Usando una tecnica fluorescente PCR-capillare elettroforesi su gel al genotipo CRISPR / Cas9 mediata Knockout Mutants in un formato high-throughput

L'obiettivo generale di questa tecnica è genotipizzare in modo ad alto rendimento cloni mutanti con inserzioni o delezioni indotte da CRISPR/Cas9. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della genetica, come l'effetto fenotipico dell'abbattimento di un gene specifico in un modello SAIL di interesse. Il vantaggio principale di questa tecnica è la possibilità di effettuare uno screening da minimo ad alto rendimento, caratterizzato da elevata flessibilità multifunzionale.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla genetica del cancro umano, può essere applicato anche ad altri sistemi, come cellule umane, staminali e primarie, oppure cellule di origine non umana. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo eseguito saggi di tipizzazione mediante ripetizioni tandem corte o STR. Per iniziare la procedura, trasfettare le cellule scelte con un plasmide che esprime contemporaneamente una proteina cas9 marcata con un fluorocromo e l'RNA guida singolo.

Trasferire le cellule con tripsina e selezionare circa 3.500 clone marcate con fluorescenza. Piastrare le clone in porzioni di 500, 1.000 e 2.000 cellule in piatti da 10 centimetri con otto millilitri di mezzo di crescita integrato con penicillina-streptomicina. Incubare le cellule in atmosfera al 5% di CO₂ a 37 gradi Celsius, sostituendo il mezzo ogni cinque giorni fino a quando le colonie derivanti da singole cellule diventano visibili ad occhio nudo.

Quindi aspirare singole colonie in una pipetta da 200 microlitri con circa cinque microlitri di mezzo di crescita. Trasferire ciascuna colonia in un pozzetto separato contenente 200 microlitri di mezzo di crescita. Pipettare ripetutamente su e giù ciascuna miscela per risospendere le cellule.

Incubare le cellule nelle condizioni precedentemente descritte fino a quando le cellule raggiungono una confluenza del 50-90%. Rimuovere il mezzo di coltura in eccesso dalle pozzette e aggiungere 25 microlitri di tripsina EDTA 0,05% senza rosso fenolo in ogni pozzetta. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 7 minuti.

Quindi, pipettare ripetutamente su e giù le miscele per ri-sospendere le cellule trattate con tripsina. Ispezionare le pozzette al microscopio per verificare che le cellule si siano staccate dalle pareti delle pozzette. Per preparare i replicati dei singoli cloni, trasferire cinque microlitri di ciascuna sospensione cellulare in una piastra per colture a 96 pozzette vuota.

Aggiungere 200 microlitri di mezzo di crescita in ogni pozzetto. Successivamente, caricare i pozzetti di una piastra PCR da 96 pozzetti vuota con 10 microlitri di tampone di lisi. Trasferire altri cinque microlitri di ciascuna sospensione cellulare in questa piastra da 96 pozzetti.

Centrifugare brevemente la piastra finché il liquido non si deposita sul fondo dei pozzetti. Aggiungere 200 microlitri di mezzo di crescita ai restanti 15 microlitri di ciascuna sospensione cellulare. Conservare la sospensione originale e i replicati nelle condizioni di incubazione per una successiva verifica dello stato di knockout delle linee cellulari.

Quindi utilizzare il termociclatore per lisare completamente le cellule nel buffer di lisi. Centrifugare brevemente i lisati. Diluire i lisati con 40 microlitri di acqua priva di nucleasi.

Vortexare e centrifugare brevemente i lisati diluiti. Prima di eseguire la PCR fluorescente, progettare e testare la specificità di diverse coppie di primer non marcati su cellule selvatiche lisate. Identificare la coppia di primer ottimale e ottenere i primer forward marcati con fluorocromo e il primer reverse non marcato.

Assicurarsi di verificare la specificità dei primer utilizzando cellule vortex e lisandole con il tampone di lisi casalingo, poiché i risultati possono variare rispetto all'uso di DNA genomico purificato. Utilizzando i primer marcati, eseguire reazioni di PCR fluorescente da 20 microlitri con tre microlitri dei lisati diluiti per amplificare le regioni bersaglio. Valutare le dimensioni e le quantità relative degli ampliconi di PCR risolvendo cinque microlitri degli ampliconi su un gel di agarosio all'1%.

Per iniziare la preparazione del campione, utilizzare acqua priva di nucleasi per diluire gli ampliconi di DNA di tipo selvaggio e di DNA bersagliato da CRISPR/Cas9 fino a una concentrazione approssimativa di 2,5 nanogrammi per microlitro. Mescolare volumi uguali di campioni di DNA di tipo selvaggio e bersagliato diluiti. Caricare i pozzetti di una piastra PCR a 96 pozzetti con nove microlitri di una miscela in rapporto 29:1 di formammide deionizzata e standard di dimensione marcato con colorante e un microlitro degli ampliconi mescolati.

Sigillare saldamente la piastra e riscaldare i campioni a 95 gradi Celsius per tre minuti con un termociclatore PCR. Immediatamente dopo il riscaldamento, raffreddare la piastra sul ghiaccio per tre minuti. Eseguire l'elettroforesi capillare su gel con un analizzatore genetico.

Al termine dell'elettroforesi, importare i dati nel software di analisi e tracciare i dati. Verificare la qualità del campione di riferimento per la dimensione esaminando i dati nel canale del colorante appropriato. Quindi esportare i valori del canale del colorante per i controlli di tipo selvaggio non bersaglio e per le linee clonali bersaglio in formato txt.

Da questo file, importare nell'elaboratore di testo elettronico le identità dei coloranti, i nomi dei file campione, le dimensioni dei frammenti e i valori dell'altezza dei picchi. Calcolare la differenza nelle dimensioni dei frammenti tra la linea clonale bersaglio e il controllo di tipo selvatico non bersaglio in ogni campione. Identificare le linee clonali con mutazioni di inserzione/delezione (indel) che non siano multipli di tre paia di basi.

Espandere in modo seriale le linee cellulari selezionate dai replicati conservati. Eseguire il sequenziamento di Sanger e l'analisi del sangue occidentale per determinare i genotipi delle linee cellulari e verificare lo stato di knockout delle linee cellulari. La linea cellulare di carcinoma epatocellulare HEPG2 è stata bersagliata con un costrutto CRISPR/Cas9 diretto contro il gene Nap1L1.

Gli alleli selvatici non bersagliati e gli alleli bersagliati da CRISPR/Cas9 sono stati amplificati mediante PCR utilizzando primer etichettati rispettivamente con fluorocromi verdi e blu. Utilizzando un protocollo PCR fluorescente specificamente ottimizzato, gli ampliconi dei cloni bersagliati sono stati ottenuti con buona resa. Non è stata osservata alcuna interferenza tra i coloranti fluorescenti verde e blu all'interno dei campioni di singoli cloni.

L'analisi delle dimensioni dei frammenti, determinata mediante elettroforesi capillare su gel, ha rivelato la delezione di una e dieci paia di basi nelle due linee cellulari mostrate qui. I risultati del sequenziamento di Sanger erano coerenti con l'analisi mediante elettroforesi capillare su gel. L'analisi del sangue periferico ha confermato che le linee cellulari selezionate non esprimevano NAP1L1.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di etichettare con attenzione i campioni, poiché sono coinvolti numerosi campioni, e di minimizzare il tempo di esposizione dell'amplificone marcato con fluorocromo, in quanto sensibile alla luce. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi come la RT-PCR quantitativa, l'analisi del sangue western e il sequenziamento Sanger possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio quali geni di interesse sono completamente eliminati. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire il genotipaggio di cloni mutanti indotti da CRISPR/Cas9 in modo ad alto rendimento, utilizzando la PCR fluorescente abbinata all'elettroforesi su gel capillare.