Name: Immunohistochemia di fluorescenza a quattro colori delle sottopopolazioni delle cellule T in campioni di carcinoma a cellule squamose orofaringe umane incorporate in paraffina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Scopri l'immunohistochimica a fluorescenza multicolore per analizzare le sottopopolazioni di cellule T nel carcinoma orofaringeo. Questa tecnica consente la visualizzazione simultanea di più biomarcatori in sezioni di tessuto incluso in paraffina per studi prognostici.

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Simone Punt è stato sostenuto dalla borsa UL2010-4801 della Dutch Cancer Society. Vogliamo ringraziare tutti i coautori del documento originale che questo protocollo JoVE è basato su: Emilie A. Dronkers, Marij JP Welters, Renske Goedemans, Senada Koljenović, Elisabeth Bloemena, Peter JF Snijders, Arko Gorter e Sjoerd van Der Burg.

I campioni dei pazienti sono stati trattati secondo le linee guida mediche del medico descritte nel Codice di condotta per un corretto uso secondario del tessuto umano della Federazione olandese delle società scientifiche biomediche (www.federa.org). 1. Preparare le diapositive <ol><li> Ottenere materiale tissutale resecato (qualsiasi tipo di tessuto) da un reparto patologico dopo aver ottenuto il permesso del comitato etico medico di utilizzare materiale rescritto. NOTA: Per l&#39;esperimento attuale, i campioni tumorali di pretrattamento sono stati ottenuti da tumori primari orofaringeo diagnosticati nel Leiden University Medical Centre di Leiden, Paesi Bassi tra il 1970 e il 2011, selezionati come descritto precedentemente (n = 162) 13 . La dimensione del tessuto è stata limitata solo dall&#39;esigenza di una quantità sufficiente di tessuti tumorali per ottenere in modo affidabile 4 immagini microscopiche all&#39;interno del tumore. </li><li> Fissare il tessuto in formalina tamponata al 4% per un minimo di 12 h. Dehidrate il tessuto in agSerie di etanolo. Lavare in xilene e inserirlo in cera di paraffina utilizzando un processore di tessuto automatizzato. </li><li> Tagliare sezioni 4 μm di tessuto rigonfiato a base di formalina, paraffina (FFPE) su vetrini in vetro utilizzando un microtomo. Posizionare il blocco di tessuto nel supporto del tessuto microtelefono utilizzando procedure standard. <ol><li> Tagliare i nastri di tessuto e posarli sulla superficie di un bagno d&#39;acqua contenente acqua deionizzata a 45 ºC. Utilizzare uno scivolo adatto per la colorazione immunohistochemical per pescare una sezione posizionando il vetrino nell&#39;acqua direttamente sotto la sezione. Spostare con cautela la slitta ad angolo, prendendo la sezione fuori dall&#39;acqua e attaccandola sullo scivolo. </li></ol></li><li> Lasciare asciugare le diapositive durante la notte a 37 ° C. </li><li> Deparaffinare le diapositive FFPE immersandole completamente in xilene al 100% fresco, tre volte per 5 minuti ciascuno. Ridaldare le diapositive immersandole due volte in etanolo fresco al 100%, etanolo al 70% ed etanolo al 50% per 5 minuti ciascuno. </li></ol> 2. Eseguire il recupero di antigen <ol><li> Lavare le diapositive in acqua deionizzata per 5 min. </li><li> Preriscaldare il tampone Tris-etilendiamintetraoacetico (EDTA) (10 mM Tris più 1 mM EDTA, pH 9,0) a temperatura di ebollizione usando un forno a microonde. Eseguire il recupero dell&#39;antigene sommersando le diapositive nel tampone EDTA preriscaldato e mantenendo il tampone a questa temperatura per 10 minuti nel forno a microonde. NOTA: è possibile utilizzare qualsiasi forno a microonde con una potenza di 900 W. </li><li> Lasciare raffreddare le diapositive nel buffer per 2 ore. </li></ol> 3. Scivolare i tessuti del tessuto <ol><li> Lavare le vetrate due volte con soluzione salina fosfatizzata (PBS) per 5 minuti ciascuno. </li><li> Disegnare un cerchio intorno al tessuto con una penna idrofoba per impedire che gli anticorpi diluiti sfilano la diapositiva. Lavare ancora una volta con PBS; Questo è facoltativo. </li><li> Incubare il tessuto con anticorpi primari (anti-CD3 1:50, anti-FoxP3 1: 200 e anti-IL-17 1:50) diluiti in 1% in peso di siero bovino aLbumina (BSA) in PBS a temperatura ambiente durante la notte. NOTA: Il volume per diapositiva dipende dalla dimensione del tessuto, ma è tipicamente 50 - 150 μL. Sostituire gli anticorpi primari con gli anticorpi della stessa classe isotipo con una specifica ignota per i vetrini di controllo negativo alla stessa diluizione degli anticorpi CD3, CD8 e FoxP3 (ad esempio, anticorpi anti-isotipo coniglio Ig, IgG1 anticorpi anti-isotipo e capra Anticorpo anti-isotipo IgG). </li><li> Lavare le diapositive tre volte con PBS per 5 minuti ciascuna. </li><li> Incubare il tessuto con una combinazione di anticorpi secondari etichettati a fluorescenza che si rivolgono alle specie e / o agli isotipi primari ( cioè 1: 200 IgA Alexa 488 anti-capra, anti-coniglio IgG A546 e anti-mouse A647) 1% di BSA in PBS a temperatura ambiente per 1 h. NOTA: Il volume per diapositiva dipende dalla dimensione del tessuto, ma è tipicamente 50 - 150 μL. <ol><li> DopoAggiungendo l&#39;anticorpo secondario, mantenendo le diapositive protette dalla luce il più possibile immagazzinandole in una scatola scura o avvolgendo la scatola in fogli di alluminio. </li></ol></li></ol> 4. Scivolare i supporti del tessuto di montaggio e di conteggio <ol><li> Lavare le diapositive tre volte in PBS per 5 minuti ciascuna. </li><li> Montare le diapositive utilizzando un supporto di montaggio antifumo acquoso contenente un contatore nucleare ( es. DAPI). Analizzare le diapositive utilizzando un microscopio fluorescente non appena possibile (entro due settimane). Conservare le diapositive al buio a 4 ° C fino all&#39;analisi. </li></ol> 5. Analizzare le vetrate macchiate del tessuto <ol><li> Ottieni quattro immagini di ciascuna diapositiva usando un microscopio a fluorescenza dotato di un obiettivo 20-25x. Prendere le immagini in località casuali per tutta la zona tumorale totale inclusa nella diapositiva per catturare una frazione rappresentativa del tumore. NOTA: È necessario utilizzare un ingrandimento standard di 250X. Qualsiasi fluorescente oPuò essere utilizzato il microscopio di scansione laser a condizione che disponga dei filtri e dei laser necessari per visualizzare i fluorochromi utilizzati. <ol><li> Per la visualizzazione di Alexa 488, utilizzare un massimo di eccitazione di 490 e un&#39;emissione massima di 525; Per la visualizzazione di Alexa 546, utilizzare un massimo di eccitazione di 556 e un&#39;emissione massima di 573; Per la visualizzazione di Alexa 647, utilizzare un massimo di eccitazione di 650 e una massima emissione di 665; E per la visualizzazione di DAPI, utilizzare un massimo di eccitazione di 358 e un massimo di emissione di 461. </li><li> Salvare le immagini come file di immagine (ad esempio, jpeg e tiff) nel software disponibile all&#39;utente. </li></ol></li><li> Discriminazione tra epitelio tumorale e aree di stroma tumorale basate sulle forme nucleari e cellulari delle cellule epiteliali del tumore rispetto alle cellule stromali dopo aver consultato un patologo. <ol><li> Per determinare la superficie totale dello stromo, disegnare una linea intorno a tutte le aree occupate dalle cellule stromali (piuttosto che dalle cellule tumorali) e ricorrereD la superficie usando il software di analisi delle immagini fornito dal produttore del microscopio. <ol><li> Fai clic sulla scheda &quot;Sovrapposizione&quot; sotto l&#39;immagine; Scegliere la forma &quot;Poly-line chiusa&quot; e cliccare su di esso. Demarcare il confine tra campi epiteliali e stromali del tumore facendo clic sull&#39;area fino a raggiungere nuovamente il primo punto; Questo fornisce una misura per quella zona. NOTA: una volta che la forma è chiusa, apparirà un numero accanto alla forma che circonda l&#39;area di superficie dell&#39;immagine selezionata (A = x μm 2 ). </li></ol></li><li> Sottrarre questa superficie dalla superficie totale dell&#39;immagine (fornita nelle proprietà dell&#39;immagine) per calcolare l&#39;area epiteliale. Escludi aree vascolari, necrotiche e autofluorescenti tracciando una linea intorno a loro, registrando la dimensione dell&#39;area fornita e sottraendola alla superficie epiteliale. </li><li> Salvare tutti i numeri di superficie in un foglio di calcolo per calcolare le superfici superficiali eNumeri di cella per diapositiva. </li><li> Utilizzando il software di analisi delle immagini, determinare se le celle sono singole, doppie o triple-positive controllando la fluorescenza di tutti e quattro i canali. <ol><li> Conte le celle singole, doppie e triple-positive in ogni immagine usando ImageJ. <ol><li> Scarica ImageJ. Apri un&#39;immagine facendo clic su &quot;File&quot; e &quot;Apri&quot; e selezionando l&#39;immagine da analizzare. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul &quot;Tool Point&quot; (un quadrato rosso al centro di quattro righe) e selezionare il &quot;Multi-Point Tool&quot;. Fare doppio clic sul &quot;Multi-Point Tool&quot; e contare il numero di tipi di celle differenti nell&#39;immagine selezionando un diverso numero di contatore per ciascun tipo di cella. NOTA: contare tutte le celle di ciascun tipo di cella differente, come individuato dalla presenza di uno, due o tutti i tre colori fluorescenti. Escludi DAPI, poiché questo contatore nucleare è presente in tutte le cellule e viene utilizzato per discriminare le cellule tumorali dalle cellule immunitarie. Ogni tipo di cella viene conteggiatoUtilizzando un diverso numero di contatore. Contare i numeri di cella di ciascun tipo di cellula separatamente nelle aree tumorali epiteliali e stromali scegliendo ogni volta un diverso numero di contatori. Non contate le cellule entro vasi sanguigni e aree largamente autofluorescenti. </li><li> Registrare il numero di celle analizzate in ciascuna banconota per ogni immagine in un file di foglio di calcolo. </li><li> Dividere il numero totale di cellule per ogni tipo di cellula sulla superficie totale dell&#39;epitelio tumorale e dello stroma tumorale analizzato. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> 6. Analisi statistica NOTA: Tutte le analisi statistiche dovrebbero essere discusse con uno statista per garantire la qualità dei dati. Per le statistiche generali, utilizzare qualsiasi guida statistica medica 14 . <ol><li> Prova le correlazioni tra le frequenze delle cellule usando una rho test di correlazione di rango di Spearman. </li><li> Prova le differenze statistiche nei numeri di positiva celLs tra i pazienti usando il test Wilcoxon Mann-Whitney. </li><li> Prova le correlazioni tra i numeri di cellule e la sopravvivenza libera da malattie ( vale a dire, il tempo dalla diagnosi fino alla recidiva locale o remota della morte o della malattia) dividendo i pazienti in gruppi basati su un numero di cellule cut-off utilizzando la generazione della curva Kaplan-Meier e il log Analisi di rango 15 . </li><li> Eseguire analisi multivariate utilizzando l&#39;analisi della regressione di rischio proporzionale Cox. </li></ol>

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<li>Punt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beneficial+tumor+microenvironment+in+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma+is+characterized+by+a+high+T+cell+and+low+IL-17%28%2B%29+cell+frequency%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">A beneficial tumor microenvironment in oropharyngeal squamous cell carcinoma is characterized by a high T cell and low IL-17(+) cell frequency.</a> Cancer Immunol Immunother. 65 (4), 393-403 (2016).</li>
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<li>Kleinbaum, D. G., Klein, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKleinbaum%2C+DG+%22Survival+Analysis%3A+A+Self-Learning+Text%22">Survival Analysis: A Self-Learning Text</a>. , 2nd ed, Springer. (2005).</li>
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<li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispectral+imaging+of+formalin-fixed+tissue+predicts+ability+to+generate+tumor-infiltrating+lymphocytes+from+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma.</a> J Immunother Cancer. 3 (47), (2015).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interesse commerciale o finanziario.

Per il protocollo descritto, uno dei passaggi più critici è quello di determinare la corretta diluizione degli anticorpi primari utilizzati. La diluizione degli anticorpi secondari etichettati era di 1: 200, come raccomandato dal produttore di questi anticorpi specifici Alexa-etichettati. La diluizione degli anticorpi primari dovrebbe quindi essere determinata da una diluizione seriale, preferibilmente utilizzando due diversi campioni del tipo di tessuto previsto (in questo caso OPSCC). La diluizione ottimale è la dilui...

I carcinomi a cellule squamose orofaringe (OPSCC) sono un gruppo eterogeneo di tumori delle cellule squamose originari dell&#39;orofaringe. I fattori di rischio per OPSCC includono l&#39;infezione del papillomavirus umano (HPV) e l&#39;uso di alcool e tabacco 1 , 2 . Il ruolo della risposta immunitaria e come usarlo in un ambiente clinico sta cominciando ad essere esplorato. Il microambiente del tumore è infiltrato da cellule immunitarie che sono attratte dal cancro. Sebbene un citotossico frequenza delle cellule T CD8 + alto è stata correlata con un miglioramento della sopravvivenza in pazienti OPSCC 3, il ruolo degli altri sottoinsiemi T-cellulari, comprese le cellule Tregs e Th17, è ancora chiaro 4. Mentre le cellule Th1 e Th17 sono supposte per aiutare nella risposta immunitaria targeting cellule tumorali, Tregs sono ben noti per le loro capacità di sopprimere l&#39;attività di altre cellule T 5 . Tuttavia, la presenza di TRegs è stato trovato correlato con entrambe le reazioni favorevoli e sfavorevoli nei diversi tipi di tumore 6 . Poiché non tutte le cellule immunitarie presenti nel sangue infiltrano il tumore nella stessa misura, studiare il microambiente tumorale locale fornisce la misura più affidabile della risposta immunitaria diretta contro il tumore. Lo scopo di questo studio è quello di determinare la correlazione tra i numeri e le tipologie di cellule immunitarie e il risultato clinico. Abbiamo utilizzato l&#39;imaging IHC a fluorescenza a quattro colori per analizzare il numero e la localizzazione di diverse sottopopolazioni delle cellule T nell&#39;uomo OPSCC. Ci siamo concentrati sui linfociti totali T (CD3 + ), sulle cellule Th17 e sugli immunosoppressivi FoxP3 + Tregs, il cui percorso di differenziazione è strettamente correlato alle cellule Th17. Le cellule Th17 sono caratterizzate dalla combinazione di CD3 e IL-17. La citochina IL-17 può essere prodotta anche da cellule non-T 7 . Abbiamo determinato la distribuzione dell&#39;in-epitCellule T elicoide e stromali, Tregs, Th17 e IL-17 + cellule non T in una grande serie di casi OPSCC e analizzavano le correlazioni con la sopravvivenza del paziente. La fluorescenza multicolore IHC è stata usata per identificare l&#39;espressione di CD3, Foxp3 e IL-17 in combinazione con un contatore di DAPI. Questo test ha consentito l&#39;identificazione facile e chiara di entrambe le cellule tumorali (utilizzando la colorazione nucleare DAPI) e delle infiltrazioni delle cellule T (utilizzando una combinazione di marcatori differenti). Dopo la preparazione del campione e la colorazione, sono stati utilizzati un microscopio fluorescente e un software di imaging per separare i diversi colori fluorescenti utilizzati e per determinare il numero e il tipo di cellule presenti sia nell&#39;epitelio tumorale che nello stroma associato al tumore. Un test alternativo per quantificare e fenotipizzare le popolazioni di cellule immunitarie è l&#39;analisi della citometria di flusso, o la citometria per il tempo di volo (CyTOF), dei tumori o dei campioni periferici ( cioè il sangue o le ascite). Utilizzando questoTecnica, tutte le informazioni relative alla localizzazione e alla relativa distribuzione dei diversi tipi di cellule vengono persi. L&#39;utilizzo e l&#39;analisi dei campioni periferici non fornisce anche informazioni sulle cellule in grado di infiltrarsi nel microambiente tumorale. Le analisi di cellule immunitarie di sangue e ascite sono state dimostrate per non riflettere il fenotipo e la frequenza di infiltrazione delle cellule immunitarie del tessuto tumorale 8 , 9 . Un&#39;altra alternativa è l&#39;uso di microscopia a campo luminoso. Un vantaggio di questa tecnica sulla formazione di immagini a fluorescenza è l&#39;assenza di autofluorescenza dei tessuti. Anche se alcuni campioni contengono più autofluorescenza, in particolare gli eritrociti, ma anche altri tipi di cellule, inclusi i granulociti neutrofili, queste aree possono essere facilmente rimosse nell&#39;analisi di quasi tutti i campioni. L&#39;immunofluorescenza offre il vantaggio di analizzare marcatori multipli in un campione utilizzando un pannello di fluorescenza mirataNt lunghezze d&#39;onda. Questo è attualmente impossibile nella stessa misura per la microscopia a campo luminoso a causa della mancanza di un numero sufficiente di etichette e di isotipi anticorpali commercialmente disponibili per un determinato antigene. La tecnica IHC a fluorescenza multicolore descritta qui è stata utilizzata in diversi tipi di cancro e combinazioni anticorpali per studiare diverse popolazioni di cellule immunitarie, così come molecole espresse dalle cellule tumorali, quali antigeni di leucociti umani (HLA) e PD-L1 10 , 11 , 12 . Il protocollo è stato stabilito e convalidato utilizzando molti diversi tipi di campioni e anticorpi.

<table><tbody><tr><td>Pathos Delta Ultra Rapid Tissue Processor</td><td>Milestone e Histostar</td><td></td><td>Processatore automatizzato di tessuti</td></tr><tr><td>Histostar</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Macchina per l'inclusione di blocchi di tessuto</td></tr><tr><td>Formaldeide</td><td>Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>milliQ acqua</td><td>Elaga Purelab Chorus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cera di paraffina/Paraclean</td><td>Klinipath</td><td>5079A</td><td></td></tr><tr><td>Porta fazzoletti per microtomo</td><td>Leica</td><td>RM225</td><td></td></tr><tr><td>Flex IHC lato</td><td>Dako</td><td></td><td>Vetrino per tessuti</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merk-Milipore</td><td>1.083.821.000</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Baker</td><td>1073</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Bio-Rad</td><td>BUF036A</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Coniglio anti-CD3</td><td>Abcam</td><td>ab828</td><td>Titolare diluizione anticorpale richiesta</td></tr><tr><td>IgG1 di topo anti-FoxP3</td><td>Abcam</td><td>ab20034</td><td>Titolare richiesto diluizione degli anticorpi</td></tr><tr><td>IgG di capra anti-IL-17</td><td>R& D Systems</td><td>AF-317-NA</td><td>Diluizione dell'anticorpo richiesto</td></tr> per il <tr><td>titolato Anticorpo di controllo dell'isotipo Ig di coniglio</td><td>Abcam</td><td>ab27472</td><td>Utilizzare alla stessa concentrazione finale dell'anticorpo anti-CD3</td></tr><tr><td>di controllo dell'isotipo IgG1 di topo</td><td>Abcam</td><td>ab91353</td><td>Utilizzare alla stessa concentrazione finale dell'anticorpo anti-FoxP3</td></tr><tr><td>per il controllo dell'isotipo IgG di capra</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>02-6202</td><td>Utilizzare alla stessa concentrazione finale di anti-IL-17</td></tr><tr><td>Asino anti-coniglio IgG A546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A10040</td><td>Diluire 1:200 in 1% BSA/PBS</td></tr><tr><td>Asino anti-topo-A647</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A31571</td><td>Diluire 1:200 in 1% BSA/PBS</td></tr><tr><td>Asino anti-capra IgG A488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11055</td><td>Diluire 1:200 in 1% BSA/PBS</td></tr><tr><td>VectaShield contenente DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a scansione laser confocale LSM700</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 obiettivo</td><td>Zeiss</td><td>420852-9972-720</td><td></td></tr><tr><td>LSM Zen Software</td><td>Zeiss</td><td>versione 2009</td><td></td></tr><tr><td>LSM Image Browser</td><td>Zeiss</td><td>versione 4.2.0.121</td><td>Disponibile per il download all'indirizzo www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html.</td></tr><tr><td>SPSS</td><td>IBM Corp.</td><td>versione 20.0</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td>versione 1.50i</td><td>Disponibile per il download all'indirizzo http://rsb.info.nih.gov/ij.</td></tr></tbody></table>

immunohistochemia di fluorescenza a quattro colori delle sottopopolazioni delle cellule t in campioni di carcinoma a cellule squamose orofaringe umane incorporate in paraffina

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

La tecnica di immunoistochimica a fluorescenza a quattro colori (IHC) è un metodo per quantificare le popolazioni di cellule interessate tenendo conto della loro distribuzione relativa e della loro localizzazione nel tessuto. Questa tecnica è stata ampiamente applicata allo studio dell&#39;infiltrazione immunitaria in vari tipi di tumore. Il microambiente tumorale è infiltrato da cellule immunitarie che sono attratte dal sito tumorale. Diverse popolazioni di cellule immunitarie sono state trovate a svolgere diversi ruoli nel microambiente tumorale e avere un impatto diverso sull&#39;esito della malattia. Questo manoscritto descrive come esempio l&#39;uso di fluorescenza multiparametrica IHC sul carcinoma a cellule squamose orofaringe (OPSCC). Questa tecnica può essere estesa ad altri campioni di tessuto e tipi di cellule di interesse. Nello studio presentato, abbiamo analizzato il compartimento intraepiteliale e stromale di una grande coorte OPSCC (n = 162). Ci siamo concentrati sui linfociti T totali (CD3 + ), regolazione immunosoppressivaLe cellule T ory (Tregs, cioè FoxP3 + ) e le cellule T helper 17 (Th17) ( cioè, IL-17 + CD3 + ) usando un contatore nucleare per distinguere l&#39;epitelio tumorale dal stroma. Un elevato numero di cellule T è risultato correlato con una sopravvivenza migliorata senza malattia in pazienti con un numero minore di cellule intratumorali IL-17 + non-T. Ciò suggerisce che le cellule non-T di IL-17 + possono essere correlate con una scarsa risposta immunitaria in OPSCC, che è d&#39;accordo con la correlazione descritta tra IL-17 e una scarsa sopravvivenza nei pazienti affetti da tumore. Attualmente, sono state sviluppate nuove tecniche di fluorescenza IHC con parametri multiparametrici utilizzando fino a 7 fluorochromi diversi e consentiranno la caratterizzazione più precisa e la localizzazione delle cellule immunitarie nel microambiente del tumore.

Una serie di campioni tumorali di pretrattamento FFPE ottenuti da tumori primari orofaringei diagnosticati nel Leiden University Medical Center di Leiden, Paesi Bassi tra il 1970 e il 2011, selezionati come precedentemente descritto (n = 162), sono stati macchiati con il protocollo descritto 13 . Sono state analizzate da una a quattro immagini casuali di ogni diapositiva ( Figura 1 ). Sono indicate alcune cellule autofluorescenti, che...

L&#39;immunohistochemistry di fluorescenza multiparametrica può essere utilizzato per valutare il numero, la distribuzione relativa e la localizzazione delle popolazioni di cellule immunitarie nel microambiente del tumore. Questo manoscritto descrive l&#39;uso di questa tecnica per analizzare le sottopopolazioni delle cellule T nel cancro orofaringeo.

Immunohistochemia di fluorescenza a quattro colori delle sottopopolazioni delle cellule T in campioni di carcinoma a cellule squamose orofaringe umane incorporate in paraffina

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di eseguire la visualizzazione immunoistochimica multicolore e l'enumerazione di varie sottopopolazioni di linfociti T in sezioni di tessuto incluse in paraffina fissate in formalina da campioni di carcinoma a cellule squamose orofaringee. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immuno-oncologia, come ad esempio, esiste un legame tra le sottopopolazioni di cellule immunitarie infiltranti il tessuto tumorale e la prognosi del paziente. Con questa tecnica, è possibile visualizzare diversi biomarcatori in una sezione di tessuto.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia del cancro, poiché la valutazione simultanea di più cellule immunitarie o di fattori correlati al sistema immunitario potrebbe aiutare nella stratificazione dei pazienti per specifiche terapie immunitarie. Iniziare utilizzando una micro lingua per ottenere sezioni di tessuto incluse in paraffina fissate in formalina di quattro micrometri di spessore, posando i nastri di tessuto sulla superficie di un bagno d'acqua deionizzato a 45 gradi Celsius man mano che vengono acquisiti. Per catturare le sezioni, posizionare un vetrino nell'acqua, direttamente sotto il campione di tessuto e spostare con cautela il vetrino verso l'alto ad angolo.Questa sezione si attaccherà alla superficie del vetro quando lo scivolo viene sollevato dall'acqua. Dopo aver essiccato i campioni per una notte a 37 gradi Celsius, de-paraffinizzare i tessuti con tre immersioni totali di cinque minuti in xilolo al 100%. Quando le sezioni sono state completate de-paraffinizzate, reidratare i campioni di tessuto con tre immersioni discendenti di etanolo.Seguito da un lavaggio di cinque minuti in acqua deionizzata. Quindi, immergere i campioni nel tampone EDTA bollente per 10 minuti nel microonde e lasciare raffreddare i vetrini nel tampone per due ore. Per la marcatura degli antigeni di interesse, sciacquare i campioni con due lavaggi PBS di cinque minuti.Dopo il secondo lavaggio, incubare i tessuti con gli anticorpi primari e l'interesse diluito in albumina sierica bovina all'1% in PBS a temperatura ambiente, per una notte. La mattina successiva, sciacquare le sezioni con tre lavaggi PBS di cinque minuti e incubare i campioni con gli anticorpi secondari appropriati diluiti in siero all'1% in PBS a temperatura ambiente per un'ora. Al termine dell'incubazione, lavare i vetrini tre volte in PBS come appena dimostrato e montare i vetrini utilizzando un mezzo di montaggio acquoso antisbiadimento contenente un colorante di contrasto nucleare.Per analizzare i campioni, selezionare prima l'obiettivo da 20 a 25 volte su un microscopio a fluorescenza e acquisire quattro immagini per vetrino utilizzando i filtri appropriati per gli anticorpi secondari e la colorazione del contatore. Salvare le immagini man mano che vengono ottenute. Successivamente, nel software di analisi delle immagini appropriato, apri la prima immagine di interesse e fai clic sulla scheda di sovrapposizione.Selezionare la forma della linea poligonale chiusa per delimitare il contorno della regione di interesse. Quando la forma è chiusa, l'area della superficie di misurazione apparirà accanto alla regione di interesse. Salva tutti i dati della superficie nel file del foglio di calcolo per calcolare le superfici medie e i numeri audio per diapositiva.Esportate l'immagine come file TIFF o JPG da aprire in ImageJ. Quindi, in ImageJ, apri la prima immagine di interesse e seleziona il contatore di celle nel menu dei plug-in. Quindi, fai clic su inizializza, fai clic su tipo uno e fai clic su ogni cella designata come tipo uno.Selezionare un tipo diverso per ogni tipo di cella per contare il numero di diversi tipi di cellule nell'immagine in base all'espressione fluorocromo. Infine, registra il numero di celle analizzate in ogni contenitore del contatore per ogni immagine nel file del foglio di calcolo. In questo esperimento rappresentativo, sono state analizzate quattro immagini casuali da una serie di campioni tumorali pre-trattamento fissati in formalina e inclusi in paraffina ottenuti da tumori orofaringei primari, diagnosticati nel Leiden University Medical Center tra il 1970 e il 2011, che sono stati preparati come appena dimostrato.In questo campione sperimentale, sono state osservate alcune cellule autofluorescenti, distinte per il loro aspetto completamente giallo, mentre i vetrini di controllo negativi non hanno dimostrato alcuna colorazione specifica sopra l'autofluorescenza del tessuto di fondo. Tutti i campioni tumorali sono stati infiltrati da un numero variabile di cellule T fox p3 positive, CD3 positive con solo un piccolo sottogruppo di cellule T che esprimono IL-17. I campioni di pazienti con un numero elevato di cellule T CD3 positive infiltranti totali dimostrano una tendenza verso una correlazione con una migliore sopravvivenza libera da malattia rispetto ai campioni di pazienti con bassi membri di cellule T.Inoltre, in campioni con un basso numero di cellule IL-17 positive, un alto numero di cellule T totali infiltranti è anche correlato con un miglioramento della sopravvivenza libera da malattia, suggerendo che l'efficacia delle cellule T infiltranti il tumore nel carcinoma orofaringeo a cellule squamose potrebbe essere correlata al basso numero di cellule IL-17 positive presenti. Una volta padroneggiate, queste fasi di preparazione del campione possono essere completate in un giorno e mezzo per un massimo di 25 vetrini per sessione di colorazione. È molto importante de-paraffanizzare il campione, altrimenti si otterrà molto sfondo.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della patologia e dell'immunologia. Per esplorare il microambiente per la localizzazione di varie sottopopolazioni di cellule immunitarie. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare varie proteine e tipi di cellule in un'unica sezione di tessuto archivistico.Non dimenticare che lavorare con il silo è molto pericoloso, dovresti sempre lavorare in un armadio di flusso.

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Visualizzazione, quantificazione e mappatura delle popolazioni di cellule immunitarie nel microambiente tumorale

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Un metodo rapido per l'imaging della fluorescenza multispettrale delle sezioni dei tessuti congelati

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Espansione della comprensione del microambiente tumorale mediante spettrometria di massa Imaging di campioni di tessuto fissati in formalina e incorporati in paraffina

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Ibridazione in situ a fluorescenza dell'RNA per la localizzazione di RNA non codificante lungo in cellule di osteosarcoma umano

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Colorazione immunoistochimica multiplex per tessuto di carcinoma polmonare incluso in paraffina

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Saggi automatizzati di immunofluorescenza multiplex ad alto rendimento per la ricerca traslazionale

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