Preparazione e caratterizzazione di novel nanoparticelle che imitano HDL per l'incapsulamento del fattore di crescita del nervo

L'obiettivo generale di questo articolo è presentare metodi di preparazione e caratterizzazione per nanoparticelle che imitano le lipoproteine ad alta densità caricate con fattore di crescita nervoso. È stata utilizzata una semplice omogeneizzazione per preparare nanoparticelle normali che imitano le lipoproteine ad alta densità. La procedura è semplice e facilmente scalabile.

Inoltre, la nanoparticella ha notevolmente migliorato l'efficienza di incapsulamento, anche per NGF e APOA1 all'interno delle nanoparticelle. Sono state superate diverse sfide nella caratterizzazione di una nanoparticella, tra cui la separazione dell'NGF non incapsulato dalle nanoparticelle di NGF, la conduzione di studi affidabili sul raggio in vitro e la valutazione della biodisponibilità delle nanoparticelle di NGF. Per iniziare, mescolare 10 microlitri di NGF con 10 microlitri di protamina USP in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri e lasciare in riposo per 10 minuti a temperatura ambiente per formare il complesso.

Successivamente, aggiungere 59 microlitri di fosfatidilcolina e 11 microlitri di sfingomielina in un vial di vetro. Aggiungere inoltre 4 microlitri di fosfatidilserina, 15 microlitri di oleato di colesterile e 45 microlitri di succinato di tocoferile polietilenglicole. Mescolare ed evaporare l'etanolo sotto un flusso delicato di azoto per circa cinque minuti.

Tutti gli eccipienti dovrebbero formare un sottile film oleoso sul fondo della provetta di vetro. Aggiungere un millilitro di acqua ultrapura nella provetta e omogeneizzare a 9.500 giri al minuto per cinque minuti a temperatura ambiente per formare le nanoparticelle prototipo, o NP. Successivamente, aggiungere il complesso preparato alle NP prototipo.

Incubare la sospensione a 37 gradi Celsius per 30 minuti con agitazione, utilizzando una piccola barretta magnetica nel vial di vetro. Raffreddare le NP agitando a temperatura ambiente per altri 30 minuti. Dopo il raffreddamento, aggiungere 106 microlitri di apolipoproteina A-1 ed agitare a temperatura ambiente tutta la notte per formare le NP finali di NGF che imitano le HDL.

Misurare la dimensione delle particelle e il potenziale zeta utilizzando un analizzatore di particelle seguendo le istruzioni del produttore. Una colonna cromatografica a filtrazione su gel reticolata viene utilizzata per separare il NGF non incapsulato dai nanoparticelle mimetiche dell'HDL contenenti NGF e per determinare l'efficienza di incapsulamento del NGF. Per la preparazione della colonna, trasferire 15 millilitri di sospensione di sepharose 4B CL in un becher da 50 millilitri.

Agitare delicatamente la sospensione di perle e versarne una parte in una colonna. Tamporre leggermente la colonna per eliminare le bolle d'aria. Lasciare defluire il solvente e permettere alle perle di sedimentare per alcuni minuti.

Continuare ad aggiungere la sospensione rimanente. Sciacquare la parete interna della colonna per pulire le perle. Far defluire il solvente fino a quando il livello del solvente si trova leggermente al di sopra della parte superiore della fase stazionaria.

Quindi, lavare e condizionare la colonna con 20 millilitri di soluzione salina fosfato al 1X. Per misurare l'efficienza di intrappolamento del NGF, caricare 200 microlitri di NPs mimetiche delle HDL contenenti NGF sulla colonna ed eluire con PBS 1X. Come in precedenza, raccogliere un totale di 12 frazioni da un millilitro ciascuna.

Pretendere otto tubi da dialisi seguendo le istruzioni del produttore. Aggiungere 30 millilitri di mezzo di rilascio in un tubo da centrifuga da 50 millilitri. Successivamente, riscaldarlo a 37 gradi Celsius in uno shaker con una velocità di agitazione di 135 rpm.

Chiudere il tubo da dialisi e collocarlo nel mezzo di rilascio. Prelievare rapidamente 100 microlitri del mezzo di rilascio dall'esterno del tubo da dialisi come campione per il tempo zero. Mettere immediatamente il campione a meno 20 gradi Celsius per analisi successive.

Aggiungere 100 microlitri di mezzo di rilascio fresco nel tubo da centrifuga per sostituire il campione prelevato. Quindi, avviare il cronometro. A 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 e 72 ore, prelevare 100 microlitri del mezzo di rilascio e sostituirli con 100 microlitri di mezzo fresco.

Posizionare immediatamente i campioni prelevati a meno 20 gradi Celsius per analisi successive. Dopo un'omogeneizzazione di tre minuti, sono state ottenute dimensioni delle particelle costanti per le nanoparticelle prototipiche. Le nanoparticelle finali di NGF avevano dimensioni di 170 nanometri con una distribuzione dimensionale stretta e monodispersa.

NGF non caricato e le nanoparticelle sono stati completamente separati sulla colonna di filtrazione su gel. Le nanoparticelle sono state eluite nelle frazioni due, tre e quattro. La misurazione mediante ELISA ha indicato che NGF libero è stato eluito dalla frazione 7 alla frazione 10.

L'efficienza di incapsulamento calcolata per il NGF è stata di circa il 66%. Qui viene mostrato il rilascio in vitro delle nanoparticelle di NGF. Aggiungendo PBS e BSA al mezzo di rilascio, il NGF libero ha attraversato la membrana dialitica con un recupero superiore all'85%. Al contrario, le nanoparticelle di NGF hanno mostrato un profilo di rilascio lento, con circa il 10% del NGF rilasciato dalle nanoparticelle nell'arco di 72 ore. Le nanoparticelle di NGF hanno stimolato l'uscita dei neuriti nelle cellule PC12 in misura simile a quella del NGF libero.

La crescita dei neuriti è stata chiaramente osservata al microscopio per entrambi i gruppi quando la dose era di 50 nanogrammi per millilitro. Le nanoparticelle di NGF hanno notevolmente aumentato la concentrazione plasmatica e ridotto l'assorbimento di NGF nel fegato, nei reni e nella milza dei topi. Le nanoparticelle simili all'HDL hanno assistito il NGF, consentendo una lunga emivita nella stabilità in vivo.

Una volta acquisita padronanza, nanoparticelle monodisperse possono essere preparate in tre minuti utilizzando un metodo di omogeneizzazione, a condizione che venga eseguito correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare un flusso delicato di azoto per evaporare il solvente e assicurarsi che non rimanga alcun residuo lipidico aderente alle pareti del contenitore dopo l'omogeneizzazione. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare nanoparticelle che imitano le HDL utilizzando un metodo di omogeneizzazione e di come caratterizzare nanoparticelle caricate con NGF.