Il recupero di solito cade tra il 70% e il 130%. 15 <img alt="equazione 3" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq3.jpg" /></li></ol>

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Non ci sono interessi finanziari concorrenti.

lesioni necrotiche polmonari e cavità in pazienti infettati tuberculosis contengono sottopopolazioni di batteri che sono recalcitranti al trattamento farmacologico. I nuclei caseosi di queste strutture sono particolarmente responsabili per ospitare queste persistenti in un ambiente extracellulare. 16 la distribuzione favorevole di agenti anti-batterici in questi luoghi remoti si crede di essere un importante determinante di efficacia della tubercolosi farmaco. Prima della convalida di questo prot...

Il trattamento della malattia della tubercolosi polmonare richiede una distribuzione efficace di farmaci in diversi tipi di lesioni. Le lesioni e le cavità nocrotiche contengono centri caseosi che ospitano sottopopolazioni di batteri tolleranti o &quot;persistenti&quot;. 1 , 2 La malattia cavitaria è associata a tassi di cura inferiori e prognosi scarsa. 3 , 4 Precedenti studi hanno mostrato, utilizzando tecniche quantitative e di imaging, che la capacità di penetrare nel caso è significativamente diversa da una classe di medicinali all&#39;altra. 5 , 6 Questi metodi richiedono tuttavia l&#39;uso di modelli di infezione animale che sono lenti e noiosi. È stato progettato un dosaggio in vitro che misura il legame di farmaci al caso caso ex vivo . Questo legame è stato trovato a correlare inversamente con la penetrazione di farmaci nei granulomi casiosi e, di conseguenza, èUtilizzato come strumento predittivo. 7 La dialisi di equilibrio è considerata come l&#39;approccio standard gold standard per studi di legame proteico plasmatico. Il dispositivo rapido di dialisi di equilibrio (RED) fornisce un sistema veloce, facile da usare e affidabile per eseguire tali analisi. 8 Il dispositivo è costituito da due componenti: inserti monouso, monouso composti da due camere separate da un cilindro verticale di membrana semipermeabile; E piastre base riutilizzabili che possono contenere fino a 48 inserti alla volta. La membrana di dialisi ha un cut-off di peso molecolare di 8 kDa (MWCO) che è l&#39;ideale per studi di legame con farmaci e macromolecole. L&#39;elevato rapporto superficie / volume del compartimento della membrana consente una rapida dialisi e un equilibratura. Sia gli inserti che la piastra di base sono stati convalidati per un minimo legame non specifico. La combinazione del dispositivo RED con tecniche bioanalitiche fornisce accurate stime delle frazioni non legate di farmaci in pLasma. 8, 9 Sebbene originariamente progettato per misurare proteine ​​plasmatiche, il dispositivo RED è stato utilizzato in vari tessuti studi di binding utilizzando omogenati. 10, 11 In questo protocollo, si misurano farmaco legame caseum, i detriti necrotici asportato dalle lesioni necrotiche e cavità di conigli tubercolosi infettati. La natura acellulare e non vascolare di materiale caseoso è facilissimo omogeneizzare in una sospensione omogenea che è compatibile con il saggio. Dato che caseum è noioso da produrre e difficili da trovare, il protocollo è anche stato convalidato per l&#39;uso con una matrice surrogata che viene preparato da macrofagi schiumosi. THP-1 derivate da monociti macrofagi vengono indotte con acido oleico di accumulare più corpi lipidiche che conferiscono loro aspetto &#39;schiumosa&#39;. Queste cellule lipidiche-caricati vengono raccolte eelaborati per produrre una matrice che usiamo come surrogato caseum. Questo studio ha dimostrato che farmaci legame a questa matrice surrogata correla bene con legame caseum, mimando efficacemente il processo in vivo che ostacola la penetrazione farmaco nel nucleo caseosa di granulomi e cavità.

<table><tbody><tr><td>Conigli bianchi della Nuova Zelanda</td><td></td> Covance-HN878 <td></td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis</td><td>BEI Risorse</td><td>NR-13647&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ketathesia (Ketamina) 100 mg/mL C3N</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Anased (Xilazina) 100 mg/mL</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol (pentobarbital sodico e fenitoina sodica) Soluzione&nbsp;</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>linea cellulare monocitica THP-1</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>175 cm&sup2; Pallone trattato con TC (T175)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-3400-175</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 terreni senza glutammina</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino iclonato, irradiato con gamma</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3091003IR</td><td></td></tr><tr><td>Iclone L-glutammina, 200 mM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>Piastra TC Cellstar, 145 mm x 20 mm, ventilato</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-2881-1</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP685-1</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Acido oleico&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN15178101</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di base riutilizzabile per dispositivo Pierce RED</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-89811</td><td></td></tr><tr><td>Inserti per dispositivi Pierce RED, 50/scatola&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-89809</td><td></td></tr><tr><td>Strumento di rimozione dell'inserto Pierce RED&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>89812</td><td></td></tr><tr><td>Guarnizione adesiva</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-408-240</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4, 10x 500 mL (Gibco)&nbsp;</td><td>Tecnologie per la vita&nbsp;</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Verapamil cloridrato</td><td>Sigma</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Diclofenac sale sodico</td><td>Sigma</td><td>93484</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di tripano blu, 0,4%</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo, 200 proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>2010 Geno/Grinder</td><td>SPEX SamplePrep</td><td>2010</td><td></td></tr><tr><td>Omogeneizzatore per mulino di perline, perline di metallo sfuse Fisher</td><td>Scientific</td><td>15-340-158</td><td></td></tr><tr><td>484R Cobalto 60 Irradiatore</td><td>JL Shepard</td><td>7810-484-1</td><td></td></tr><tr><td>INCYTO&nbsp; Ematocitometri monouso C-Chip</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-600-100</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio ottico verticale</td><td>Leica</td><td>DM1000</td><td></td></tr><tr><td>Sistema binario di cromatografia liquida</td><td>Agilent</td><td>1260</td> Spettrometro <td>di massa multi-compenente</td></tr><tr><td></td><td>AB Sciex</td><td>4000</td><td></td></tr></tbody></table>

un<em&gt; in vitro</em&gt; test di rilascio di caseum che prevede la penetrazione di farmaci nelle lesioni della tubercolosi

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

L&#39;eradicazione della malattia di tubercolosi richiede regimi farmacologici che possono penetrare negli strati multipli di lesioni polmonari complesse. La distribuzione dei farmaci nei corpi caseosi delle cavità e delle lesioni è particolarmente cruciale perché ospitano sottopopolazioni di batteri tolleranti ai farmaci comunemente indicati come persistenti. I metodi esistenti per la misura della penetrazione di farmaci nelle lesioni della tubercolosi comportano costi costosi e che richiedono molto tempo gli studi farmacocinetici in vivo accoppiati a tecniche bioanalitiche o di imaging. La misura in vitro della legame di farmaci a macromolecole di caso è stata proposta come un&#39;alternativa a tali tecniche in quanto tale legame ostacola la diffusione passiva delle molecole di farmaco attraverso il caso. La dialisi di equilibrio rapido è un sistema veloce e affidabile per eseguire studi di legame tra proteine ​​plasmatiche e tessuti. In questo protocollo abbiamo usato un dispositivo rapido di dialisi di equilibrio (RED) per misurare il legame dei farmaci a homogenati del casoDalle lesioni e dalle cavità dei conigli infetti da tubercolosi. Il protocollo descrive anche come generare una matrice surrogata da macrofagi THP-1 caricati da lipidi da utilizzare in sostituzione del caso. Questo test di associazione di caso / surrogato è uno strumento importante nella scoperta di droga della tubercolosi e può essere adattato per aiutare a studiare la distribuzione dei farmaci nelle lesioni o negli ascessi causati da altre malattie.

Usando questo protocollo, abbiamo testato centinaia di composti di sviluppo della droga della tubercolosi per la loro efficacia prevista a penetrare nel caso. La figura 1 mostra i concetti base del test RED. La membrana di dialisi degli inserti RED permette alle piccole molecole non legate di diffondere dal pozzo del donatore al pozzo del ricevitore, raggiungendo infine un equilibrio tra i due compartimenti. Piccole molecole che sono legate a macromolecole come proteine ...

Qui si descrive un metodo rapido equilibrio di dialisi (RED) per misurare farmaco legame caseum da lesioni tubercolosi polmonare e cavità. Il protocollo viene utilizzato anche con una matrice macrofagi derivato schiumosa che è un surrogato efficace caseum.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Test di rilascio di Caseum che prevede la penetrazione di farmaci nelle lesioni della tubercolosi

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è prevedere il legame dei farmaci al caseum proveniente da lesioni tubercolari. Questo metodo può aiutare a determinare quanto efficacemente gli antimicrobici penetrino nel nucleo caseoso delle lesioni necrotiche, senza ricorrere a modelli animali né a tecniche di imaging costose. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni utili per la scoperta diretta di trattamenti contro la tubercolosi, può essere applicato anche ad altre malattie caratterizzate dalla formazione di lesioni o ascessi in cui la penetrazione del farmaco è limitata.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché la coerenza nell'esecuzione del protocollo garantirà la riproducibilità dei dati tra esperimenti diversi. Oggi illustrerò la procedura di coltura cellulare e la preparazione della matrice surrogata. Hsin-pin, un collaboratore di ricerca del nostro laboratorio, mostrerà il saggio corretto.Coltivare i monociti THP-1 in fiaschi per coltura cellulare di tipo T-175 contenenti 80 mL di mezzo RPMI 1640, con 2 millimolar di l-glutammina e 10 percento di siero fetale bovino. Incubare i fiaschi a 37 gradi Celsius con cinque percento di anidride carbonica per tre o quattro giorni. Una volta che le cellule hanno raggiunto una confluenza di circa il 70 percento, suddividerle in due provette coniche da 50 mL e centrifugarle a 150 ×g per cinque minuti.Dopo la centrifugazione, eliminare il soprannatante e sospendere il pellet in 10 mL di mezzo RPMI 1640. Pipettare cinque microlitri di questa coltura in un tubo da 1,5 mL contenente 45 microlitri di blu di tripano. Mescolare accuratamente mediante pipettaggio.Trasferire 10 microlitri su un emocitometro. Contare il numero di monociti THP-1 vitali utilizzando un microscopio ottico con un ingrandimento di 10x. Dopo aver determinato il numero di cellule vitali per millilitro della coltura, diluire con mezzo RPMI fino a raggiungere una densità finale di 1,25 × 10⁶ cellule per millilitro.Aggiungere 40 microlitri di PMA 100 micromolare al tubo. Successivamente, trasferire la coltura in una piastra per colture cellulari da 140 per 20 millimetri. Lasciare aderire le cellule tutta la notte nell'incubatore.Successivamente, diluire l'acido iliaico puro in etanolo fino a una concentrazione di 0,1 molare. In questo caso, 31,7 microlitri di acido iliaico vengono sciolti in 968,3 microlitri di etanolo. Diluire la soluzione in mezzo RPMI fresco e preriscaldato fino a una concentrazione di 10 millimolare.Diluire la sospensione di acido iliacico a una concentrazione finale di lavoro di 0,4 millimolare in mezzo RPMI preriscaldato a 37 gradi Celsius. La diluizione dell'acido iliacico nei mezzi RPMI preriscaldati è fondamentale per garantire una dissoluzione sufficiente dell'acido grasso in soluzione acquosa. Utilizzando una pipetta, rimuovere il mezzo esistente e le cellule non aderenti dalla piastra di coltura cellulare contenente macrofagi THP-1, quindi aggiungere delicatamente 40 mL di acido iliacico 0,1 millimolare.Incubare a 37 gradi Celsius nell'incubatore durante la notte. Il giorno successivo, utilizzare un microscopio ottico con un ingrandimento di 40x per confermare visivamente la presenza di numerose inclusioni di corpi lipidici nei macrofagi THP. I corpi lipidici appaiono come piccole strutture sferiche chiare nel citoplasma.Rimuovere tutto il mezzo RPMI dalla piastra di coltura cellulare e lavare delicatamente le cellule aderenti due volte con PBS, utilizzando una pipetta sierologica da 50 mL. Aggiungere 40 mL di EDTA 5 millimolare in PBS alla piastra. Incubare per 15 minuti a 37 gradi Celsius.Successivamente, per staccare i macrofagi schiumosi, utilizzare una pipetta siringa da 10 mL ed eseguire ripetuti movimenti di pipettaggio su tutta la superficie della piastra. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 50 mL e centrifugare a 150 ×g per cinque minuti.Dopo la centrifugazione, risospendere il pellet cellulare in 10 mL di PBS e trasferirlo in un tubo conico da 15 mL pre-pesato. Centrifugare nuovamente a 150 ×g per cinque minuti. Quindi aspirare con attenzione il soprannatante utilizzando una pipetta serologica e scartarlo.Sottoporre le palettes di macrofagi schiumosi a tre cicli di congelamento-scongelamento. Alternare tra ghiaccio secco e incubazione a 37 gradi Celsius su un blocco termico per lisare le cellule. Successivamente, incubarle a 75 gradi Celsius per 20-30 minuti per denaturare le proteine nella matrice.Conservare le palette a meno 20 gradi Celsius fino al momento dell'utilizzo. I dispositivi di equilibrio rapido, o saggio RED mostrati in questa sezione del video, possono essere eseguiti utilizzando sia la matrice surrogata appena preparata sia il materiale caseoso proveniente da lesioni di conigli infetti da TB. Qui mostreremo il saggio così come viene eseguito sulla matrice surrogata.Preparare soluzioni stock a 10 millimolari di tutti i composti in prova. In questo caso, la moxifloxacina viene preparata in DMSO. Diluire a soluzioni operative di 500 micromolari in DMSO prima di ogni saggio.Posizionare il tubo contenente il caseum escisso o la matrice surrogata. Sottrarre il peso del tubo vuoto per ottenere il peso del caseum o della matrice surrogata da solo. Aggiungere due o tre sfere metalliche per ogni tubo, quindi aggiungere PBS in un rapporto di uno a nove in peso su volume. Utilizzando un vortex, disgregare il caseum o la matrice surrogata per un minuto.Aggiungere 6,5 microlitri del composto in prova preparato a 643,5 microlitri dell'omogenato. Per raggiungere la concentrazione finale di cinque micromolare, vortexare. Successivamente, posizionare gli inserti rossi nella piastra di base.Preparare gli inserti per ogni test, ogni composto in triplicato. Aggiungere 200 microlitri di matrice addizionata con il farmaco nella camera donatrice rossa di ciascun inserto rosso. Quindi aggiungere 350 microlitri di PBS in ciascuna camera ricevente.Applicare un sigillo adesivo sulla piastra e incubarla a 37 gradi Celsius sul miscelatore termico a 200 rotazioni al minuto per quattro ore. Al termine dell'incubazione, mescolare delicatamente il contenuto delle camere donatrici e riceventi aspirando e dispensando due o tre volte con una pipetta. Trasferire 20 microlitri di omogeneato da ciascuna delle camere donatrici in 20 microlitri di PBS fresco in un tubo da 1,5 mL.Allo stesso modo, trasferire aliquote di 20 microlitri di campioni di PBS dalle camere riceventi a 20 microlitri di omogenato fresco. L'abbinamento della matrice elimina la necessità di creare due curve di visione del colore separate, una per l'omogenato e una per il PBS, necessarie per l'analisi quantitativa. Il contenuto della camera donatrice si deposita nel tempo.Mescolare delicatamente il contenuto mediante pipettaggio prima di prelevare aliquote. Aggiungere 160 microlitri di una miscela uno a uno di metanolo e acetonitrile, contenente 500 nanogrammi per millilitro di diclofenac o 10 nanogrammi per millilitro di verapamil, in ciascun tubo come standard interno. Vortexare per precipitare le proteine.Centrifugare a 10000 x g per cinque minuti per sedimentare il precipitato, quindi trasferire i soprannatanti in piastre a pozzetti profondi da 96 pozzetti per l'analisi mediante cromatografia liquida con spettrometria di massa, LCMS. Costruire curve di calibrazione da uno a 1000 nanomolari per ciascun composto in prova effettuando diluizioni della soluzione madre del composto, mantenendo la stessa composizione della matrice dei campioni. Quantificare la concentrazione del composto in prova nei campioni provenienti dalle camere donatrici e riceventi utilizzando un metodo LCMS.Calcolare la frazione libera, o fu, del farmaco e della matrice diluita, utilizzando l'equazione uno mostrata qui. Successivamente, calcolare la fu nella matrice non diluita utilizzando l'equazione due, dove D è uguale a un fattore di diluizione di 10. Infine, verificare il recupero o il bilancio di massa di ciascun composto utilizzando l'equazione tre mostrata qui.Per identificare composti con problemi di stabilità, metabolismo o legame non specifico. Si noti che il recupero è tipicamente compreso tra il 70 percento e il 130 percento. Il protocollo descritto in questo video è stato utilizzato per testare centinaia di composti in sviluppo per la tubercolosi per valutarne l'efficienza prevista nel penetrare il caseum.La membrana dialitica degli inserti rossi permette alle piccole molecole non legate di diffondere dal pozzetto donatore al pozzetto ricevente, raggiungendo infine un equilibrio tra entrambi i compartimenti. Le piccole molecole legate a macromolecole come proteine o lipidi rimangono intrappolate nel pozzetto donatore. L'analisi quantitativa dei campioni prelevati da entrambi i compartimenti consente il calcolo della frazione non legata, fu, di ciascuna piccola molecola nella matrice di caseina o in una matrice surrogata, come mostrato in questo caso.Più alto è il valore di fu, maggiore è la diffusione del farmaco nel caseum. È stata eseguita la spettrometria di massa con ionizzazione per desorbimento laser assistita da matrice, o imaging mediante spettrometria di massa MALDI, per sei farmaci. Vengono mostrate qui le mappe ioniche di lesioni polmonari rappresentative, in cui l'intensità del segnale è indicata dalla barra della scala a sinistra.Di seguito sono mostrati gli colorazioni con ematossilina ed ESN o HNE di sezioni adiacenti. Le linee di contorno in bianco e nero evidenziano il centro caseoso di ciascuna lesione. Questi dati sono coerenti con l'ipotesi secondo cui le molecole del farmaco diffondono nella zona esterna del caseum a partire dall'interfaccia con gli strati cellulari della lesione.Il legame alle macromolecole caseose intrappola il farmaco, impedendogli di diffondersi ulteriormente nel nucleo caseoso. Come mostrato qui, la matrice preparata da macrofagi schiumosi derivati da THP-1 rappresenta un surrogato efficace del caseum reale. Il legame in entrambe le matrici mostra una forte correlazione reciproca.Seguendo questa procedura, è possibile testare contemporaneamente diversi composti, risparmiando tempo e risorse. Definiamo questo approccio test in cassetta. Da quando è stato sviluppato, questo saggio è stato utilizzato da numerosi programmi di ottimizzazione dei composti attivi nella scoperta di farmaci antitubercolari.Non dimenticare che lavorare con micobatteri e campioni di tessuto infetto da tubercolosi può essere estremamente pericoloso, e pertanto deve essere utilizzato un protocollo validato di sterilizzazione del tessuto, mediante radiazione gamma, prima di manipolare campioni di tessuto infetto in un laboratorio di livello di sicurezza biologica 2 (BSL2). Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.

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Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Fonte: Sarathy, J. P. et al. Un test in vitro di legame del caseo che prevede la penetrazione del farmaco nelle lesioni della tubercolosi. J. Vis. Exp. (2017)Questo video mostra un test in vitro per misurare il legame del farmaco al caseo dalle lesioni della tubercolosi utilizzando la dialisi rapida all'equilibrio. Descrive i passaggi per la preparazione delle sospensioni del caseo, l'esecuzione della dialisi e il calcolo della frazione del farmaco non legata per prevedere la penetrazione del...

Misurazione del legame del farmaco al caseo dalle lesioni tubercolari tramite il metodo della dialisi a equilibrio rapido

Questo video dimostra un test per valutare l'efficacia dei farmaci contro l'infezione da Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Viene generato un modello di infezione in vitro contenente aggregati di Mtb/macrofagi che imita l'infezione in vivo. Dopo l'introduzione di antibiotici adeguati, la loro efficacia viene testata tramite il dosaggio della resuzarina per monitorare la sopravvivenza dei batteri con l'aumentare delle concentrazioni di farmaci.

Un test per valutare l'efficacia di un farmaco contro un modello di infezione da Mycobacterium tuberculosis

Questo video dimostra un test in brodo per determinare l'efficacia degli antibiotici contro il Mycobacterium tuberculosis. La coltura batterica viene incubata con diverse concentrazioni di un antibiotico battericida. L'efficacia battericida viene misurata valutando la presenza di batteri vitali utilizzando un test della resazurina.

Valutazione dell'efficacia di un composto di prova contro i micobatteri in brodo

Qui descriviamo un saggio fenotipico applicabile agli schermi ad alta produttività /alto contenuto di RNA sintetico (siRNA), composto chimico e librerie mutanti Mycobacterium tuberculosis. Questo metodo si basa sul rilevamento di Mycobacterium tuberculosis con etichetta fluorescente all'interno di una cellula ospite etichettata fluorescentmente utilizzando la microscopia confocale automatizzata.

Un test fenotipico microscopico per la quantificazione dei micobatteri intracellulari adattati per lo screening ad alta produttività / alto contenuto

Il saggio charcoal agar resazurin a(CARA) è un metodo semi-quantitativo a medio rendimento per valutare l'attività degli agenti di prova contro i micobatteri che si replicano, non si replicano o entrambi.  Il CARA consente una rapida valutazione dell'attività dipendente dal tempo e dalla concentrazione e identifica i parametri da perseguire mediante saggi di unità formanti colonie (CFU).

Visualizzazione del carbone Agar resazurina Assay per semi-quantitativa, medio-throughput enumerazione dei micobatteri

Abbiamo sviluppato un sistema di screening ad alto rendimento modulare per scoprire nuovi composti contro Mycobacterium tuberculosis, il targeting intracellulare e in brodo coltura di batteri e citotossicità contro la cellula ospite di mammifero.

Sistema per l&#39;efficacia e la citotossicità Proiezione di inibitori di targeting intracellulare<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Nuovi modelli e saggi che migliorerebbero il processo di sviluppo precoce dei farmaci antitubercolari di prossima generazione sono altamente auspicabili. Qui, descriviamo un test rapido, economico e compatibile con BSL-2 per valutare l'efficacia del farmaco contro il Mycobacterium tuberculosis che può essere facilmente adattato per lo screening ad alto rendimento.

Un test compatibile high-throughput per valutare Drug efficacia contro macrofagi diversi passaggi<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Qui, descriviamo un protocollo utilizzando laser capture microdissection accoppiato con analisi LC/MS spazialmente-quantificare distribuzioni di droga all'interno dei granulomi della tubercolosi polmonare. L'approccio ha ampia applicabilità a quantificare le concentrazioni di farmaco all'interno di tessuti ad alto dettaglio spaziale.

Spaziali quantificazione delle droghe nelle lesioni di tubercolosi polmonare di Laser Capture Microdissection liquido cromatografia spettrometria di massa (LCM-LC/MS)

La determinazione delle unità formanti colonie (CFU) è la tecnica gold standard per quantificare i batteri, tra cui il Mycobacterium tuberculosis che può richiedere settimane per formare colonie visibili. Qui descriviamo un micro-CFU per la determinazione di CFU con una maggiore efficienza temporale, una riduzione dello spazio di laboratorio e del costo dei reagenti e la scalabilità per esperimenti a media e alta produttività.

Saggio dell'unità formante microcolonie per la valutazione dell'efficacia dei vaccini contro la tubercolosi

Questo studio ha sviluppato un test per lo screening ad alto rendimento contro Mycobacterium abscessus con un ceppo doppio reporter di recente creazione, utilizzando la fluorescenza e la luminescenza per valutare rapidamente la vitalità batterica. Questo protocollo sarà rilevante per i ricercatori che mirano a selezionare nuovi farmaci contro questo batterio resistente ai farmaci.

Sviluppo di saggi per lo screening di farmaci ad alto rendimento contro i micobatteri

Scopri il metodo RED per misurare il legame dei farmaci al caseum nelle lesioni tubercolari. Questa tecnica di dialisi rapida sostituisce i modelli animali e offre un'alternativa economica per studiare la penetrazione antimicrobica.

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