Analisi elettrofisiologica dei cardiomiociti derivanti da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC-CMs) Utilizzando matrici multi-elettrodo (MEAs)
12 maggio 2017
La caratterizzazione elettrofisiologica dei cardiomiociti derivata da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC-CM) è fondamentale per la modellizzazione delle malattie cardiache e per la determinazione delle risposte di farmaco. Questo protocollo fornisce le informazioni necessarie per dissociare e piastrare hPSC-CM su matrici multi-elettrodi, misurare il loro potenziale di campo e un metodo per analizzare gli intervalli QT e RR.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di dissociare i cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti umane e di piastrerli su array multi-elettrodi per misurare e quantificare la durata e la frequenza del loro tipico segnale elettrico, chiamato anche potenziale di campo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sul campo, come ad esempio quali sono le differenze elettrofisiologiche tra i cardiomiociti portatori di mutazioni e i controlli. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente lo screening farmacologico su cardiomiociti umani derivati da cellule di pazienti.
La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale. Poiché le fasi di dissociazione e placcatura sono essenziali per una corretta registrazione del segnale elettrico. Generalmente gli individui che si avvicinano per la prima volta a questo metodo avranno difficoltà perché l'identificazione di segnali elettrici di buona o cattiva qualità non è banale e l'analisi del potenziale libero richiede esperienza.
Per iniziare questa procedura, posizionare le patatine pulite in una capsula di Petri sterile di plastica standard di 10 centimetri di diametro. Quindi aggiungere otto millilitri di acqua distillata sterile alla capsula di Petri per formare una camera umidificata che impedirà al piccolo volume di terreno di coltura sul chip di aspirare quando viene inserito nell'incubatore. Quindi utilizzare anelli di politetrafluoroetilene su misura per garantire la placcatura dei cardiomiociti al centro del chip in cui si trova l'array di elettrodi.
Nella cappa di coltura, rimuovere gli anelli dall'etanolo. Metterli in una capsula di Petri sterile senza coperchio e lasciare asciugare gli anelli nella cappa. Quindi posizionare un anello asciutto all'interno di un chip MEA utilizzando una pinzetta sterilizzata a fiamma.
Rivestire gli elettrodi aggiungendo 50 microlitri di 40 microgrammi per millilitro di fibronectina all'interno dell'anello. Dopodiché, coprire la capsula di Petri con il coperchio e trasferire con cura la capsula contenente il chip MEA in un'incubatrice. Successivamente, trasferire la piastra contenente il chip MEA nella cappa di coltura cellulare.
Prima di utilizzare il chip MEA, aspirare 50 microlitri di fibronectina utilizzando una pipetta P200 o un sistema a vuoto nella cappa senza spostare l'anello in PTFE. Assicurarsi che nessun oggetto solido tocchi gli elettrodi mantenendo la punta angolata. Quindi aggiungere delicatamente 950 microlitri di terreno LI-BPEL assicurandosi che sia distribuito uniformemente e che l'anello non galleggi.
Successivamente rimettere la capsula nell'incubatrice. Questa è la coltura iniziale dei cardiomiociti battitori. In una cappa per coltura tissutale, aspirare bene il terreno dalla coltura di hPSC-CMs.
Aggiungere uno o due millilitri di PBS senza calcio e magnesio a ciascun pozzetto per lavare la coltura e aspirare il PBS. Successivamente, aggiungere 500 microlitri dell'enzima di dissociazione a ciascun pozzetto. Incubare il campione per 5 minuti a 37 gradi Celsius.
Dopo cinque minuti aggiungere un millilitro di LI-BPEL a ciascun pozzetto per diluire l'enzima. Staccare il monostrato di hPSC-CM grattandoli delicatamente con una pipetta P1000. Quindi raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da 15 millilitri.
Quindi sciacquare il pozzetto con un millilitro di LI-BPEL per raccogliere tutte le cellule rimanenti e i grumi cellulari. Aggiungere altri due o tre millilitri di LI-BPEL per raggiungere un volume finale di circa cinque o sei millimetri e pipettare delicatamente su e giù da tre a cinque volte con una pipetta da cinque millilitri per dissociare i grumi cellulari. Successivamente, centrifugare le celle a temperatura ambiente per tre minuti a 300 volte g.
Dopodiché rimuovere il surnatante senza rimuovere il pellet della cella. Quindi risospendere il pellet della cella in 250 microlitri di LI-BPEL. Successivamente distribuire 50 microlitri di sospensione cellulare per MEA pipettando la sospensione cellulare direttamente al centro dell'anello in PTFE sulla parte superiore dell'array di elettrodi.
Trasferire con cura i MEA nell'incubatore a 37 gradi Celsius e lasciare che le cellule si attacchino durante la notte. Un giorno dopo la placcatura, rimuovere con cura l'anello in un ambiente sterile utilizzando una pinzetta sterile. Sciacquare l'anello con etanolo all'80%.
E conservalo in un tubo da 50 millilitri contenente l'80% di etanolo fresco. Quindi rimuovere delicatamente 500 micro litri di terreno dal chip MEA. E aggiungi 500 micro litri di LI-BPEL fresco.
Questi sono i cardiomiociti che battono dopo la rimozione dell'anello. Successivamente, trasferire i MEA nell'incubatore a 37 gradi Celsius. Quindi misurare l'attività elettrica delle hPSC-CM sui MEA a partire da un giorno dopo la rimozione dell'anello e fino a una settimana.
Ora avvia la suite software collegata alla configurazione MEA. Quindi impostare la temperatura a 37 gradi Celsius in TCX-Control per registrare le misurazioni. Dopodiché, rimuovi il piatto contenente il chip MEA dall'incubatrice.
Estrarre la patatina MEA dal piatto e posizionarla su un fazzoletto per assorbire l'acqua residua. Pulire accuratamente il contesto esterno della piastra con un fazzoletto e pulirla con un batuffolo di cotone inumidito con etanolo al 100% per rimuovere eventuali residui di acqua o detriti che potrebbero causare rumore di segnale. Quindi trasferire la piastra MEA a 37 gradi Celsius per rilevare l'attività spontanea.
Aprire MC Rack e fare clic su modifica per caricare l'hardware MEA. Per creare un nuovo protocollo, utilizzare il menu a discesa Modifica per aggiungere diversi registratori e finestre di visualizzazione al protocollo. Successivamente avviare il protocollo in modalità di riproduzione facendo clic sul pulsante di riproduzione.
Se i segnali mostrano picchi R e picchi T visibili, attendere chiaramente da 10 a 15 minuti per concludere la fase di adattamento. Per avviare l'esperimento, fare clic su Registra, quindi riprodurre e acquisire dati per 10 minuti nelle condizioni di base per determinare lo stato stazionario. Annotare gli elettrodi che hanno avuto il segnale migliore in modo che possano essere facilmente identificati ed esportati in seguito per l'analisi.
Per una valutazione della risposta ai farmaci, aggiungere concentrazioni crescenti di farmaco ogni 10 minuti. Fare clic su stop per concludere la registrazione al termine del protocollo. Ecco le tracce rappresentative registrate con un MEA che mostrano una traccia di buona qualità con picchi RQ e T ben visibili con un elevato rapporto segnale/rumore.
Una traccia di cattiva qualità senza picchi RQ e T chiaramente visibili E una traccia rumorosa con picchi RQ e T chiaramente visibili ma con un basso rapporto segnale/rumore. Ed ecco gli esempi rappresentativi di tracce di potenziale di campo di buona qualità con diverse morfologie che possono essere registrate durante gli esperimenti MEA utilizzando hPSC-CM. L'area ombreggiata rappresenta l'intervallo QT misurato durante l'analisi.
Poiché il potenziale di campo alla MEA assomiglia alla derivata prima del potenziale d'azione, l'integrale delle tracce del potenziale di campo è stato calcolato come dimostrazioni teoriche delle onde T che sono vicine alle ripolarizzazioni complete del potenziale d'azione. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di scegliere il numero più alto di elettrodi per garantire segnali affidabili e coerenti. Seguendo questa procedura, è possibile utilizzare altri metodi come la PCR a tempo tibiale o il patch clamp a singola cellula per rispondere a ulteriori domande come l'espressione genica specifica correlata al fenotipo elettrico o le densità specifiche di corrente ionica.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle cellule staminali, per esplorare le aritmie cardiache e la farmacologia in vitro utilizzando cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti umane. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come dissociare e piastrare i cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti umane sui MEA per misurazioni elettrofisiologiche e screening farmacologico. Non dimenticare che lavorare con i farmaci può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come la GLP standard.
Panoramica
Questo protocollo delinea la dissociazione e l'impiantazione di cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC-CM) su array multi-elettrodi (MEA) per la caratterizzazione elettrofisiologica. Descrive in dettaglio i metodi per misurare il potenziale di campo e analizzare gli intervalli QT e RR, che sono essenziali per la modellazione delle malattie cardiache e la valutazione della risposta farmacologica.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Eletrofisiologia cardiaca
- Biologia delle cellule staminali
- Screening farmacologico
Sfondo
- Comprendere le proprietà elettrofisiologiche delle hPSC-CM è vitale per la ricerca cardiaca.
- Questo metodo permette la valutazione delle risposte farmacologiche nei cardiomiociti umani.
- Le misurazioni del potenziale di campo forniscono informazioni sull'attività elettrica cellulare.
- Una dimostrazione visiva del protocollo è cruciale per un'implementazione di successo.
Obiettivo dello studio
- Caratterizzare i segnali elettrici delle hPSC-CM.
- Confrontare le differenze elettrofisiologiche tra cardiomiociti mutati e di controllo.
- Facilitare lo screening farmacologico utilizzando cellule derivate da pazienti.
Metodi utilizzati
- Dissorciazione delle hPSC-CM utilizzando un enzima di dissociazione.
- Impiantazione delle cellule su MEA con rivestimento di fibronectina.
- Misurazione dell'attività elettrica utilizzando software specializzato.
- Valutazione delle risposte farmacologiche variando le concentrazioni dei farmaci durante le registrazioni.
Risultati principali
- Dissorciazione e impianto riusciti delle hPSC-CM su MEA.
- Misurazione chiara dei potenziali di campo e identificazione dei picchi R e T.
- Capacità di valutare le risposte farmacologiche in tempo reale.
- Dimostrazione di una qualità del segnale variabile basata sulle condizioni sperimentali.
Conclusioni
- Questo protocollo fornisce un metodo affidabile per studiare le hPSC-CM.
- La caratterizzazione elettrofisiologica è essenziale per comprendere le malattie cardiache.
- Il metodo supporta gli sforzi di screening farmacologico nella medicina personalizzata.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Electrophysiological profiling of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) using multi-electrode arrays (MEAs) enables medium- to high-throughput assessment of cardiac ion channel function and drug-induced electrophysiological changes. This approach supports early detection of cardiotoxic liabilities and mechanistic de-risking of arrhythmogenic compounds in discovery-stage screening. By providing quantitative field potential parameters such as QT and RR intervals, the method enhances predictive confidence in translational cardiovascular research and safety pharmacology workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by comparing electrophysiological phenotypes between mutant and control hPSC-CMs to clarify ion channel dysfunction mechanisms.
- Operational Value: Supports biological de-risking through functional validation of cardiac ion channel targets using human-relevant cellular models.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by identifying compounds that prolong QT interval or alter field potential morphology, indicating pro-arrhythmic risk.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated hPSC-CM monolayers on MEAs for consistent, reproducible field potential recording across multiple electrodes.
- Quantitative Output: Enables extraction of interval-based metrics (QT, RR) and waveform morphology as dependable readouts for compound effect assessment.
- Scalability & Reuse: Supports medium-throughput drug response profiling with dose-response capability, enabling reuse across screening campaigns and compound libraries.
Translational & Preclinical Research
- Disease Modeling: Uses hPSC-CMs derived from patients with arrhythmia syndromes to model human cardiac electrophysiology in a disease-relevant system.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase electrophenotyping with preclinical validation by providing human-derived data predictive of in vivo drug responses.
- Mechanistic De-risking: Allows detection of ion channel-mediated effects early, reducing late-stage attrition due to cardiac safety findings.
Pipeline & Workflow Integration
The MEA-based electrophysiological assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical safety assessment, enabling data-driven decisions at each stage.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of ion channel involvement in arrhythmia mechanisms by measuring field potential changes in genetically defined hPSC-CMs.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible electrophysiological readouts with temperature-controlled, automated signal acquisition for compound library profiling.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (QT, RR intervals, waveform morphology) that enable objective comparison of electrophysiological states across conditions.
- Translational Research: Connects in vitro electrophenotyping to clinical relevance by modeling human cardiac electrophysiology and drug response in a scalable format.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiology platform applicable across multiple projects, targets, and therapeutic areas in cardiovascular research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in cardiac electrophysiology through direct human cell-based measurement.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility via controlled plating, coating, and environmental conditions, minimizing inter-lab variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by enabling early detection of cardiotoxic compounds, thereby reducing late-stage biological risk and capital inefficiency.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying electrophysiological liabilities early, informing resource allocation toward safer candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, cardiac differentiation, and electrophysiological signal interpretation to ensure data quality.
- Dependent on MEA-compatible instrumentation, temperature control units, and signal acquisition software for reliable field potential recording.
- Necessitates cross-team standardization of cell preparation, plating density, and analysis protocols to ensure comparability across studies.
- Involves adaptation considerations when extending to 3D cultures or alternative maturation states of hPSC-CMs to maintain signal fidelity.
- Limited by the need for optimization of dissociation and plating conditions to avoid cellular stress that could confound electrophysiological readouts.
