Analisi elettrofisiologica dei cardiomiociti derivanti da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC-CMs) Utilizzando matrici multi-elettrodo (MEAs)

L'obiettivo generale di questa procedura è dissociare i cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti umane e seminarli su array multielettrodi per misurare e quantificare la durata e la frequenza del loro segnale elettrico tipico, noto anche come potenziale di campo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo, ad esempio quali sono le differenze elettrofisiologiche tra cardiomiociti portatori di mutazioni e controlli. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente lo screening di farmaci su cardiomiociti umani derivati da cellule di pazienti.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché i passaggi di dissociazione e semina sono essenziali per il corretto registro dei segnali elettrici. In generale, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà, in quanto l'identificazione di segnali elettrici di buona o scarsa qualità non è immediata e l'analisi del potenziale libero richiede esperienza.

Per iniziare questa procedura, posizionare le chip pulite in una piastra di Petri sterile di plastica standard con diametro di 10 centimetri. Successivamente, aggiungere otto millilitri di acqua distillata sterile alla piastra di Petri per creare una camera umidificata che impedirà al piccolo volume di mezzo di coltura presente sulla chip di evaporare quando posta nell'incubatore. Quindi utilizzare anelli in politetrafluoroetilene su misura per garantire la semina dei cardiomiociti al centro della chip, dove si trova l'array di elettrodi.

Nella cappa asettica, rimuovere gli anelli dall'etanolo. Collocarli in una piastra di Petri sterile senza coperchio e lasciare asciugare gli anelli nella cappa. Successivamente, posizionare un anello secco all'interno di un chip MEA utilizzando pinzette sterilizzate alla fiamma.

Rivestire gli elettrodi aggiungendo 50 microlitri di fibronectina 40 microgrammi per millilitro all'interno dell'anello. Successivamente, coprire la piastra di Petri con il coperchio e trasferire con attenzione la piastra contenente il chip MEA in un incubatore. Dopo di ciò, trasferire la piastra contenente il chip MEA nell'ambiente asettico per colture cellulari.

Prima di utilizzare il chip MEA, aspirare 50 microlitri di fibronectina utilizzando una pipetta P200 o un sistema a vuoto all'interno della cappa, senza spostare l'anello in PTFE. Assicurarsi che nessun oggetto solido tocchi gli elettrodi mantenendo la punta inclinata. Quindi aggiungere delicatamente 950 microlitri di mezzo LI-BPEL, verificando che sia distribuito uniformemente e che l'anello non galleggi.

Rimettere successivamente la piastra nell'incubatore. Questa è la coltura iniziale dei cardiomiociti contrattili. In una cappa a flusso laminare, aspirare il mezzo dalla pozzetta della coltura di hPSC-CMs.

Aggiungere da uno a due millilitri di PBS senza calcio e magnesio in ogni pozzetto per lavare la coltura e aspirare il PBS. Successivamente, aggiungere 500 microlitri dell'enzima di dissociazione in ogni pozzetto. Incubare il campione per 5 minuti a 37 gradi Celsius.

Dopo cinque minuti, aggiungere un millilitro di LI-BPEL in ogni pozzetto per diluire l'enzima. Staccare il monostrato di hPSC-CMs graffiando delicatamente con una pipetta P1000. Successivamente, raccogliere la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri.

Successivamente, risciacquare la pozzetta con un millilitro di LI-BPEL per raccogliere tutte le cellule e gli aggregati cellulari rimanenti. Aggiungere altri due-tre millilitri di LI-BPEL per raggiungere un volume finale di circa cinque-sei millimetri e pipettare delicatamente su e giù da tre a cinque volte con una pipetta da cinque millilitri per dissociare gli aggregati cellulari. Successivamente, centrifugare le cellule a temperatura ambiente per tre minuti a 300 ×g.

Successivamente, rimuovere il soprannatante senza disturbare il pellet cellulare. Quindi risospendere il pellet cellulare in 250 microlitri di LI-BPEL. Successivamente, distribuire 50 microlitri di sospensione cellulare per MEA pipettando la sospensione direttamente al centro dell'anello in PTFE, sopra l'array di elettrodi.

Trasferire con attenzione le MEA nell'incubatrice a 37 gradi celsius e lasciare che le cellule si attacchino durante la notte. Un giorno dopo la semina, rimuovere con attenzione l'anello in un ambiente sterile utilizzando pinzette sterili. Sciacquare l'anello in etanolo al 80 percento.

E conservarlo in un tubo da 50 millilitri contenente etanolo fresco all'80 percento. Successivamente, rimuovere delicatamente 500 microlitri di mezzo dal chip MEA. E aggiungere 500 microlitri di LI-BPEL fresco.

Questi sono i cardiomiociti contrattili dopo la rimozione dell'anello. Successivamente, trasferire le MEA nell'incubatrice a 37 gradi Celsius. Quindi, misurare l'attività elettrica dei CM derivati da hPSC sulle MEA a partire da un giorno dopo la rimozione dell'anello fino a una settimana.

Ora avviare la suite software collegata al sistema MEA. Successivamente, impostare la temperatura a 37 gradi Celsius in TCX-Control per registrare le misurazioni. Dopodiché, rimuovere la piastra contenente il chip MEA dall'incubatrice.

Estrarre il chip MEA dalla piastra e posizionarlo su un fazzoletto di carta per assorbire l'acqua residua. Pulire con cura l'esterno della piastra con un fazzoletto di carta e igienizzarla utilizzando un bastoncino di ovatta inumidito con etanolo al 100 percento per rimuovere qualsiasi traccia di acqua o detriti che potrebbero causare rumore di segnale. Successivamente, trasferire la piastra MEA su un supporto registrante a 37 gradi Celsius per rilevare l'attività spontanea.

Aprire MC Rack e fare clic su modifica per caricare l'hardware MEA. Per creare un nuovo protocollo, utilizzare il menu a discesa modifica per aggiungere diverse finestre di registrazione e visualizzazione al protocollo. Successivamente, avviare il protocollo in modalità riproduzione facendo clic sul pulsante di riproduzione.

Se i segnali mostrano chiaramente i picchi R e i picchi T, attendere da 10 a 15 minuti per concludere la fase di adattamento. Per iniziare l'esperimento, fare clic su registra, quindi su riproduci ed acquisire i dati per 10 minuti nelle condizioni di base per determinare lo stato stazionario. Annotare gli elettrodi che hanno fornito il segnale migliore in modo che possano essere facilmente identificati ed esportati successivamente per l'analisi.

Per la valutazione della risposta al farmaco, aggiungere concentrazioni crescenti di farmaco ogni 10 minuti. Fare clic su stop per terminare la registrazione al termine del protocollo. Di seguito sono riportati tracciati rappresentativi registrati con una MEA che mostrano un tracciato di buona qualità con picchi RQ e T chiaramente visibili e un elevato rapporto segnale-rumore.

Un tracciato di scarsa qualità senza picchi RQ e T chiaramente visibili e un tracciato rumoroso con picchi RQ e T visibili chiaramente ma con un basso rapporto segnale-rumore. Di seguito sono riportati esempi rappresentativi di tracciati di potenziale di campo di buona qualità con diverse morfologie che possono essere registrati durante esperimenti MEA utilizzando hPSC-CMs. L'area ombreggiata rappresenta l'intervallo QT misurato durante l'analisi.

Poiché il potenziale del campo all'interfaccia MEA assomiglia alla derivata prima del potenziale d'azione, l'integrale delle tracce del potenziale del campo è stato calcolato come dimostrazione teorica delle onde T, che si avvicinano alle ripolarizzazioni complete del potenziale d'azione. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare il numero più elevato possibile di elettrodi per garantire segnali affidabili e costanti. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi come la PCR del tempo tibiale quanto o la tecnica del patch clamp su singola cellula possono essere impiegati per rispondere ad ulteriori domande, come l'espressione genica specifica legata al fenotipo elettrico o le densità specifiche delle correnti ioniche.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle cellule staminali, permettendo di studiare le aritmie cardiache e la farmacologia in vitro utilizzando cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti umane. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come dissociare e seminare cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti umane sulle MEA per misurazioni elettrofisiologiche e screening farmacologico. Non bisogna dimenticare che lavorare con farmaci può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come quelle previste dalle buone pratiche di laboratorio (GLP) devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.