Isolamento Droplet per l'analisi quantitativa dei lipidi Spettrometria di Massa

L'obiettivo generale dell'isolamento delle goccioline lipidiche per spettrometria di massa quantitativa è comprendere la funzione di questi organelli, ad esempio nella replicazione di agenti patogeni come il virus dell'epatite C. Questo metodo può rispondere a domande fondamentali nel campo delle malattie infettive, come ad esempio perché gli agenti patogeni si legano alle goccioline per replicarsi. L'isolamento delle goccioline lipidiche può essere eseguito in sei o sette ore.

E durante questa procedura, è importante evitare la contaminazione da cheratina. Per iniziare, prelevare 50 millilitri da ciascuna bottiglia di mezzo DMEM e aggiungere 50 millilitri di siero fetale bovino dializzato. Successivamente, sciogliere 50 milligrammi di lisina marcata con carbonio 13 e 50 milligrammi di arginina marcata con carbonio 13 in un millilitro di mezzo.

Mescolare accuratamente e aggiungere gli amminoacidi al mezzo DMEM più FCS. Quindi aggiungere PenStrep e il sostituto del glutammato. Filtrare sterilmente il mezzo utilizzando un filtro da 0,45 micron ed etichettare la bottiglia come mezzo SILAC pesante.

Per preparare il mezzo leggero, ripetere questi passaggi utilizzando 50 milligrammi di arginina e 50 milligrammi di lisina. Etichettare la bottiglia come mezzo SILAC leggero. Tripсинizzare le cellule e suddividerle in due pozzetti di una piastra per colture a sei pozzetti.

Un pozzetto deve contenere due millilitri di mezzo SILAC pesante e l'altro due millilitri di mezzo SILAC leggero. Coltivare le cellule per almeno sei passaggi. Dopo sei passaggi, l'inserimento degli amminoacidi pesanti dovrebbe essere superiore al 95%. Raccogliere un milione di cellule delle popolazioni marcate pesante e leggera per analizzare l'efficacia dell'inserimento.

Dopo aver lavato le cellule in PBS 1X, raccoglierle mediante centrifugazione per cinque minuti a 160 ×g e a quattro gradi Celsius. Ri-sospendere i pellet cellulari in 150 microlitri di MS-buffer. Successivamente, incubare le cellule sul ghiaccio per 30 minuti.

Quindi, lisare le cellule mediante sonificazione a quattro gradi Celsius. Rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione per 10 minuti a 11.000 ×g e a quattro gradi Celsius. Trasferire il soprannatante in un nuovo tubo e determinare la concentrazione proteica con un saggio proteico compatibile con detergenti.

Quindi, mescolare 75 microgrammi di proteina con un buffer campione 6x. Dopo aver bollito a 95 gradi Celsius per cinque minuti, separare le proteine mediante SDS-PAGE in buffer di corsa SDS a 180 volt per circa un'ora. Dopo la colorazione con Coomassie, escindere la stessa banda proteica e analizzare l'efficacia di incorporazione mediante analisi MS.

Infettare la popolazione leggera di cellule con il virus reporter dell'epatite C incubandole con ceppi fibrosi per quattro ore a 37 gradi Celsius. Espandere le cellule leggere infettate dal VHC e le cellule pesanti non infette come descritto nel protocollo testuale. Se si utilizza un ceppo del VHC che porta un gene di resistenza alla blasticidina, aggiungere 10 microgrammi per millilitro di blasticidina S al mezzo leggero per selezionare le cellule positive al VHC.

Un giorno prima dell'isolamento delle goccioline lipidiche, lavare le cellule con PBS, trattarle con tripsina e risospendere nel rispettivo mezzo leggero o pesante. Contare le cellule utilizzando una camera di conteggio di Neubauer. Successivamente, seminare sette milioni di cellule per ciascuna popolazione in una piastra per colture cellulari da 150 centimetri quadrati.

Preparare almeno cinque piastre per ciascuna popolazione cellulare leggera e pesante. Colture le cellule in 30 millilitri di mezzo per piastra durante la notte. Il giorno successivo, rimuovere il mezzo e lavare le cellule con PBS 1X.

Staccare le cellule in PBS 1X utilizzando un raschietto per cellule. Dopo aver contato entrambe le popolazioni cellulari come in precedenza, trasferire numeri uguali di cellule in provette da centrifuga da 50 millilitri. Pellettizzare le cellule mediante centrifugazione per cinque minuti a 160 ×g e a quattro gradi Celsius.

Rimuovere il PBS e risospendere il pellet cellulare in un millilitro di buffer saccarosato. Trasferire la sospensione cellulare in un omogeneizzatore Ounce adatto, quindi lisare le cellule con 200 colpi su ghiaccio. Successivamente, trasferire il lisato in una provetta microfuga da 1,5 millilitri e centrifugare i nuclei e i detriti cellulari per 10 minuti a 1.000 ×g e a quattro gradi Celsius.

Dopo la centrifugazione, conservare un'aliquota di 25 microlitri della frazione post-nucleare, o PNS, a meno 20 gradi Celsius come controllo di input. Posizionare il resto della frazione PNS sul fondo del tubo da centrifuga e sovrapporre circa tre millilitri di buffer di lavaggio delle goccioline lipidiche. Centrifugare per due ore a 100.000 ×g e a quattro gradi Celsius.

Dopo la centrifugazione, raccogliere la frazione di gocce lipidiche galleggianti dalla parte superiore del tubo utilizzando un'ago cannula arrotondato piegato. Successivamente, trasferire la frazione di gocce lipidiche in un tubo da centrifuga, sovrapporre il buffer di lavaggio per gocce lipidiche e ripetere la centrifugazione. Il prelievo delle gocce lipidiche dalla parte superiore del gradiente richiede esperienza.

Ed è più facile quando la frazione è più grande. È possibile utilizzare cellule adipose per esercitarsi. Oppure è possibile nutrire le cellule con oleato per aumentare la quantità di goccioline lipidiche.

Recuperare nuovamente la frazione di goccioline lipidiche galleggianti utilizzando una cannula smussata piegata dalla parte superiore del tubo. Trasferire le goccioline lipidiche in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri e aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio per goccioline lipidiche. Successivamente, centrifugare il campione per 20 minuti a 21.000 ×g e a quattro gradi Celsius.

Rimuovere il tampone di lavaggio sottostante utilizzando una punta per pipetta per gel e ripetere il passaggio di lavaggio tre volte. Dopo l’ultima rimozione del tampone di lavaggio, mescolare cinque microlitri di frazioni di goccioline lipidiche con 10 microlitri di tampone di lisi NP-40 per la determinazione del contenuto proteico. Incubare il campione sul ghiaccio per un’ora per inattivare il virus se si lavora con materiale infettivo.

A questo punto, le frazioni di goccioline lipidiche possono essere conservate a meno 20 gradi Celsius. Successivamente, mescolare il volume corrispondente ad almeno 35 microgrammi di proteina con il colorante di caricamento 4x. Incubare la miscela sul ghiaccio per un'ora per inattivare il virus se si lavora con materiale infettivo.

Fare bollire il campione a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Successivamente, eseguire l'elettroforesi SDS-PAGE seguita dalla colorazione con Coomassie per preparare il campione per la cromatografia liquida accoppiata a spettrometria di massa in tandem come descritto nel protocollo testuale. Per analizzare la purezza delle goccioline lipidiche, diluire aliquote delle frazioni di goccioline lipidiche, da una a due, con tampone lisico NP-40.

Diluire le frazioni di controllo del campione da uno a dieci con lo stesso tampone. Incubare i campioni sul ghiaccio per un'ora per inattivare il virus se si lavora con materiale infettivo. Successivamente, determinare il livello proteico mediante un saggio proteico compatibile con detergenti.

Quindi, mescolare quantità uguali di proteina con il buffer campione 6x e incubare i campioni sul ghiaccio per un'ora per inattivare il virus, se si lavora con materiale infettivo. Infine, procedere con l'elettroforesi SDS-PAGE e trasferire le proteine su una membrana di nitrocellulosa mediante trasferimento in vasca a 80 volt per 90 minuti. Qui viene mostrata un'analisi rappresentativa di un western blot delle frazioni post-nucleari e delle goccioline lipidiche.

Il western blot mostra chiaramente un arricchimento delle proteine marcatori delle goccioline lipidiche perilipina 2 e perilipina 3 nelle frazioni di goccioline lipidiche, e una deplezione dei marcatori di altri compartimenti cellulari. Le frazioni post-nucleari e quelle delle goccioline lipidiche possono essere ulteriormente analizzate mediante colorazione con blu di Coomassie e con argento. Questa mappa termica illustra il numero di peptidi e la percentuale di copertura proteica delle proteine identificate nelle frazioni di goccioline lipidiche delle cellule analizzate.

La mappa termica finale mostra come l'infezione da HCV modifica le goccioline lipidiche diurne. Le proteine associate alle goccioline lipidiche arricchite sono indicate in rosso, mentre quelle associate alle goccioline lipidiche impoverite sono indicate in blu. Il vantaggio principale di questo metodo è che mescoliamo le cellule prima dell'isolamento e prima dell'isolamento delle goccioline lipidiche, riducendo così al minimo gli errori che possono verificarsi durante la lisi cellulare e durante le fasi di isolamento.