Name: Nuovo metodo di analisi per Cold nocicezione in Drosophila Le larve (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Impara un nuovo metodo di analisi per la nocicezione fredda in larve di Drosophila utilizzando una sonda Peltier personalizzata. Questa tecnica consente di quantificare i comportamenti evocati dal freddo e identificare geni coinvolti nei meccanismi del dolore.

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Ringraziamo Sarah Wu e Camille Graham per lo sviluppo di prime fasi del saggio freddo della sonda, il Bloomington Drosophila Stock Center per gli stock Fly, ed i membri del laboratorio Galko per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH NRSA (NIH F31NS083306) per HNT, e dal NIH R01NS069828, R21NS087360 e Università del Texas MD Anderson Clark Fellowship nella ricerca di base a MJG.

1. Preparazione di larve <ol><li> Sollevare azioni o incroci genetici in un incubatore a 25 ° C. <ol><li> Se la coltura di una croce, utilizzare 20-25 femmine vergini e 15-20 maschi per flaconcino contenente regolare dei media farina di mais mosca. Consentire femmine depongono le uova per circa 48 ore prima di trasferirli ad un nuovo flacone di cibo. </li></ol></li><li> 4-5 giorni dopo lay uovo, raccogliere 3 ° larve instar del genotipo desiderato spruzzando delicatamente un flusso d&#39;acqua nel cibo incurvato e larve, e versare il contenuto in una scatola di Petri pulito medie (60 mm x 15 mm). </li><li> Successivamente, ordinare delicatamente larve formato usando pinze o un pennello per precludere maggiore &quot;vagare 3 ° instar&quot; o piccole larve malato di essere testato. Scartare larve contenente eventuali marcatori genetici indesiderate o di bilanciamento. </li><li> Avere un compagno di piatti a base di etichette membri laboratorio o contenitori in cui le larve ordinato verrà posizionato in modo che lo sperimentatore può essere &quot;cieco&quot; per la excondizione Perimental o il genotipo delle larve, se applicabile. Lo sperimentatore può applicare etichette decodificati i dati raccolti dopo l&#39;esperimento utilizzando una chiave generata da un laboratorio-membro. </li><li> Utilizzando uno scoopula, trasferire una monetina piccola quantità di alimenti freschi in (35 mm x 10 mm o 60 mm x 15 mm) etichettata e pulita piastra di Petri riempita a metà strada con acqua a temperatura ambiente. </li><li> Spostare delicatamente le larve ordinato sul cibo (per evitare la fame o disidratazione se il test è previsto per prendere più di 20 minuti) con pinze o pennello. </li></ol> 2. freddo Probe Assay <ol><li> Accendere l&#39;unità sonda di freddo che permette a pochi minuti che si raffreddi alla temperatura desiderata. Se l&#39;impostazione a temperature più basse, la formazione di condensa è probabile che si formano lungo la sonda. </li><li> Eliminare l&#39;umidità in eccesso con un laboratorio wipe prima dell&#39;applicazione per la larva. Quando non è in uso immediato, posto isolante tappo sulla sonda sia isolare e per mantenere la punta pulita e prevenire danni. </li><li> Posizionare una metà 3 ° larva su un pezzo sottile di vinile mobile scuro (tipicamente, utilizzare un piccolo pezzo tagliato da un legante notebook) sotto un microscopio a campo luminoso. Gli aiuti di vinile nero a contrasto e la visualizzazione in movimento la larva senza toccarlo per allinearlo correttamente con la sonda. </li><li> Regolare il microscopio (vedi Tabella Materiali) e parabola (vedi Tabella Materiali) a luminosità media (50-75% luminosità max) per fornire contrasto ed impedire la larva si secchi troppo rapidamente. </li><li> Eliminare qualsiasi larve che non prima esposizione normale locomozione peristaltica come potrebbero confondere i risultati. La larva dovrebbe essere umido dalla piastra di Petri di acqua altrimenti la larva si attacchi al vinile inibizione normale locomozione. L&#39;acqua non deve pozza intorno alla larva. </li><li> Avanzare la sonda manualmente verso la larva ad un angolo di 90 ° rispetto all&#39;asse del corpo anteroposteriore, utilizzando il vinile per spostare la larva in corposizione rect (vedere Figura 1A). </li><li> Orientare la punta della sonda per gettare delicatamente sulla superficie dorsale metà della larva con la sonda ad un angolo di circa 45 ° alla fase microscopio. </li><li> In caso di contatto della sonda, avviare un timer di laboratorio. Applicare abbastanza pressione verso il basso per far rientrare leggermente la superficie della cuticola larvale pur consentendo avanti o arretramento. </li><li> Tenere la sonda in posizione per un massimo di 10 s o fino a quando si osserva una risposta comportamentale evocata freddo - a seconda di quale si verifica prima. Quindi rimuovere la sonda. </li><li> Registrare la risposta comportamentale osservato e la latenza di risposta. Le larve che non risponde entro 10 s sono considerati &quot;non-responder&quot;. La latenza può essere registrato anche per responder e utilizzati per misurare cambiamenti nella risposta robustezza / ampiezza. </li><li> Eliminare larva e preparare il prossimo. </li><li> Ripetere i passaggi 2,3-2,11 fino a raggiungere il numero desiderato di test di larve (tre serie di n = 20-40 larve erano used qui). </li></ol>

<ol><li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).</li>
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<li>Hwang, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Curr Biol. 17 (24), 2105-2116 (2007).</li>
<li>Im, S. H., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pokes%2C+sunburn%2C+and+hot+sauce%3A+Drosophila+as+an+emerging+model+for+the+biology+of+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Pokes, sunburn, and hot sauce: Drosophila as an emerging model for the biology of nociception.</a> Dev Dyn. 241 (1), 16-26 (2012).</li>
<li>Milinkeviciute, G., Gentile, C., Neely, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+tool+for+studying+the+conserved+genetics+of+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a tool for studying the conserved genetics of pain.</a> Clin Genet. 82 (4), 359-366 (2012).</li>
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<li>Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+mechanosensory+transduction%3A+mechanoreception-defective+mutations+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila.</a> Neuron. 12 (6), 1195-1206 (1994).</li>
<li>Tsubouchi, A., Caldwell, J. C., Tracey, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+filopodia%2C+Ripped+Pocket%2C+NOMPC%2C+and+NMDARs+contribute+to+the+sense+of+touch+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Dendritic filopodia, Ripped Pocket, NOMPC, and NMDARs contribute to the sense of touch in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 22 (22), 2124-2134 (2012).</li>
<li>Yan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+NOMPC+is+a+mechanotransduction+channel+subunit+for+gentle-touch+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation.</a> Nature. 493 (7431), 221-225 (2013).</li>
<li>Tracey, W. D. Jr, Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((painless%2C+a+Drosophila+gene+essential+for+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">painless, a Drosophila gene essential for nociception.</a> Cell. 113 (2), 261-273 (2003).</li>
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<li>Grueber, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134 (1), 55-64 (2007).</li>
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<li>Zhou, Y., Cameron, S., Chang, W. T., Rao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+directional+change+after+mechanical+stimulation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Control of directional change after mechanical stimulation in Drosophila.</a> Mol Brain. 5, 39(2012).</li>
<li>Im, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tachykinin+acts+upstream+of+autocrine+Hedgehog+signaling+during+nociceptive+sensitization+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila.</a> Elife. 4, e10735(2015).</li>
<li>Babcock, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+regulates+nociceptive+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization.</a> Curr Biol. 21 (18), 1525-1533 (2011).</li>
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<li>Galko, M. J., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+genetic+analysis+of+wound+healing+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular and genetic analysis of wound healing in Drosophila larvae.</a> PLoS Biol. 2 (8), E239(2004).</li>
<li>Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Drosophila+larvae+to+study+epidermal+wound+closure+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation.</a> Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).</li>
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</ol>

Una domanda di brevetto negli Stati Uniti (CL) è in corso sulla progettazione della sonda fredda. Ulteriori informazioni sui dettagli dei numeri di parte della sonda fredda e la costruzione, nonché la consulenza per la realizzazione di strumento verranno forniti su richiesta.

Il test qui descritto può essere utilizzato per valutare qualitativamente e quantitativamente nocicezione o sensibilizzazione nocicettiva in larve di diversi background genetici, influenze ambientali, e / o le condizioni di danno-indotta. Poiché questo test consente di applicare focale di uno stimolo freddo, con questo strumento si può valutare la funzione di un sottoinsieme di neuroni sensoriali periferici specificamente in risposta alle basse temperature. È interessante notare che questi comportamenti evocati freddo s...

Drosophila ha dimostrato di essere molto utile per l&#39;identificazione di nuovi geni conservati e circuiti neuronali che sottendono comportamenti complessi. Mosche forniscono un sofisticato toolkit genetico e un sistema nervoso semplificato che permettono precisa manipolazione genetica e neuronale 1, 2, 3, 4 per sezionare le basi cellulari e molecolari della nocicezione 5, 6, 7. Larve sono particolarmente utili per queste analisi, dato che saggi comportamentali per tocco delicato 8, 9, 10, 11 calore nocive, 12, 13 e sensazione meccanica di stimoli nocivi 4, </sup&gt; 11 sono già stati stabiliti, e la cuticola larvale trasparente permette l&#39;imaging dal vivo o fisso dell&#39;epidermide e neuroni sensoriali sottostanti. Recentemente, un saggio per freddo nocivo è stato anche sviluppato 7, che descriveremo in maggior dettaglio qui. Utilizzando una multa sonda fredda, conico-punta, mostriamo che Drosophila larve presentano un insieme di comportamenti reattivi specifici a freddo, distinto da comportamenti osservati durante la locomozione normale, seguito tocco delicato, o dopo duro stimolo meccanico temperatura o alta 7, 8, 11 . I comportamenti specifici a freddo includono un robusto contrazione tutto il corpo (CT), una 45-90º aumento dei segmenti posteriori (PR) e un aumento simultaneo del segmenti anteriore e posteriore in una forma ad U (US). La prevalenza di questi comportamenti aumenta con temperature decrescenti ma ciascuno picchi sleggermente diverse temperature fredde. Lavori recenti suggeriscono che le risposte CT sono mediati da diversi neuroni sensoriali periferici rispetto a quelle che rispondono a calore nocive o dura stimoli meccanici 7. Proprio come nocicettori vertebrati, Drosophila dendritiche multipla (md) neuroni sensoriali periferici hanno strutture dendritiche complesse che arborize oltre l&#39;epidermide 1. neuroni md sono presenti in ogni segmento corporeo larvale, proiettando loro assoni al cordone nervoso ventrale 14. neuroni sensoriali md sono suddivisi in quattro classi differenti (I-IV) basati sulla morfologia dendritica e hanno diverse funzioni sensoriali 4, 9, 10, 15, 16, 17. Mentre i neuroni classe IV sono necessari per larvali risposte rollio lateralea temperature elevate o rigide stimoli meccanici 4, classe III neuroni sono necessari per delicato tocco risposte 9, 10 e non solo sono attivati dal freddo, ma sono necessarie anche per le risposte comportamentali evocati freddo 7. Entrambi i neuroni classe III e IV utilizzano potenziali canali discreti transient receptor (TRP) per facilitare risposte comportamentali ai nociva 7, 11, 18 e stimoli 9, 10, 17, 19 non-nocivo. Inoltre, nocicezione larvale è sensibilizzato infortunio seguito, a livello cellulare 20 e comportamentali 12, 21. Il saggio descritto qui consente la quantification di una normale o potenzialmente alterato risposte comportamentali a basse temperature che variano da nocivi freddo (≤ 10 ° C), freschi innocui (11-17 ° C), a temperatura ambiente (18-22 ° C). Le temperature fredde utilizzati in questo test è in grado di attivare direttamente classe III neuroni sensoriali, suscitando robusti, aumenta calcio riproducibili e risposte comportamentali evocati freddo, che possono essere qualitativamente e quantitativamente analizzati 7. Questo test può essere applicato a larve di qualsiasi genotipo nonché di larve esposto a diverse condizioni ambientali (alimentazione alterato, lesioni, agenti farmacologici) per determinare i fattori sia genetici e ambientali che hanno un impatto nocicezione freddo, la sensibilizzazione nocicettiva e la plasticità nocicettivo. Dato che thermosensation è onnipresente in molte specie, questo test fornisce un valido strumento per lo studio della nocicezione e può scoprire bersagli gene nuovi o interazioni neuronali che migliorerannola nostra comprensione della nocicezione vertebrati. La sonda a freddo su misura (vedi sonda fredda, Table of Materials) utilizza una temperatura controllata ad anello chiuso dispositivo Peltier, che raffredda l&#39;albero alluminio e punta conica per conduzione termica. Un termistore è incorporato all&#39;interno della punta conica alluminio riporta la temperatura in tempo reale sulla centralina. Un dissipatore di calore e la ventola sono fissati al modulo termoelettrico per regolare il carico del effetto Peltier calore (Qc) e quindi l&#39;intervallo di temperatura desiderato (22-0 ° C) può essere realizzato (vedi Unità di controllo termico, Table of Materials). Lo stimolo nocivo freddo della punta della sonda freddo viene applicato a mano alla linea mediana dorsale, a segmento (s) equidistante dalle estremità anteriori e posteriori (circa segmento A4, vedere Figura 1A) della larva. In risposta a stimoli freddi, larve generalmente producono uno dei tre comportamenti evocati freddo a 10 s cut-off: un corpo pienocontrazione (CT), un aumento di 45-90º segmento anteriore e posteriore in una forma ad U (USA), oppure un aumento dei segmenti posteriori (PR) (descritto in Risultati). Nessuno di questi comportamenti vengono eseguite durante la normale locomozione peristaltica o comportamento di foraggiamento. Questi comportamenti sono anche distinti da risposte tocco delicato e la risposta di laminazione avversione ad alte temperature o nocivi stimoli meccanici.

<table><tbody><tr><td>Sonda a freddo</td><td>Pro-Dev Engineering</td><td>Costruito su misura su richiesta</td> I <td>numeri di parte e i dettagli costruttivi possono essere forniti su richiesta</td></tr><tr><td>Unità di controllo termico</td><td>Tecnologia TE</td><td>Custodia costruita su misura</td><td>I numeri di parte e i dettagli costruttivi possono essere forniti su richiesta</td></tr><tr><td>Microscopio Zeiss Stemi 2000</td> Illuminatore <td></td><td></td> ad alta intensità Zeiss NT55-605 <td></td></tr><tr><td>Fiber-Lite MI-150</td><td>Industrie Dolan-Jenner.</td><td>A20500</td><td></td></tr><tr><td>Schott Dual Gooseneck 23 pollici guida luminosa in fibra ottica</td><td>Schott North America, Inc.</td><td>Schott A08575</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>FST</td><td>FS-1670</td><td>Utilizzato per selezionare e maneggiare le larve. Assicurarsi di levigare e smussare leggermente le punte delle pinze per ridurre il rischio di perforare o ferire accidentalmente le larve</td></tr><tr><td>Pennello</td><td>Dick Blick Art Materials</td><td>06762-1002</td><td>Utilizzato per selezionare e maneggiare le larve. È utile se il pennello è umido durante l'uso.</td></tr><tr><td>Piastra di Petri in polistirene da 35 mm x 10 mm</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 10 mm Piastra di Petri in polistirene</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Pezzo di vinile nero (almeno 2 pollici x 2 pollici)</td><td></td><td></td><td>Utilizzato per fornire contrasto e orientare le larve alla sonda fredda</td></tr><tr><td>Fisherbrand Spatola Scoopula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td>Utilizzato per spostare il cibo</td></tr><tr><td>Kimtech Science Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td>Utilizzato per asciugare le larve e sonde fredde in caso di umidità in eccesso</td></tr></tbody></table>

nuovo metodo di analisi per cold nocicezione in<em&gt; drosophila</em&gt; le larve

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Come gli organismi di percepire e reagire a temperature nocivi è ancora poco conosciuta. Inoltre, i meccanismi sottostanti sensibilizzazione della macchina sensoriale, come nei pazienti con neuropatia periferica o sensibilizzazione lesioni indotte, non sono ben caratterizzati. Il modello Drosophila geneticamente trattabili è stato utilizzato per studiare le cellule e geni necessari per il rilevamento calore nocive, che ha dato più geni conservati di interesse. Poco si sa tuttavia sulle cellule e recettori importanti per il rilevamento freddo nocivi. Anche se, Drosophila non sopravvive l&#39;esposizione prolungata a temperature fredde (≤10 ° C), ed eviterà fresco, preferendo le temperature più calde in saggi preferenze comportamentali, come essi percepiscono e possibilmente evitare stimoli freddi nocivi è stato recentemente indagato solo. Qui si descrive e caratterizzare i primi freddi nocive (≤10 ° C) del test comportamentaleDrosophila. Con questo strumento e il dosaggio, mostriamo un investigatore come valutare qualitativamente e quantitativamente i comportamenti nocicettivi freddi. Questo può essere fatto in condizioni di coltura normali / sane, o presumibilmente nel contesto della malattia, infortunio o sensibilizzazione. Inoltre, questo test può essere applicato a larve selezionato per genotipi desiderati, che potrebbero avere un impatto thermosensation, dolore, o sensibilizzazione nocicettiva. Dato che il dolore è un processo altamente conservato, da questo test per studiare ulteriormente nocicezione termica sarà probabilmente raccogliere importanti comprensione dei processi di dolore in altre specie, tra cui vertebrati.

Drosophila larve movimento con un movimento peristaltico che comprende pause occasionali, curve testa, e cambiamenti di direzione 22. In risposta alla domanda focale di uno stimolo nocivo freddo tuttavia, larve presentano un insieme di comportamenti unici, a differenza del rullo laterale aversive di calore nocive e stimoli meccanici. Questi comportamenti sono anche diversi dalle risposte al tocco delicato 8, <sup class="...

Qui mostriamo un nuovo metodo di analisi per studiare nocicezione freddo in Drosophila larve. Questo dosaggio utilizza una sonda custom-built Peltier in grado di applicare una focale stimolo freddo nociva e si traduce in comportamenti specifici a freddo quantificabili. Questa tecnica consentirà un&#39;ulteriore dissezione cellulari e molecolari della nocicezione freddo.

Nuovo metodo di analisi per Cold nocicezione in<em&gt; Drosophila</em&gt; Le larve

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

L'obiettivo generale di questo saggio sul freddo nocivo è quello di poter quantificare e valutare i cambiamenti nella percezione del freddo da innocuo a nocivo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della nocicezione, tra cui l'identificazione di nuovi geni conservati coinvolti nella nocicezione al freddo e dei modulatori delle risposte al dolore in caso di malattia o lesione. Il principale vantaggio di questa tecnica è che permette una manipolazione precisa dello stimolo termico nocivo e la quantificazione delle risposte indotte dal freddo in diversi contesti ambientali e genetici.Generalmente, i principianti con questo metodo dovranno esercitarsi ad applicare in modo costante la sonda prima di iniziare un esperimento. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo scoperto che i larve di drosophila rispondono al calore nocicettivo e siamo diventati curiosi di sapere se reagiscono allo stesso modo al freddo nocicettivo. Allevare ceppi o incroci genetici di drosophila in un incubatore a 25 gradi Celsius.Nota: se si coltiva un incrocio, utilizzare da 20 a 25 femmine vergini e da 15 a 20 maschi per provetta contenente mezzo standard a base di farina di mais e coltivare per circa 48 ore prima di trasferire le mosche in una nuova provetta con alimento. Cinque giorni dopo l'avvio della coltura, raccogliere le larve di terzo stadio del genotipo desiderato spruzzando delicatamente un getto d'acqua nel cibo molle e nelle larve. Successivamente, versare il contenuto in una piastra di Petri pulita di dimensioni medie.Successivamente, separare delicatamente le larve in base alla dimensione, utilizzando pinzette per escludere larve di terzo stadio più grandi e vaganti, oppure larve piccole e debilitate dal test. Scartare le larve che presentano marcatori genetici indesiderati o bilanciatori. Far etichettare da un altro membro del laboratorio i contenitori in cui verranno collocate le larve selezionate, in modo da mantenere l’esperimentatore cieco rispetto alla condizione sperimentale o al genotipo delle larve.Utilizzare una spatola per trasferire una piccola quantità di cibo fresco in una piastra di Petri pulita e etichettata, contenente acqua a temperatura ambiente per metà della sua capacità. Infine, utilizzare pinzette per spostare delicatamente le larve selezionate sul cibo, per prevenire la morte per fame o disidratazione, qualora il test dovesse durare più di 20 minuti. Iniziare accendendo l'unità della sonda fredda e lasciarla raffreddare per alcuni minuti fino alla temperatura desiderata.Asciugare con un panno da laboratorio qualsiasi eccesso di umidità sulla sonda. Quando non viene utilizzata immediatamente, posizionare un cappuccio isolante sulla sonda per isolare il dispositivo, mantenere la punta pulita e prevenire danni. Successivamente, posizionare una larva di terzo stadio medio su un sottile pezzo di vinile nero mobile per facilitare la visualizzazione del contrasto e l'allineamento della sonda.Quindi, posizionare questo pezzo di vinile con la larva sotto un microscopio a campo chiaro. Regolare il microscopio e l'unità luminosa su una luminosità media per ottenere un buon contrasto e impedire che la larva si secchi troppo rapidamente. Utilizzando un pennello leggermente inumidito, assicurarsi che la larva sia umida con l'acqua della piastra Petri in modo che non aderisca al vinile, quindi rimuovere l'acqua in eccesso circostante utilizzando un fazzoletto assorbente (KimWipe).Avanzare manualmente la sonda verso la larva ad un angolo di 90 gradi rispetto all'asse anteroposteriore del corpo, utilizzando il vinile per posizionare correttamente la larva. Quindi orientare la punta della sonda in modo che si appoggi delicatamente sulla superficie medio-dorsale della larva, con la sonda ad un angolo di circa 45 gradi rispetto al piano del microscopio. Al contatto della sonda, avviare un cronometro.Applicare una pressione verso il basso sufficiente a creare una leggera indentazione sulla superficie della cuticola larvale, consentendo al contempo un movimento in avanti o all'indietro. Successivamente, mantenere la sonda ferma per un massimo di 10 secondi o fino a quando non viene osservata una risposta comportamentale indotta dal freddo, a seconda di quale evento si verifichi per primo. Quindi, rimuovere la sonda.Registrare la risposta comportamentale osservata e la latenza della risposta. Prendere nota di eventuali non risponditori o larve che non rispondono entro 10 secondi. Infine, scartare la larva e preparare quella successiva.Ripetere la procedura fino a raggiungere il numero desiderato di larve da testare. Dopo il contatto con la sonda fredda, i risultati di questo esperimento indicano che le larve rispondono con i seguenti comportamenti indotti dal freddo: contrazione (CT) dei segmenti anteriore e posteriore verso il centro del corpo, sollevamento dei segmenti anteriore e posteriore nell'aria per formare una forma a U (US), sollevamento soltanto dei segmenti posteriori nell'aria (PR). Inoltre, i diversi comportamenti raggiungono il picco in intervalli di temperatura fredda differenti: PR e US raggiungono il picco tra i 3 e gli 8 gradi Celsius, mentre CT raggiunge il picco tra i 9 e i 14 gradi Celsius. Infine, confrontando le latenze dei diversi comportamenti indotti dal freddo, questi dati mostrano che le risposte CT differivano significativamente da PR e US a 3 gradi Celsius e 10 gradi Celsius, e da US a 20 gradi Celsius.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in circa 30-40 minuti per un set di 30 larve. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante prestare attenzione alla locomozione anomala, al livello di umidità della larva e alla pressione e al posizionamento della sonda fredda sulla larva stessa. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché un'applicazione impropria della sonda fredda potrebbe portare a curve di risposta dose-dipendenti differenti o all'assenza del comportamento di risposta al freddo.Al termine di questa procedura, possono essere utilizzati altri metodi, come l'analisi mediante imaging a fluorescenza, l'analisi dell'espressione genica e i saggi comportamentali. Tutti questi metodi permetteranno di determinare in che modo l'esposizione al freddo influisce sull'attività cellulare, sulla morfologia, sull'espressione genica o su altri comportamenti. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della nocicezione al freddo per studiare gli effetti genetici, ambientali e delle malattie in Drosophila.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare lo strumento e il saggio del sonda fredda per analizzare le risposte indotte dal freddo e comprendere i meccanismi cellulari e genetici della nocicezione al freddo.

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