Espressione proteica ricombinante, cristallizzazione e studi biofisici di a Bacillus -conservato nucleotide pirofosforilasi, BcMazG

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di preparare proteine ricombinanti da batteri non patogeni per facilitare studi chimici biofisici come la cristallografia a raggi X delle proteine o la cinetica enzimatica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave su come preparare una proteina ricombinante di interesse utilizzando batteri non patogeni per la caratterizzazione biofisica preliminare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la caratterizzazione biofisica della proteina di interesse può essere effettuata in qualsiasi laboratorio dotato di strumenti comuni come incubatori per colture cellulari e spettrofotometri.

Per iniziare questa procedura, preparare la reazione di legatura come descritto nel protocollo di testo. Pipettare tre microlitri della reazione di legatura preparata in una provetta contenente 50 microlitri di cellule alfa DH5 di E.coli chimicamente competenti. Utilizzando una pipetta, mescolare delicatamente la soluzione.

Ghiacciare la soluzione per 30 minuti. Successivamente, shock termico per 45 secondi a 42 gradi Celsius. Dopodiché, aggiungere un millilitro di LB di terreno e far crescere le cellule agitando vigorosamente a 250 rotazioni al minuto, a 37 gradi Celsius per 45 minuti.

Distribuire 100 microlitri di cellule trasformate su una coclea LB integrata con 100 microgrammi per millilitro di kanamicina. Incubare per 18 ore a 37 gradi Celsius. Usando una punta sterile, prelevare le colonie dalla piastra.

Far crescere le cellule in tre millilitri di terreno LB integrato con agitazione vigorosa a 250 rotazioni al minuto a 18 gradi Celsius per 18 ore. Quindi, preparare il DNA plasmatico e confermare la sequenza nucleotidica come indicato nel protocollo di testo. Dopo aver ritrasformato il ceppo di E.coli BL21, selezionare una colonia utilizzando una punta sterile e inoculare 10 millilitri di terreno LB contenente 150 microgrammi per millilitro di kanamicina.

Incubare a 37 gradi Celsius per 18 ore agitando vigorosamente a 250 rotazioni al minuto. Quindi, trasferire i 10 millilitri di coltura notturna in un litro di LB e terreno di kanamicina. Cresci a 37 gradi Celsius fino a quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge 0,7.

Quindi immergere la coltura in acqua ghiacciata per 15 minuti. Aggiungere l'IPTG alla coltura, in modo tale che la concentrazione finale sia di un millimolare. Incubare a 18 gradi Celsius per altre 16-18 ore.

Successivamente, centrifugare a 5.000 volte G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere con cautela il surnatante. Risospendere le cellule in 50 microlitri di PBS contenente 10 millimolari di imidazolo.

Quindi, lisare le cellule due volte sul ghiaccio come descritto nel protocollo di testo. Centrifugare a 25.000 volte G per 30 minuti a quattro gradi Celsius per eliminare il lisato cellulare. Quindi, mescolare tre millilitri di perle di nichel e 47 millilitri di PBS contenenti 10 millimolari di imidazolo in un tubo conico da 50 millilitri.

Il flusso per gravità è il tampone extra per depositare le perle equilibrate in una colonna cromatografica in vetro di 2,5 x 10 centimetri. Utilizzando una pipetta, trasferire il surnatante nella colonna. Incubare a quattro gradi Celsius per due ore su un arcolaio a 20 rotazioni al minuto.

Successivamente, lasciare che il surnatante defluisca per gravità. Lavare le perle di nichel tre volte utilizzando 100 millilitri di PBS contenenti 10 millimolari di imidazolo per ogni lavaggio. Quindi, applicare cinque millilitri di PBS contenente 250 millimolari di imidazolo per eluire la proteina RBC 1531.

Analizzare 15 microlitri di eluizione tramite SDS Page come indicato nel protocollo di testo. Pipettare le frazioni raccolte in una provetta per dialisi. Posizionare la provetta in un becher contenente quattro litri di tampone compatibile con la scissione della trombina a quattro gradi Celsius durante la notte.

Il giorno successivo, utilizzare una pipetta per trasferire le frazioni in una provetta conica da 15 millilitri. Misurare l'assorbanza a 280 nanometri per stimare la concentrazione proteica come indicato nel protocollo di testo. Successivamente, trasferire 50 microlitri di proteina RBC 1531 in diverse provette.

Aggiungere una quantità diversa di trombina a ciascuna provetta e incubare a 20 gradi Celsius per tre ore. Dopo aver determinato la quantità minima di trombina necessaria, aggiungere 10 milligrammi di proteine e 60 unità di trombina in una provetta da 15 millilitri. Incubare a 20 gradi Celsius per tre ore.

Quindi, trasferire la proteina digerita dalla trombina in un tubo filtrante centrifugo. Centrifugare a 3.000 volte G a quattro gradi Celsius per ridurre il volume a meno di cinque millilitri. Successivamente, applicare la proteina concentrata su una colonna cromatografica ad esclusione dimensionale preparata.

Raccogliere 60 frazioni di eluizione con 0,5 millilitri per provetta. Esegui 15 microlitri di ciascuna frazione su un gel 15% SDS Page come indicato nel protocollo di testo. Quindi combina le frazioni contenenti la proteina RBC 1531.

Per iniziare, trasferire le frazioni combinate in un tubo filtrante centrifugo. Centrifugare a 3.000 volte G a quattro gradi Celsius per concentrare la proteina a circa 18,5 milligrammi per millilitro. Quindi aggiungere 50 microlitri di ciascuna soluzione di screening della cristallizzazione ai pozzetti di una piastra di cristallizzazione a goccia da 96 pozzetti.

Aggiungere 0,5 microlitri di soluzione proteica concentrata su un lettino. Mescolare separatamente la soluzione proteica con 0,5 microlitri della soluzione a pozzetti. Coprire la piastra con pellicola adesiva trasparente.

Incubare a 18 gradi Celsius e consentire la diffusione del vapore. Utilizzando un microscopio ottico, scansiona le gocce con un ingrandimento da 20 a 40 volte per monitorare la formazione dei cristalli ogni giorno per due o tre settimane. Dopo aver preparato i substrati NTP, aggiungerli a una piastra a 96 pozzetti.

Aggiungere 20 microgrammi di proteina RBC 1531 in ciascun pozzetto utilizzando una pipetta per mescolare. Coprire la piastra con il coperchio e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, trasferire la piastra in un bagno d'acqua a 70 gradi Celsius per 15 minuti per interrompere le reazioni catalitiche mediate da RBC 1531.

Quindi, aggiungere un microlitro di pirofosfatasi inorganica di S.cerevisiae a ciascun pozzetto. Incubare a 20 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi aggiungere 16 microlitri di soluzione di acido molibdato alla piastra di reazione per sviluppare il colore.

Dopo 15 minuti, leggere la densità ottica a 690 nanometri. In questo studio il prodotto proteico del gene B grave BC1531 è caratterizzato a livello molecolare. Dopo la purificazione mediante cromatografia di affinità con nichel, viene eseguito un percorso di digestione della trombina.

0,3 unità di trombina sono considerate la quantità più bassa richiesta per rimuovere completamente l'etichetta di affinità da RBC 1531. Dopo la digestione, la proteina senza tag viene purificata a circa il 99% di purezza, utilizzando la cromatografia ad esclusione dimensionale. Quindi, lo stato oligomerico viene stimato mediante cromatografia ad esclusione dimensionale.

Poiché l'RBC 1531 viene eluito a circa 84 millilitri, il suo peso molecolare è stimato in 55 kilodalton. Il peso molecolare calcolato del monomero è di circa 13 kilodalton. Pertanto, RBC 1531 si assembla come tetramero.

Lo screening della cristallizzazione viene quindi eseguito utilizzando un metodo di diffusione del vapore a goccia seduta. I cristalli si osservano dopo due giorni con un molare di citrato di sodio e 20% di polietilenglicole 3.000 e con 0,1 molari di cacodilato di sodio e un molare di citrato di sodio. Dopo questo viene determinata l'attività NTPasi.

Non si osserva alcun cambiamento di colore visibile dopo l'aggiunta di molibdato alla reazione di idrolisi mediata da RBC 1531. Tuttavia, quando viene aggiunta la pirofosfatasi, il colore cambia in blu intenso. La densità ottica a 690 nanometri e la concentrazione di NTP vengono quindi analizzate utilizzando la regressione non lineare.

L'enzima RBC 1531 è determinato per avere una velocità massima a 0,75 e una costante di Michaelis di 10 micromolare. Durante il tentativo di questa procedura, è importante preparare campioni di proteine senza indugio e scartare le frazioni contenenti impurità che impediscono la cristallizzazione delle proteine o introducono errori nei saggi enzimatici. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'enzimologia e di altre scienze proteiche per caratterizzare le proteine di interesse con spettrofotometri decorati nella maggior parte dei laboratori.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle idee generali sulla preparazione delle proteine ricombinanti, sugli schermi di cristallizzazione e sulla cinetica enzimatica, può anche essere applicato all'analisi chimica biofisica per altre proteine di nostro interesse. Non dimenticare di fare attenzione quando lavori con le proteine, poiché possono essere estremamente instabili. Saranno desiderate precauzioni come lasciare i campioni sul ghiaccio e refrigerarli a 80 gradi per una conservazione a lungo termine.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come preparare proteine ricombinanti da batteri non patogeni per ottenere cristalli proteici per una determinazione della struttura mediante cristallografia a raggi X e come caratterizzare l'attività enzimatica utilizzando un metodo colorimetrico.