Name: Istituzione di un Bioreposito di base clinico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Impara a stabilire un biorepositorio clinico per campioni tumorali cutanei, preservando tessuti normalmente scartati dopo chirurgia Mohs. Questo protocollo integra la raccolta nelle operazioni quotidiane senza interrompere il flusso clinico, facilitando la ricerca su biomarcatori proteici e di RNA.

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Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi del Midwestern University College of Health Sciences per la Facilitazione della Ricerca, concesso a EEH e all&#39;Ufficio Midwestern Office of Research e ai Programmi Sponsorizzati Intramural Grant, assegnato a KJL. Ulteriori sostegno è stato fornito da Affiliated Laboratories e Dermatologia Affiliated. Ringraziamo Sarah Potekhen, Jamie Barto, Stefani Fawks, Cody Jording, Stacie Schimke, Heather Kissel e Ali Zaidi per la loro assistenza tecnica.

Tutta la sperimentazione sui campioni di tessuto umano è stata approvata da Western IRB (Protocollo WIRB # 20142461). Il singolo criterio per la raccolta dei tessuti per queste procedure è una diagnosi bioscopica di SCC. Nessun criterio di esclusione è stato descritto nel protocollo originale IRB, ma non sono stati utilizzati campioni di pazienti con una nota patologia trasmessa dal sangue. Il consenso informato è stato ottenuto prima della raccolta del tessuto cutaneo, del sangue e della saliva. La commissione di revisione istituzionale del Midwest ha approvato il lavoro di convalida con campioni biorepositivi basati su cliniche presso la Midwestern University (AZ # 807). 1. Trattamento cutaneo del tessuto tumorale NOTA: Questo deve essere eseguito da un histotechnologist di Mohs. <ol><li> Elaborazione del tessuto carcinoma squamoso fresco (SCC) per RNA e cultura esplosiva <ol><li> Dopo che il tessuto è stato tagliato dal chirurgo Mohs, raccogliere da 10 a 50 mg (≥10 mm 3 </sup&gt;) Dal centro del lato apicale del tessuto durante il rilassamento (che è il processo di manipolazione del tessuto per consentirlo di rimanere piatto sulla diapositiva) prima di elaborare ulteriormente. NOTA: Questo è possibile solo se il tumore è abbastanza grande per consentire la rimozione di un campione di 10-50 mg (≥10 mm 2 ) prima della valutazione istologica che fa parte della procedura Mohs. Se il tumore non è abbastanza grande per consentire la rimozione di un minimo di 2 mm 3 , non procedere con l&#39;elaborazione per l&#39;RNA (saltare la fase 5). </li><li> Trasferire il tessuto vitale a un tubo da 1,5 ml contenente un mezzo di coltura (miscela 1: 1 di DMEM: Ham&#39;s F-12, 25 mM HEPES, 100 UI / ml di penicillina e 100 μg / mL streptomicina) utilizzando le pinzette e assicurare che il Il tessuto è completamente immerso nel mezzo. Conservare questo tubo a 4 ° C prima di procedere con ulteriore lavorazione. </li><li> Utilizzare il tessuto per l&#39;analisi dell&#39;isolamento e dell&#39;espressione di RNA (vedere la fase 5) e / o lo stabilimentoDi una cultura esplante (vedere la fase 6) entro 24 h. </li><li> Posizionare il resto del campione tumorale che è stato rimosso dal paziente (punto 1.1.1) su un supporto di tessuto criostato (o &quot;mandrino&quot;). Incorporare il tessuto in un composto ottimale di taglio (OCT), congelando il tessuto all&#39;interno del supporto, per consentire il completamento dell&#39;istologia Mohs e per la preparazione di diapositive istologiche aggiuntive per l&#39;analisi sperimentale. </li></ol></li><li> Preparazione di diapositive istologiche <ol><li> Tagliare sezioni di tessuto 7 μm utilizzando un criostato e creare due (o più) diapositive per ogni campione tumorale. Assicurarsi che ciascuna diapositiva contiene fino a tre sezioni del tumore completo. NOTA: Una delle due diapositive sarà macchiata usando H &amp; E dal histotechnologist di Mohs e le slide aggiuntive possono essere elaborate con l&#39;analisi IF, IHC o FISH. </li><li> Mettere le diapositive in acetone per 1-2 secondi per fissare il tessuto. Impostare queste diapositive a parte per asciugare. Non H &amp; EMacchia o copertura del vetrino da utilizzare per la futura immunofluorescenza (IF), l&#39;immunohistochemistry (IHC) o l&#39;analisi di ibridazione in fluorescenza in situ (FISH), a seconda del protocollo sperimentale. </li></ol></li><li> Elaborazione del Tessuto Post-Mohs <ol><li> Una volta completata l&#39;elaborazione di Mohs (passaggi 1.1-1.2), lavorare nella camera di criosta e prelevare il campione dal supporto di crioconservazione e collocare il tessuto in un tubo criogenico etichettato. </li><li> Mettere la fiala etichettata in azoto liquido prima che il tessuto abbia scongelato. Se i campioni devono essere utilizzati per l&#39;analisi di proteine ​​e / o DNA, possono essere trasferiti in un azoto liquido oa un congelatore -80 ° C in pochi minuti per essere conservati per un&#39;espressione di proteine ​​future e l&#39;analisi del mutamento del DNA (vedere i passaggi 4-5) . NOTA: Se si desidera un intatto RNA dal campione post-Mohs, è fondamentale mantenere il campione congelato durante la rimozione dal mezzo di incorporazione dei criomocchi. Se la cura estrema non viene esercitataQuesto passo, il campione post-Mohs dovrebbe essere riservato per analisi proteica e / o DNA. </li></ol></li><li> Lavorazione di ANT fresco <ol><li> Al momento della chiusura Mohs, ottenere ANT dal chirurgo Mohs. </li><li> Rimuovere una quantità uguale o maggiore di ANT come raccolta dal campione SCC (vedi sopra) dal lato apicale del tessuto normale e trasferirla in un tubo da 1,5 mL etichettato contenente un mezzo di coltura (miscela 1: 1 di DMEM: Ham&#39;s F- 12 integrati con 25 mM HEPES, 100 UI / mL di penicillina e 100 μg / mL streptomicina) utilizzando pinzette. </li><li> Immergere completamente il tessuto nel medesimo mezzo di coltura e conservare a 4 ° C fino alla successiva lavorazione (vedere punti 4-6). </li></ol></li></ol> 2. Sangue, saliva e processo di tampone buccale <ol><li> Ottieni circa 10 ml di sangue nei tubi di raccolta EDTA tramite venipunzione. </li><li> Trasferire il sangue dai tubi di raccolta a un tubo sterile da centrifuga da 15 o 50 ml. Rimuovere circa 200 μl in un tubo criogenico da 1,5 ml, evitando le bolle; Conservare questo campione di sangue intero a -80 ° C, per essere utilizzato per future genotipizzazione e corrispondenza tissutale, se necessario. <ol><li> Spin il sangue rimanente a 1.000 xg per 30 minuti e seguire le procedure standard per raccogliere la frazione plasmatica. </li><li> Aliquota il plasma in incrementi di 1 ml in tubi criogenici da 1,5 ml e conservare a -80 ° C per l&#39;uso durante le future analisi bioptiche liquide. </li></ol></li><li> Utilizzare un tampone sterile per ottenere un campione di tampone buccale e memorizzare il tampone in un tubo sterile a temperatura ambiente. </li><li> Se necessario, ottenere un campione di saliva e conservare in un tubo sterile a temperatura ambiente. NOTA: Questi campioni possono essere usati per future genotipizzazioni e corrispondenza dei tessuti, se necessario. </li></ol> 3. Registrazione di campioni <ol><li> Trasferire informazioni dalla lista di controllo dei campioni dei pazienti al database biorepositivo. Includi informazioni sui pazienti e diagNosi dal grafico del paziente. </li><li> Stampare le etichette con un codice a barre per ciascun campione e registrare ciascuno nel database per collegare ogni campione raccolto con i dati del paziente. </li><li> Registrare la distribuzione dei campioni de-identificati nel database biorepositivo prima di trasferire i campioni al laboratorio di ricerca. </li></ol> 4. Isolamento della proteina e analisi del blot occidentale <ol><li> Posizionare ogni campione di tessuto (SCC e / o ANT) in un flaconcino contenente 500 μl di tampone di lisi cellulare contenente inibitori della proteasi per 100 mg di tessuto per lezzare il tessuto. NOTA: Abbiamo utilizzato un tampone per la radioimmunoprecipitazione (RIPA), composto da 50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5% sodio deossolfato, 1,0% NP-40 e 0,1% SDS. Possono essere utilizzati altri tamponi di lisi cellulare. </li><li> Homogenizzare i tessuti utilizzando un omogeneizzatore tissutale per 5 minuti in intervalli di 20 a 4 ° C. Spin i campioni a 21.000 xg e 4 ° C per 20 minuti e raccogliere il supernatante contenente la proteina in un tu frescoessere. Riaccendere il surnatante utilizzando le stesse condizioni e raccogliere il supernatante finale in un tubo fresco. </li><li> Elettroforesi 30-50 μg di proteine ​​da ciascun campione utilizzando un gel gradiente SDS-poliacrilammide 4-20%. Macellare il gel con Coomassie Blue per visualizzare le bande di proteine, se lo si desidera. </li><li> Se è necessaria un&#39;analisi Western blot di proteine ​​espresse, trasferire le proteine ​​dal gel in una membrana di PVVF (PVVF) polivinilidene secondo protocolli standard. Dopo il trasferimento, Ponceau macchia la membrana PVDF per visualizzare bande di proteine, se lo si desidera. </li><li> Bloccare la membrana e la sonda PVDF per rilevare le proteine ​​di interesse seguendo protocolli standard. Usa gli anticorpi primari specifici per le proteine ​​interessate, insieme agli anticorpi secondari corrispondenti specifici per gli anticorpi primari, a concentrazioni raccomandate dal produttore per l&#39;analisi di blot western. </li><li> Esporre la membrana esplorata usando un substrato chemiluminescente e rappresentare la membrana utilizzando un&#39;immagineNg sistema. </li></ol> 5. Isolamento di RNA e reazione a catena quantitativa di polimerasi (qPCR) <ol><li> Immediatamente inserire campioni di tessuti freschi (SCC e / o ANT) in un tubo da 1,5 mL contenente una soluzione di stabilizzazione dell&#39;RNA e inserire campioni di tessuto post-Mohs in un tubo da 1,5 ml contenente una soluzione di transizione tissutale congelata, seguendo le raccomandazioni del produttore. Assicurarsi che il tessuto sia completamente immerso. Conservare questi campioni a -80 ° C fino all&#39;uso. </li><li> Rimuovere i campioni RNA da -80 ° C e scongelare sul ghiaccio. Trasferire il tessuto a un nuovo tubo da 1,5 mL contenente 1 mL di tampone di estrazione RNA (fenolo / guanidino tiocianato) per 50-100 mg di tessuto. </li><li> Lyse i tessuti utilizzando un omogeneizzatore tissutale. Eseguire sei cicli di omogeneizzazione, seguiti da un periodo di raffreddamento del campione; Ogni ciclo è costituito da 20 s di omogeneizzazione a 4 ° C e un periodo di raffreddamento a 40 s. Dopo l&#39;omogeneizzazione, incubare il campione per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 0,2Ml di cloroformio per 1 ml di tampone di estrazione RNA e agitare vigorosamente il tubo a mano per 15 s. Incubare per 2-3 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Spin i campioni a 12.000 xg e 4 ° C per 15 minuti. Rimuovere la fase acquosa del campione e collocarla in un nuovo tubo da 1,5 ml. </li><li> Aggiungere 0,5 mL di isopropanolo al 100% per 1 mL del tampone di estrazione RNA utilizzato nella fase 5.2 alla fase acquosa e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. NOTA: Se si prevede che i rendimenti RNA siano bassi ( cioè il volume del tessuto iniziale è inferiore a 10 mg), i campioni possono essere precipitati per una notte a -80 ° C. Inoltre, 5 μg di glicogeno privo di RNasi per 500 μL di tampone di estrazione RNA può essere aggiunto durante la fase di precipitazione isopropanolo per migliorare i rendimenti di RNA. </li><li> Spin il campione a 12.000 xg a 4 ° C per 10 min. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet con 1 ml di etanolo al 75%. </li><li> Vorticala brevemente il campione e poi giri a 7.500 xg e 4 °C per 5 min. Scartare il lavaggio e asciugare il pellet per 5-10 min. </li><li> Resuspendere il pellet RNA in 20 μl di acqua priva di RNasi. <ol><li> Se si desidera, purificare ogni campione di RNA utilizzando un kit di pulizia RNA in base alle raccomandazioni del produttore. NOTA: I piccoli RNA verranno persi dal campione se viene eseguito questo passaggio. </li></ol></li><li> Elettroforesi un campione da 1 μg usando un gel agarosio di formaldeide-MOPS 1,2% per analizzare la qualità dell&#39;RNA. NOTA: in alternativa, analizzare i campioni utilizzando un bioanalizzatore per ottenere un numero RIN 13 . </li><li> Reverse-trascrono l&#39;RNA a cDNA utilizzando un protocollo di trascrizione inversa per l&#39;analisi qPCR di mRNA target (o miRNA) di interesse. </li></ol> 6. Culture intellettuali <ol><li> Sterilizzare il tessuto esclizzato prima della cultura immergendo il tessuto in etanolo del 70%. </li><li> Posizionare il tessuto su uno scivolo o piatto e aggiungere abbastanza mezzo di coltura (miscela 1: 1 di DMEM: Ham &amp; #39; s F-12 integrato con 10% FBS, 25 mM HEPES, 100 UI / mL di penicillina e 100 μg / mL streptomicina) per coprire il tessuto (per evitare che il tessuto venisse seccato). Tagliare con cautela il tessuto in frammenti (&lt;1 mm 3 ) usando una lama del bisturi. </li><li> Trasferire i frammenti di tessuto a un piatto da 35 mm di coltura tissutale e aggiungere circa 20 μL di siero fetale fetale (FBS) sopra ogni frammento. </li><li> Lasciare il piatto aperto in una cappa di cultura per 20-30 minuti, o fino a quasi asciutto. </li><li> Aggiungere a ciascun piatto 1 ml di campione di coltura (1: 1 di DMEM: Ham&#39;s F-12 con 10% FBS, 25 mM HEPES, 100 UI / mL di penicillina e 100 μg / mL streptomicina) e incubare a 37 ° C in 5% CO 2 . Se necessario, subcultura o sub-clona le culture. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Alla conoscenza dell&#39;autore, questo protocollo è il primo del suo genere che si concentra sull&#39;approvazione clinica di campioni di tessuto cutaneo in un approccio economico e veloce. I pazienti sottoposti a microchirurgia di Mohs sono in genere pianificati durante specifici blocchi di tempo e la raccolta è limitata a questi periodi. La raccolta di campioni comporta l&#39;impegno dell&#39;assistente medico coinvolto nella cura del paziente, del histotechnolog Mohs che elabora i campioni tumorali e un membro del p...

La ricerca sul cancro e sul biomarker si basa su una fornitura di campioni di tessuti umani di qualità e l&#39;offerta limitata ha ostacolato la ricerca 1 , 2 . Molti studi dermatologici sono limitati dall&#39;inadeguata offerta, qualità variabile e costi associati all&#39;uso del tessuto umano. Il costo della creazione di una grande banca bio-dedicata è stato stimato di circa due milioni di dollari3 e questi costi collocano l&#39;uso del tessuto umano fuori dalla portata di molti ricercatori. Inoltre, il processo di generazione e conservazione di campioni di ricerca pone il rischio di influenzare le operazioni cliniche e di ritardare la cura del paziente se non eseguita con attenzione. È stato stabilito un bioreposito a basso costo basato su una clinica che si concentra sui campioni di cancro della pelle seguendo le migliori pratiche raccomandate e la convalida dei campioni 4 , 5 , 6 . <pQuesto protocollo è stato sviluppato in una clinica di dermatologia che svolge un grande volume di interventi chirurgici microscopici Mohs per rimuovere il carcinoma delle cellule squamose (SCC), il carcinoma delle cellule basali (BCC) e i tumori della pelle del melanoma. I donatori volontari possono essere reclutati da questa popolazione paziente. È importante stabilire il biorepositivo nel sito della raccolta per bloccare rapidamente tessuto e sangue da pazienti autorizzati senza ritardare il trattamento. Raccogliere campioni dalla stessa clinica minimizza le variazioni nelle tecniche di raccolta e minimizza le variazioni della qualità dei campioni, che possono essere problematiche per le applicazioni a valle 7 , 8 . L&#39;obiettivo della tecnica di chirurgia microscopica di Mohs è assicurare che tutti i tessuti del cancro siano rimossi mantenendo il più possibile il tessuto sano possibile. La procedura prevede la progressiva rimozione di strati sottili di tessuto tumorale. Ogni livello successivo è il suoEsaminato tologicamente (dopo la criocuzione del tessuto tumorale e la colorazione H &amp; E) da un dermatologo per determinare se è stato rimosso tutto il tessuto tumorale. L&#39;esclusione e l&#39;esame di strati successivi di tessuti vengono eseguiti mentre il paziente rimane nell&#39;ufficio. Questa tecnica è considerata la migliore opzione di trattamento per SCC 9 . A questo punto, la ferita è chiusa e, per migliorare la guarigione e l&#39;aspetto estetico, il tessuto normale adiacente (ANT) viene spesso eliminato. Così, questa procedura chirurgica per rimuovere un tumore è ideale per raccogliere tessuto istologicamente caratterizzato per studi futuri. La procedura di aggiudicazione dell&#39;appalto per ottenere il tessuto tumorale, i tessuti normali adiacenti, la saliva e i campioni di sangue è stata progettata per avere un impatto minimo sui compiti normali del personale ( Figura 1 ). Gli assistenti medici eseguono il sangue durante la preparazione del paziente per la procedura. Dopo la conclusione della procedura Mohs, la M<html> Lo histotechnologo di OHS prepara ulteriori diapositive istologiche del campione e trasferisce il tessuto al bioreposito. I costi associati alla creazione del bioreposito includono l&#39;acquisto di congelatori di crioconservazione, la creazione di un modesto spazio di laboratorio clinico e lo sviluppo di un programma di monitoraggio delle scorte. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55583/55583fig1.jpg" /> Figura 1: sequenza di raccolta dei campioni e personale responsabile. All&#39;atto del check-in del paziente e del raggiungimento del consenso del paziente, l&#39;assistente medico raccoglie un tampone bucale e svolge un prelievo di sangue. Il dermatologo e l&#39;assistente medico poi accise il tumore e chiude la ferita, durante il quale vengono raccolti rispettivamente gli esemplari SCC e ANT. Un tecnico specializzato di laboratorio elabora il sangue e le sezioni dei campioni SCC e ANT per la coltura, la conservazione e l&#39;ingresso nel bioreposito.Ftp_upload / 55583 / 55583fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. La diversità dei campioni raccolti consente una varietà di approcci sperimentali ( Figura 2 ). I campioni raccolti dal paziente sono tamponi bucali (saliva può anche essere raccolta se necessario), sangue intero e tessuto esclasti. I tamponi bucali e un campione di tutto il sangue vengono salvati, senza elaborazione, per la genotipizzazione e il matching dei tessuti. Il sangue intero è separato in cellule del sangue bianco (WBC) e frazioni plasmatiche per analisi future. Dopo la trasformazione di Mohs, il tumore congelato viene posto direttamente in azoto liquido e trasferito a un congelatore -80 ° C. I campioni tumorali freschi, vitali e ANT vengono coltivati ​​utilizzando modifiche delle tecniche precedenti 10 , 11 e poi criopreservate. Durante la raccolta, il numero di ciascun tipo di esempio viene registrato su un foglio di calcolo prima di entrare<html> Il programma di monitoraggio dell&#39;inventario per facilitare l&#39;elaborazione accurata ( tabella 1 ). <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55583/55583fig2.jpg" /> Figura 2: Struttura della raccolta e dell&#39;elaborazione dei campioni biorepositivi basati su clinica. Un tampone e un campione di sangue buccale vengono raccolti dal paziente e memorizzati per il genotipizzazione a valle e la corrispondenza dei tessuti. Il sangue intero viene ulteriormente elaborato per l&#39;isolamento delle cellule del sangue bianco (WBC) e l&#39;analisi CTC, nonché per la raccolta del plasma e l&#39;analisi biopsia liquida. Il tessuto prelevato durante la procedura Mohs è trattato istologicamente per scopi diagnostici, dopo di che le diapositive istologiche possono essere utilizzate sperimentalmente per ulteriori analisi immunohistochemiche. A condizione che il campione di tessuto ecceduto sia abbastanza grande, una porzione di tessuto fresco viene rimossa e tagliata per isolamento proteico e RNA e per la creazione di linee cellulari colte.55583 / 55583fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Data di raccolta: </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Paziente 1 </td><td> Paziente 2 </td><td> Paziente 3 </td><td> Paziente 4 </td><td> Paziente 5 </td></tr><tr><td> Iniziali e data di nascita </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Colore degli occhi </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tipo di esempio </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Posizione campione </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Saliva </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> WBuco sangue </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Plasma </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tumore Viable </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tessuto Normale Resistente </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tumore Mohs Liquido Azoto </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tessuto normale azoto liquido </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Slides </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1: Lista di controllo per registrare le collezioni di campioni. I dati tracciati e registrati con ciascun campione raccolto comprendono le iniziali del paziente, la data di nascita e il colore degli occhi (per la tipizzazione della pelle), nonché i locatiSulla rimozione del campione. Il numero di campioni salivari, i volumi di raccolta del sangue e il numero di esemplari di tessuti vitali e conservati sono registrati anche come riferimenti per le allocazioni agli usi successivi. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55583/Table1.xlsx">Clicca qui per scaricare questo file.</a> Per convalidare le procedure di raccolta dei campioni, ciascun tipo di esempio è stato testato nelle applicazioni a valle. Utilizzando modifiche delle tecniche precedenti 12 , il tumore e ANT sono stati utilizzati con successo nell&#39;isolamento di proteine ​​e RNA e possono essere utilizzati potenzialmente per l&#39;isolamento del DNA. Le esplosioni vitali stabilite dalle sezioni del tessuto sono state valutate mediante microscopia, mentre le diapositive istologiche memorizzate sono state utilizzate per immunohistochemistry e immunofluorescenza. Seguendo il protocollo qui descritto, è possibile estendere questo modello ad altre cliniche di dermatologia, altri tipi di tumore (come il melanoma), E altre specialità e pratiche chirurgiche per fornire campioni di tessuti umani per una ricerca multidimensionale nei tumori umani. Le modifiche leggere di questo protocollo sono probabilmente necessarie per altre pratiche, ma in linea di principio questo protocollo è applicabile a qualsiasi pratica chirurgica che scarta frequentemente i campioni dei pazienti raccolti durante il trattamento del paziente.

<table><tbody><tr><td>Provette per la raccolta del sangue in plastica BD Vacutainer con K3EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>02-685-2B</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia elettronica Scienze Lame a doppio taglio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50-949-411</td><td></td></tr><tr><td>Pinze curve per uso generico a punta media</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16-100-110</td><td></td></tr><tr><td>Provette</td> <td>per microcentrifuga premiumThermoFisher Scientific</td><td>05-408-138</td><td></td></tr><tr><td>Lonza Walkersville KGM Cheratinocita Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC9791321</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia elettronica Scienze Composto TEK OCT tissutale</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50-363-579</td><td></td></tr><tr><td>Leica CM1950 Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047743909</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio smerigliati</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Rapid-Chrome H& E Kit di colorazione per sezioni congelate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>99-900-01</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Provette criogeniche per conservazione a lungo termine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>03-337-7X</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL Provette per centrifuga coniche</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Boca Scientific BuccalT-Swab&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC9679349</td><td></td></tr><tr><td>Tecnologia di segnalazione cellulare 10x tampone RIPA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50-195-822</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi e della fosfatasi ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>PI78443</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5424R Microcentrifuga</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>05-401-203</td><td></td></tr><tr><td>Omogeneizzatore</td> <td>a batteria per morter a pelletThermoFisher Scientific</td><td>12-141-3</td><td></td></tr><tr><td>Pestello a pellet senza RNAsi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>121-141-364</td><td></td></tr><tr><td>Forma SteriCycle CO2 Incubatrice</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-998-089</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Siero fetale bovino</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SH30071.02</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Advanced DMEM/F-12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-634-028</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Penicillina-Streptomicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>Gibco 1 M Hepes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15-630-130</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Coltura cellulare 35 mm con sfiato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1256591</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CFH anticorpo monoclonale clone OX-24</td><td>Abnova</td><td>MAB12583</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p40 (p63 delta) anticorpo</td><td>Abnova</td><td>ABX-144A</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti MUC-1</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-7313</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Lumaca + Lumaca (fosfo S246)</td><td>Abcam</td><td>Ab63568</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-coniglio IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Sonde molecolari di fallodina</td><td>&nbsp;</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant con</td><td>sonde molecolari DAPI&nbsp;</td><td>P36941</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Zeiss Axio Imager Z1 con fotocamera Axiocam</td><td>Zeiss</td><td>4300009901</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX51 a contrasto di fase con fotocamera DP72</td><td>Olympus</td><td>IX511F3</td><td></td></tr></tbody></table>

istituzione di un bioreposito di base clinico

Establishment of a Clinic-based Biorepository

L&#39;incidenza del cancro della pelle ( es., Carcinoma delle cellule squamose , carcinoma delle cellule basali e melanoma) è in aumento negli ultimi anni. Si prevede che ci sarà una domanda parallela per campioni tumorali cutanei per studi di ricerca biomedica. La disponibilità dei tessuti, tuttavia, è limitata a causa del costo della creazione di un bioreposito e della mancanza di protocolli disponibili per ottenere campioni clinici che non interferiscono con le operazioni cliniche. È stato stabilito un protocollo per raccogliere e elaborare campioni tumorali cutanei e associati di sangue e saliva che hanno un impatto minimo sulle procedure cliniche di routine alla data di una chirurgia Mohs. I campioni tumorali vengono raccolti e trattati da pazienti sottoposti al primo strato di chirurgia Mohs per tumori maligni cutanei provenienti da biopsia da parte del histotechnologista Mohs. Il tessuto normale adiacente viene raccolto all&#39;atto della chiusura chirurgica. Ulteriori campioni che possono essere raccolti sono sangue intero e tampone buccale. Utilizzando campioni di tessuti normalmente scartati, è stato generato un bioreposito che offre diversi vantaggi fondamentali basandosi sulla clinica rispetto all&#39;ambiente di laboratorio. Questi includono una vasta gamma di campioni raccolti; L&#39;accesso ai dischi identificati, inclusi i rapporti patologici; E, per il tipico donatore, l&#39;accesso a campioni aggiuntivi durante le visite di follow-up.

Tumore e ANT sono stati utilizzati con successo in isolamento proteico e testati da blotting occidentale. Come mostrato nella figura 3 , i marker di carcinoma cutanee squamose cutanee (Muc1 14 , FHL-1 15 e p40 16,17 ) possono essere rilevati nei campioni dei pazienti raccolti e conservati nel nostro bioreposito in base alla clinica. <img al...

I tumori cutanei vengono spesso scartati dopo la chirurgia microscopica di Mohs. Qui viene descritto un protocollo che consente al personale di supporto clinico di elaborare e memorizzare in modo efficace campioni tumorali cutanei ( ad esempio, carcinoma delle cellule squamose, carcinoma delle cellule basali e melanoma) per applicazioni di laboratorio a valle senza interferire con le operazioni cliniche.

Istituzione di un Bioreposito di base clinico

The incidence of skin cancer (e.g., squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma, and melanoma) has been increasing over the past several years. It is ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è consentire al personale di supporto clinico in una struttura dermatologica di elaborare ed archiviare efficacemente campioni di tumori cutanei per successive applicazioni di laboratorio, senza interferire con le normali operazioni cliniche. Questo protocollo è stato concepito per permettere agli assistenti medici e agli istotecnici Mohs di raccogliere e conservare campioni di tumori cutanei per futuri progetti di ricerca biomedica, come parte integrante delle loro attività cliniche quotidiane. Il principale vantaggio di questo protocollo consiste nel raccogliere e preservare tessuti escissi che normalmente verrebbero scartati e distrutti, utilizzando procedure che impattano minimamente sulle operazioni cliniche di routine.La varietà di campioni raccolti permette di stabilire correlazioni tra biomarcatori proteici e dell'RNA nei campioni di tessuto e di plasma con i dati sugli esiti dei pazienti. In linea di principio, questo protocollo, una volta leggermente modificato, è applicabile a qualsiasi pratica chirurgica che scarti regolarmente campioni dei pazienti raccolti nel corso del trattamento. A dimostrare la procedura saranno Stefani Fawks, istotecnico specializzato in chirurgia di Mohs, e il dottor Mitchell Manway, ricercatore ospite nella nostra struttura.Per iniziare, utilizzare il tessuto ricevuto dal chirurgo Mohs e, con un bisturi, escindere un campione di 10-50 milligrammi dal centro della faccia apicale del tessuto. Con pinzette, trasferire il tessuto vitale in un tubo da 1,5 millilitri etichettato, pre-riempito con mezzo di coltura. Assicurarsi che il tessuto sia completamente immerso nel mezzo.Collocare il campione in un frigorifero e conservarlo a quattro gradi Celsius, per non più di 24 ore prima di un'ulteriore lavorazione. Raccogliere almeno un frammento di tessuto di 10 millimetri cubi dal lato apicale del tessuto escisso, quando il campione tumorale è sufficientemente grande e tale rimozione non interferirà con la procedura di routine di Mohs. Successivamente, posizionare il campione tumorale rimanente non lavorato su un supporto per tessuti del criostato.Incorporare il tessuto in un composto ottimale per la temperatura di taglio e congelarlo all'interno del supporto per preparare vetrini istologici. Utilizzando un criostato, tagliare il tessuto in sezioni spesse sette micron e sovrapporre fino a tre sezioni su un vetrino. Dopo il taglio, fissare il tessuto immergendo i vetrini in acetone per uno o due secondi.Quindi, lasciare asciugare le lamelle all'aria. Mantenendo il campione residuo all'interno di una camera criostatica, staccare il tessuto dal mezzo di inclusione criogenico ed trasferirlo in un tubo criogenico etichettato. Trasferire immediatamente il tubo etichettato in azoto liquido.Il trasferimento del tessuto in una provetta criogenica dopo la lavorazione con tecnica di Mohs deve essere eseguito nella camera del criostato a meno 20 gradi Celsius. Se eseguito correttamente e se il tessuto viene mantenuto congelato, questo passaggio permetterà l'estrazione con successo di RNA da campioni di tessuto post-Mohs. Successivamente, ottenere un tessuto normale adiacente dal chirurgo specializzato in tecnica di Mohs.Asportare un campione dal lato apicale del tessuto normale adiacente. Successivamente, utilizzando pinzette, trasferire il campione asportato in una provetta da 1,5 millilitri etichettata contenente mezzo di coltura. Immergere il tessuto nello stesso mezzo di coltura.Collocare in un apposito sacchetto per campioni e conservare a quattro gradi Celsius fino all'elaborazione successiva. Raccogliere circa 10 millilitri di sangue venoso in provette da prelievo rivestite con EDTA. Unire i campioni di sangue in un tubo centrifuga sterile da 15 millilitri.Successivamente, trasferire circa un millilitro del campione di sangue in un tubo criogenico da 1,5 millilitri, evitando la formazione di bolle. Conservare questo campione di sangue intero a meno 80 gradi Celsius fino al successivo genotipaggio e abbinamento dei tessuti. Successivamente, centrifugare il campione di sangue rimanente a 1000 ×g per 30 minuti per ottenere il plasma sanguigno.Dopo la centrifugazione, raccogliere e dividere il plasma in aliquote di un millilitro in provette criogeniche da 1,5 millilitri. Conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius per utilizzi futuri nelle analisi di biopsia liquida. Inserire i dati del modulo di controllo dei campioni dei pazienti, insieme alle informazioni e alla diagnosi del paziente, sottratti dalla cartella clinica, nel database della biorepository.Infine, registrare il posizionamento dei campioni anonimizzati nel database della biorepository e trasferire i campioni al laboratorio di ricerca. Immediatamente dopo, trasferire i campioni di tessuto in provette da 1,5 millilitri, precedentemente riempite con soluzioni di estrazione adeguate, assicurandosi che il tessuto sia completamente immerso. Conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius fino all'ulteriore elaborazione.Di seguito sono riportate le immagini di immunoblotting rappresentativi di noti marcatori del carcinoma a cellule squamose, mucina uno, FHL-uno e p40, ottenuti per tessuto normale adiacente e un campione tumorale. La qualità dell'RNA isolato dai campioni di Mohs è stata inizialmente valutata mediante elettroforesi su gel, seguita dall'analisi dell'integrità dell'RNA. I valori del numero di integrità dell'RNA ottenuti per i campioni normali e tumorali indicano che è stato ottenuto un RNA di alta qualità e integro.I profili di citometria delle bande sono stati riportati come unità di fluorescenza rispetto al numero di nucleotidi per campioni rappresentativi di RNA provenienti da tessuto tumorale e tessuto normale del paziente. Un espianto di tessuto da carcinoma a cellule squamose è stato analizzato mediante microscopia a contrasto di fase ed è risultato essere una coltura mista di cheratinociti e fibroblasti, che potrebbe essere sottoculturata o utilizzata per lo sviluppo futuro di linee cellulari. Infine, nelle sezioni di tessuto da carcinoma a cellule squamose, è stata evidenziata una colorazione positiva per il marcatore della transizione da epiteliale a mesenchimale.Una volta padroneggiato, questo protocollo ridurrà il flusso di lavoro standard del personale clinico a meno di 30 minuti, se eseguito correttamente. La maggior parte dei passaggi viene effettuata dal personale clinico già esistente al termine dell'assistenza al paziente. Durante l'applicazione di questo protocollo, è fondamentale mantenere una registrazione accurata, collegando i campioni alla storia clinica e alla diagnosi del paziente.Poiché queste informazioni sono spesso necessarie per applicazioni successive, questa tecnica contribuirà a tracciare la strada per i ricercatori nel campo della dermatologia verso lo sviluppo di biopsie liquide e biomarcatori nei carcinomi a cellule squamose e nel melanoma. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come implementare un biorepository basato su ambiente clinico per campioni di cancro cutaneo, generati nell'ambito della pratica quotidiana.

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Istituzione di umano epiteliali Enteroids e Colonoids dal tessuto intero e biopsia

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