Name: Un modo non invasivo per isolare e fenotipo le cellule della Conjunctiva (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Scopri la citologia da impressione per isolare e immunofenotipare le cellule della superficie oculare. Questa tecnica minimamente invasiva consente l'analisi delle popolazioni di cellule immunitarie mediante citometria a flusso.

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Gli autori vorrebbero ringraziare Nandini Nallappan e Sharon Yeo per aver contribuito con i passi tecnici. Lo studio è stato finanziato da una concessione di start-up per KGC presso la Lee Kong Chian School of Medicine, l&#39;Università Tecnologica di Nanyang e da un Senior Clinician Scientist Award del National Medical Research Council (NMRC) di Singapore Ministry of Health a LT (NMRC / CSA / 045/2012) e da una sovvenzione del NMRC e somministrata dal National Health Innovation Centre a KGC e LT (NHIC-12D-1409007).

Tutti i campioni oculari utilizzati in questo studio sono stati raccolti dalla Clinica Occhio Dell&#39;occhio presso il National Eye Center di Singapore approvato da SingHealth Centralized Institutional Review Board e dal Nanyang Technological University Institutional Review Board di Singapore. NOTA: I soggetti sono stati sottoposti a test clinici per valutare l&#39;entità dell&#39;infiammazione e la gravità della disfunzione della lacrima prima dell&#39;esecuzione dell&#39;IC. I test clinici hanno incluso il tempo di rottura non strappante (NI-TBUT) 14 e l&#39;arrossamento congiuntivale (iperemia) 15,16 valutati con uno strumento diagnostico, il test di Schirmer 17 , il questionario 18 di valutazione del paziente standard di secchezza d&#39;occhio (SPEED) e corneali Colorazione 19 . 1. Raccolta di campioni Ocular da IC <ol><li> Dopo la determinazione dello stato clinico, anestetizzanoGli occhi del partecipante applicando 1 - 2 gocce di anestesia topica, proparacaina cloridrato, alla congiuntiva bulbar superiore e fornix inferiori. Attendere 4 - 5 minuti per la sensazione di stinging dell&#39;anestesia da indossare. </li><li> Raccogliere campioni sia dalla congiuntiva bulbare nasale che temporale con due dispositivi di citologia impressionante. NOTA: Un dispositivo è utilizzato per la raccolta di due campioni di impressioni. Qui sono stati utilizzati due dispositivi per la raccolta di quattro membrane di impressione. <ol><li> Posizionare il dispositivo della citologia di impressione tangenzialmente sulla congiuntiva. Premere delicatamente il pulsante e tenere premuto per 2 - 3 secondi. NOTA: Il dispositivo viene fornito con la membrana. La pressione viene rilasciata automaticamente dopo aver premuto il pulsante. Ci vogliono pochi secondi per liberare la pressione e rimuovere il dispositivo. </li></ol></li><li> Rilasciare la membrana in un tubo di microcentrifuga contenente 1 mL di supporto di coltura (Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) + 10% di siero fetale fetale(FBS) + 1% Penicillina-Streptomicina (Pen Strep)) da un bisturi. </li><li> Isolare le cellule dalla membrana del dispositivo mediante strisciamento continuo per circa 1 min con una punta pipetta da 10 μL. NOTA: il raschiamento è completato quando la superficie della membrana diventa irregolare. I numeri delle cellule da ogni membrana sono variabili (100-500 cellule / membrana). Processare i campioni entro 2 - 3 ore di raccolta. </li></ol> 2. Cellule di immunofenotipizzazione mediante citometria di flusso <ol><li> Centrifugare le cellule a 400 xg per 5 minuti a temperatura ambiente per rimuovere il supporto. Resuspendere il pellet cellulare con 50 μl di buffer di colorazione citometrica (fosfato tamponato salina (PBS) + 0,05% albumina bovina serba (BSA)). </li><li> Le cellule macchie con un pannello di anticorpi ( ad esempio , CD3 brillante violetta (BV) 510 (UCHT1), CD4 allophycocyanine-H7 (APC-H7) (SK3), CCR7 phycoerythrin (PE) -A, CD45RO PE-cianina 7 (PE- Cy7) -A, e segnale di cellule vivo / morte 7-ADD) a temperatura ambiente per 20 - 30 minbuio. Usare gli anticorpi direttamente dalla scorta secondo il protocollo del produttore. NOTA: Per la concentrazione di anticorpi, utilizzare 2,5 μL di CD3-BV510, 1,25 μL di CD4-APC-H7, CD45RO-PE-Cy7, 7-AAD e 10 μL di CCR7-PE. Utilizzare le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) per titolare le diverse concentrazioni degli anticorpi. Per la titolazione, prendere la concentrazione di anticorpi menzionata nel protocollo del produttore e utilizzare metà e un quarto della concentrazione raccomandata. Utilizzare la concentrazione minima di anticorpi per evitare lo spargimento di altri canali fluorochromici. Sono stati osservati segnali chiari con le citate concentrazioni di anticorpi. La compensazione è stata effettuata sperimentando inizialmente PBMC secondo il protocollo citato in Williams et al . 20 Per la sperimentazione, i PBMCs sono stati incubati con lo stesso insieme di anticorpi utilizzati qui e compensati confrontando singole e multiple anticorpi. </li><li> Dopo il periodo di incubazioneAggiungere 1 ml di tampone di colorazione al tubo, mescolare bene e centrifugare a 450 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Riposizionare le cellule in 200 μl di tampone di colorazione. </li><li> Eseguire campioni su una macchina di citometria a flusso. <ol><li> Prima di acquisire i dati, calibrare le tensioni del canale del citometro di flusso con le perle di configurazione e tracciamento dei citometri (CS &amp; T) per normalizzare l&#39;acquisizione di dati in giorni diversi secondo le istruzioni del produttore. <ol><li> Aprire il software di raccolta dati di cytometria a flusso, fare clic sul pulsante &quot;Imposta e QC&quot;, scegliere il numero corretto di lotto per CS &amp; T, caricare le sfere e quindi fare clic sul pulsante &quot;Avvio&quot;. </li></ol></li><li> Riposizionare le celle premendo delicatamente il tubo prima di caricare i campioni sulla macchina. Aprire il software di raccolta dati e fare clic su &quot;Anteprima&quot;. Quando la soglia di soglia è stabile, fare clic su &quot;Acquisisci&quot;. Monitorare il livello del campione e fare clic su &quot;Stop&quot; quando i campioni esauriscono. NOTA: acquisire 10.000 eventi per campione. </li&gt; <li> Dopo aver acquisito 10.000 eventi, generare un diagramma a punti SSC-A e FSC-A nel foglio di lavoro. <ol><li> Fai clic sul pulsante &quot;Polygon Gate&quot; e disegna una porta (questo è P1) su tutti gli eventi con un valore FSC-A&gt; 5 x 10 4 per escludere i detriti. Fai clic su &quot;Crea un grafico a punti&quot; per generare un nuovo grafico a punti, fai clic destro sulla macchia di punti, scegli &quot;Proprietà&quot; per aprire la finestra &quot;Plot Editor&quot; e quindi scegliere &quot;P1&quot;. Fai clic sul FSC-A sull&#39;asse x del puntino P1, cambialo su CD3-BV510. Disegna un &#39;&#39; Polygon Gate &#39;&#39; per scegliere la popolazione CD3 + e denominarla &#39;&#39; P2 &#39;&#39;. </li><li> Fai clic su &quot;Crea un grafico a punti&quot; per generare un nuovo grafico a punti, fai clic destro sulla macchia di punti, scegli &quot;Proprietà&quot; per aprire la finestra &quot;Plot Editor&quot;. Fai clic sul FSC-A sull&#39;asse x della trama del puntino P2 e cambiala in 7-AAD. Disegna un &#39;&#39; Polygon Gate &#39;&#39; per 7-AAD - popolazione e scegli &#39;&#39; P3 &#39;&#39;. P3 qui è CD3 +Cellule vive. </li><li> Fai clic su &quot;Crea un grafico a punti&quot; per generare un nuovo grafico a punti, fai clic destro sulla macchia di punti, scegli &quot;Proprietà&quot; per aprire la finestra &quot;Plot Editor&quot;. Fare clic sul CD3-BV510 sull&#39;asse x e sul CD4-APCH7 sull&#39;asse y del tracciato dot P3. Disegnare i Rectangle Gates sui lati superiore e inferiore del quadrante e scegliere rispettivamente &quot;P4&quot; e &quot;P5&quot;. P4 è live CD3 + CD4 + e P5 è CD3 + CD4 - T live. </li><li> Fai clic su &quot;Crea un grafico a punti&quot; per generare un nuovo grafico a punti, fai clic destro sulla macchia di punti, scegli &quot;Proprietà&quot; per aprire la finestra &quot;Plot Editor&quot;. Fare clic sul CD45RO PE-Cy7 sull&#39;asse x e sul CCR7-PE sull&#39;asse y di entrambe le tracce P4 e P5. Disegna &quot;Quad Gate&quot; su questa trama di punti. NOTA: Il lato superiore destro, il lato destro superiore, il lato inferiore destro e i quadranti laterali inferiori a sinistra sono ingenui, la memoria centrale (T CM ), e(T EM ), rispettivamente, le cellule T EMRA (TEMRA) differenziate terminalmente. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Thatcher, R. W., Darougar, S., Jones, B. R. <a target="_blank" href="http://jamanetwork.com/journals/jamaophthalmology/article-abstract/632182">Conjunctival impression cytology.</a> Arch Ophthalmol. 95 (4), 678-681 (1977).</li>
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<li>Behrens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunctional+tear+syndrome%3A+a+Delphi+approach+to+treatment+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Dysfunctional tear syndrome: a Delphi approach to treatment recommendations.</a> Cornea. 25 (8), 900-907 (2006).</li>
<li>Williams, G. P., Pachino, A., Long, H. M., Rauz, S., Curnow, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+production+and+antigen+recognition+by+human+mucosal+homing+conjunctival+effector+memory+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Opthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytokine production and antigen recognition by human mucosal homing conjunctival effector memory CD8+ T cells.</a> Invest Opthalmol Vis Sci. 55 (12), 8523-8530 (2014).</li>
<li>Bose, T., Lee, R., Hou, A., Louis, T., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+resident+memory+T+cells+in+the+human+conjunctiva+and+immune+signatures+in+human+dry+eye+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Tissue resident memory T cells in the human conjunctiva and immune signatures in human dry eye disease.</a> Sci Rep. 7, 45312(2017).</li>
<li>Williams, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dominant+human+conjunctival+epithelial+CD8alphabeta%2B+T+cell+population+is+maintained+with+age+but+the+number+of+CD4%2B+T+cells+increases%5BTitle%5D)+AND+%22Age+%28Dordr%29%22%5BJournal%5D)">The dominant human conjunctival epithelial CD8alphabeta+ T cell population is maintained with age but the number of CD4+ T cells increases.</a> Age (Dordr). 34 (6), 1517-1528 (2012).</li>
<li>Mrugacz, M., Zak, J., Bakunowicz-Lazarczyk, A., Wysocka, J., Minarowska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+HLA-DR+antigen+in+conjunctival+epithelial+cells+of+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of HLA-DR antigen in conjunctival epithelial cells of patients with cystic fibrosis.</a> Eye (Lond). 21 (8), 1062-1066 (2007).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano alcun interesse finanziario concorrente.

Si tratta di una tecnica facile, veloce e meno invasiva che può essere utilizzata nelle cliniche di out-patient per una profilatura immunitaria relativamente veloce in contrasto con le tecniche convenzionali come il raschiamento, la tamponatura, la pipettazione o la carta filtrante assorbente 1 , 2 . Una variante di questa tecnica è già stata utilizzata nelle impostazioni di ricerca 22 . La futura applicazione della metodologia proposta è quella di stratificare pazienti in studi clinici con malattie oculari, in particolare quelle che richiedono l&#39;immunofenotipizzazione. Una grande sfida con questa tecnica è la relativamente poche cellule immunitarie recuperate dopo la raccolta e lo strappo delle impressioni. Il numero totale di CD3 + T cellule recuperate da quattro impressioni per singolo varia da ~ 500 a 1.000 cellule. I campioni oculari sono stati lavati prima dell&#39;analisi della citometria di flusso per un numero minimo di volte per evitare ulteriori perdite di celluleS. I passi critici e le sfide che rimangono all&#39;interno del protocollo sono una raccolta efficiente di campioni oculari e una corretta raschiatura della membrana per ottenere numeri superiori di cellule. Tuttavia, questa limitazione è improbabile che si propaghi verso un determinato fenotipo immunitario. La risoluzione dei problemi effettuata qui per massimizzare la resa delle cellule era ridurre il numero di passi di lavaggio dopo e prima dell&#39;incubazione degli anticorpi. Ci sono altre limitazioni per l&#39;utilizzo dell&#39;IC. Nei pazienti con superficie oculare gravemente cheratinizzata o fibrose, come nella sindrome di Steven Johnson, il rendimento cellulare può essere anche inferiore a quello di questo studio. La percentuale di cellule immunitarie può cambiare se i campioni vengono memorizzati anziché analizzati nello stesso giorno. È difficile prevedere se determinati tipi di cellule sono più resistenti all&#39;archiviazione rispetto ad altri. Studi precedenti hanno riportato elevati livelli di espressione HLA-DR nelle cellule epiteliali congiuntivali 23 , pertanto sarebbe interPer valutare la correlazione tra HLA-DR e livelli di cellule immunitarie specifiche. Le cellule immunitarie possono anche essere associate al livello di espressione delle chemochine. Questi temi dovrebbero essere affrontati negli studi futuri.

La citologia di impressione (IC) è stata eseguita per la prima volta nel 1977 da Thatcher et al . Hanno usato un disco di impressione in plastica per raccogliere le cellule congiuntivali dai pazienti anziché altre tecniche disponibili in quel momento come raschiatura, svuotamento o pipettatura 1 . La tecnica attuale di IC utilizza una carta filtrante assorbente 2 per imprimere la bulbar e la congiuntiva palpebrale e raccogliere lo strato superficiale delle cellule congiuntivali. Queste cellule, dopo aver raggiunto la loro fase finale di differenziazione, vengono continuamente sparse in lacrime 3 . Tre principali popolazioni di cellule sono presenti nei campioni IC: cellule epiteliali 4 , cellule calde 3 , 5 e tessuto linfoidale associato alla mucosa, ovvero cellule T efficaci associate all&#39;epitelio o cellule dendritiche 6 . Cellule di superficie oculari in IC samPossono essere analizzati mediante microscopia, reazione a catena di polimerasi di polimerasi a reazione inversa-transcriptasi (RT-PCR) 7 . La citometria a flusso è stata recentemente usata per analizzare le cellule immunitarie raccolte raschiando la membrana IC 8 . È interessante notare che IC 6 , 9 è stato usato per valutare molte malattie della superficie oculare, tra cui la cheratoconjunctivitis sicca, la carenza di vitamina A, la pemfigoide cicatrici, la malattia atopica, la cheratoconjunctivite limbica superiore, la cheratoconjunctivite viverna e la metaplasia squamosa epiteliale. IC è stato utilizzato anche per valutare l&#39;impatto delle lenti a contatto usurate, rilevare microbi superficiali oculari e verificare l&#39;efficacia terapeutica e la tolleranza degli interventi terapeutici negli studi longitudinali 10 , 11 , 12 . Il dispositivo medico (EyePrim) è supportato da un tipo di poliEterosolfone (PES) membrana da 0,2 μm, precedentemente convalidata per la tecnica della citometria oculare con citometria a flusso (flusso OSIC) e apre opportunità di utilizzare campionamenti longitudinali per monitorare la progressione della malattia e la risposta al trattamento ( ad es . Analisi dei leucociti intraepiteliali definiti come marker di malattia supposto per la fibrosi progressiva congiuntivale nella pemfigoide della membrana mucosa) 13 . I primi ricercatori hanno utilizzato filtri PES autoclavati che richiedevano l&#39;impressione manuale. Di conseguenza, la resa era variabile e dipendente dall&#39;utente. Il vantaggio di questo dispositivo medico è la facilità d&#39;uso, la pressione standardizzata (Pa o N / m 2 ) e consente ripetibilità, riproducibilità e recupero cellulare coerente. Questa tecnica è utile in una clinica out-patient perché non è chirurgica, è facile da eseguire e veloce. Si tratta di un dispositivo medico di classe I (sterile) secondo la direttiva 93/42 / CEE, CE 0499 (SNCH). Richiede soloL&#39;anestesia topica durante la procedura, che garantisce la manutenzione dell&#39;integrità della superficie oculare. Dopo IC, le cellule possono essere trattate immediatamente per la citometria a flusso. Inoltre, è possibile che i tecnici e gli infermieri non oftalmologici siano addestrati per campionare la superficie oculare. Nonostante il miglioramento del CI rispetto ad altre tecniche, rimangono diverse sfide. Ad esempio, potrebbero esservi variazioni dovute all&#39;area del campionamento e alle differenze regionali nella congiuntiva bulbar a seconda della posizione dell&#39;IC. Un&#39;altra fonte di variazione è dovuta all&#39;applicazione di diverse quantità di pressione durante l&#39;IC. Altre questioni metodologiche riguardano la standardizzazione dell&#39;elaborazione delle cellule: queste riguardano la durata e il metodo di fissazione e le condizioni di possibili stoccaggi che possono influenzare la stabilità del materiale campionato. L&#39;obiettivo generale di questa tecnica è quello di sviluppare un metodo di isolamento dei campioni di impressione oculare thaT è facile da usare, non invasivo e può essere applicato alla caratterizzazione immunologica dei campioni clinici.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagenti</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-umano CD3 BV510</td><td>BD Biosciences</td><td>563109</td><td></td></tr><tr><td>anti-umano CD4 APCH7</td><td>BD Biosciences</td><td>641398</td><td></td></tr><tr><td>anti-umano CD45RO PECy7</td><td>BD Biosciences</td><td>337168</td><td></td></tr><tr><td>soluzione 7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>555816</td><td></td></tr><tr><td>anti-umano CCR7 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>552176</td><td></td></tr><tr><td>Pippetes</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Anestesia locale</td><td>Alcaine</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceina soluzione sodica</td><td>Bausch & Lomb U.K Limited</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keratograph 5M</td><td>Oculus</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Lampada a fessura BioMicroscope</td><td>Haag Streit</td><td>BM900</td><td></td></tr><tr><td>EyePrim</td><td>Opia Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>FACS Verse</td><td>BD BioSciences</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad 6.0</td><td>Prism</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>FACSVerda software di analisi BD</td><td></td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

un modo non invasivo per isolare e fenotipo le cellule della conjunctiva

A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

Tradizionalmente, la citologia di superficie oculare viene studiata con tecniche come la tecnica della spatola e la tecnologia a spazzola. Il problema con queste tecniche è che possono indurre lesioni traumatiche sulla superficie dell&#39;occhio, che possono progredire per la cicatrice, la deformità delle palpebre, la carenza di cellule staminali limbali e in alcuni casi causare grande disagio al soggetto. Per evitare questi problemi clinici, è stata sviluppata la citologia di impronta (IC) per diagnosticare la malattia degli occhi asciutti e successivamente la neoplasia, la malattia atopica, la cheratoconjunctivite vera e la keratoconjunctivitis sicca. Tipicamente i medici tagliano manualmente i filtri nelle forme richieste e applicarle alla superficie oculare. Qui descriviamo come eseguire IC utilizzando un dispositivo medico disponibile in commercio. Qui viene spiegata questa tecnica seguita da immunofenotipizzazione mediante citometria a flusso. Questa tecnica richiede meno movimentazione manuale e provoca minori lesioni alla superficie oculare.

IC da questo dispositivo clinico ci ha permesso di isolare le cellule immunitarie della superficie oculare, mantenendo intatte la superficie oculare. La Figura 1 descrive come è stata eseguita l&#39;IC. Sono contrassegnati i diversi siti dell&#39;occhio da dove sono stati raccolti i campioni. La Figura 2 mostra il risultato rappresentativo della citometria a flusso prelevata da 10 controlli sani. Per il gating, utilizzare SSC e 7-AAD per distinguere tra cellule vive e morte. 7-AAD - le cellule sono identificate come cellule vive. Queste cellule vive sono ulteriormente caratterizzate da marker CD3 + e CD4 + . Inoltre, le popolazioni CD4 + e CD4 sono state ulteriormente caratterizzate come Naïve, TEM , T CM e T EMRA con i marcatori CCR7 e CD45RO. Tra le cellule CD3 + T, le cellule T della memoria efficace predominano nella superficie umana umana. In precedenza eXperimenti, è stato anche dimostrato che le cellule di memoria CD8 + sono le principali popolazioni nelle cellule T epiteliali congiuntivali tra le persone sane 20 . La Figura 3 mostra che le cellule T (T EM e T EMRA ) di memoria efficace CD4 + e CD8 + sono il principale sottoinsieme della superficie umana umana in 10 controlli sani studiati. Ogni popolazione menzionata nella figura viene notificata con il loro fenotipo di marcatori e con i nomi (Naïve, T CM , T EM , T EMRA ). I numeri in rosso indicano la percentuale della popolazione. I dati in questa figura sono rappresentati come media ± SEM <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig1.jpg" /> Figura 1: Raccolta di campioni IC dalla superficie dell&#39;occhio dal dispositivo di citologia di impressione. I campioni sono stati raccolti dalla lampadina temporaleRegione dell&#39;ar come mostrato. <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig2.jpg" /> Figura 2: Grafico a punti con la citometria di flusso. Sono state selezionate le cellule live 7-AAD. Le cellule CD3 + sono state prima gated, e questa popolazione è stata gated in CD4 + e CD4 - subsets. Le proporzioni di sottoinsiemi naïve (CCR7 + CD45RO - ), memoria centrale (CCR7 + CD45RO + ) e memoria degli effetti (CCR7 - CD45RO + ; CCR7 - CD45RO - ) sono stati determinati con l&#39;aiuto di marcatori CCR7 e CD45RO. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55591/55591fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig3.jpg" /> FIgure 3: sottotipi di cellule immunitarie in cellule CD4 + e CD8 + T di sana superficie umana umana. Distribuzione di sottoinsiemi di CD4 + e CD8 + congiunti, memoria centrale (T CM ) e memoria degli effetti (T EM e T EMRA ) in controlli umani sani; Ogni punto dati rappresenta una media individuale separata ± SEM mostrata. La percentuale della popolazione è contrassegnata come rosso sotto il nome di ciascuna delle popolazioni. La percentuale totale della popolazione è del 98%, poiché la popolazione CD4 + T EMRA non è stata inclusa nella suddetta scatterplot (modificata da Bose et al. 21 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55591/55591fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

La superficie oculare normale esposta è costituita da cornea e congiuntiva. Le cellule epiteliali, le cellule calde e le cellule immunitarie sono presenti nella congiuntiva. Qui viene descritta una tecnica non invasiva di citologia di impronta usando un dispositivo di citologia di impressione e una citometria a flusso per analizzare le cellule immunitarie nella congiuntiva.

Un modo non invasivo per isolare e fenotipo le cellule della Conjunctiva

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is ...

L'obiettivo generale di questa tecnica di citologia per impronta è ottenere un numero sufficiente di cellule per definire fenotipicamente in modo immunologico le cellule coinvolte nelle malattie della superficie oculare. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande nel campo della superficie oculare, come ad esempio quali cellule immunitarie siano importanti per l'infiammazione della superficie oculare. I principali vantaggi di questa tecnica sono la sua relativa non invasività e la semplicità di esecuzione in ambito clinico e di laboratorio.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia dei disturbi infiammatori della superficie oculare, poiché consente l'identificazione di popolazioni specifiche di cellule immunitarie. Questo metodo può fornire informazioni sulla popolazione di cellule immunitarie della superficie oculare. Può inoltre essere applicato allo studio della tossicologia oculare e della fibrosi oculare.Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà a causa della mancanza di esperienza nel manipolare il ridotto numero di cellule raccolte dall'occhio. Dopo aver determinato lo stato clinico del partecipante, applicare una o due gocce di anestetico topico sulla congiuntiva bulbare superiore e sul fornice inferiore degli occhi del partecipante. Attendere quattro o cinque minuti affinché la sensazione di pizzicore provocata dall'anestetico svanisca.Quindi posizionare un dispositivo per citologia dell'impronta tangenzialmente sulla congiuntiva del lato bulbare temporale e premere delicatamente tenendo premuto il pulsante per due o tre secondi. Utilizzando pinzette, rilasciare la membrana oculare raccolta in una provetta per microcentrifuga contenente un millilitro di mezzo di coltura, seguito da un minuto di raschiamento continuo della membrana con una punta per pipetta da 10 microlitri per recuperare le restanti cellule dal dispositivo. Prestare attenzione durante il raschiamento della membrana, poiché un eccessivo raschiamento provocherà una combinazione di detriti, mentre un raschiamento insufficiente può portare a un basso utilizzo cellulare.Quando la superficie della membrana diventa irregolare, ripetere un secondo prelievo dallo stesso occhio sul lato nasale dell'occhio, come appena dimostrato. Raccogliere le cellule con la prima sospensione campione oculare e prelevare due campioni dall'altro occhio del partecipante. Entro due o tre ore dal prelievo, centrifugare le cellule oculari e risospendere il pellet in 50 microlitri di Flow Cytometry Staining Buffer, contenente soluzione salina tamponata al fosfato integrata con albumina sierica bovina allo 0,05%.Successivamente, incubare le cellule con un pannello di anticorpi di interesse per 20-30 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule con un millilitro di buffer di marcatura e risospendere il pellet in 200 microlitri di buffer di marcatura fresco. Calibrare le tensioni dei canali del citofluorimetro nel pannello di configurazione del citometro e preparare un tubo con perle di controllo per normalizzare l'acquisizione dei dati seguendo le istruzioni del produttore.Quindi, nel software di acquisizione dati della citometria a flusso, fare clic su Setup QC e selezionare il numero di lotto corretto delle perle per la configurazione e il controllo del citometro. Caricare le perle e premere il pulsante Avvia. A questo punto, risospendere delicatamente la sospensione cellulare con leggeri colpetti e posizionare la provetta sull'apparecchio.Aprire il software di acquisizione dati e fare clic su Anteprima. Quando la velocità di soglia è stabile, fare clic su Acquisisci. Monitorare il livello del campione, facendo clic su Arresta quando il campione termina.Dopo aver acquisito 10.000 eventi, generare un grafico a dispersione di area di scattering anteriore rispetto a laterale e utilizzare lo strumento di selezione poligonale per tracciare una regione di popolazione che includa tutti gli eventi con un valore di area di scattering anteriore superiore a cinque volte 10 alla quarta, al fine di escludere i detriti. Fare clic su Crea grafico a dispersione per generare un nuovo grafico a dispersione. Fare clic con il tasto destro sul grafico e scegliere Proprietà per aprire la finestra Editor del grafico.Selezionare P1 e fare clic sull'area dello scatteraggio in avanti sull'asse x per modificare l'asse visualizzato in CD3. Aprire un nuovo diagramma a punti per la popolazione P2 e modificare l'asse x in 7-AAD. Tracciare una finestra intorno alla popolazione negativa per 7-AAD per selezionare le cellule vitali positive per CD3.Denominare questa finestra P3 e aprire un nuovo diagramma a dispersione. Nella finestra dell'editor dei grafici, selezionare CD3 per l'asse x e CD4 per l'asse y. Utilizzare ora le popolazioni P4 e P5 per aprire due nuovi diagrammi a dispersione e impostare gli assi x per visualizzare le cellule positive per CD45RO e gli assi y per visualizzare le cellule positive per CCR7 in ciascun grafico.Quindi creare una finestra P6 intorno alle cellule CD3 positive, CD4 positive, CCR7 positive, CD45RO positive e finestre P7, P8 e P9 intorno alle cellule CD3 positive, CD4 negative, CCR7 positive, CD45RO positive; cellule CD3 positive, CD4 negative, CCR7 negative, CD45RO negative e cellule CD3 positive, CD4 negative, CCR7 negative, CD45RO positive, rispettivamente. Le popolazioni CD4 positive e CD4 negative possono essere caratterizzate come linfociti T della memoria centrale CD45RO positivi, CCR7 positivi e linfociti T della memoria effettrice CD45RO positivi, CCR7 negativi.E CD45RO negativo, CCR7 negativo, T con memoria effettore differenziato in modo terminale in base all'espressione dei marcatori CCR7 e CD45RO. Tra questi sottoinsiemi, le cellule T CD4 positive e le cellule T CD8 positive con memoria effettore sono la principale sottopopolazione di cellule T tipicamente osservata sulla superficie oculare di soggetti umani sani. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata entro due ore, se eseguita correttamente.Nel frattempo, è possibile eseguire altre procedure come ELISA, Western blot e altri studi per rispondere ad ulteriori domande sui citochine e sui geni coinvolti nel percorso di segnalazione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo degli studi sulla superficie oculare per valutare i diversi tipi di cellule immunitarie all'interno di una specifica popolazione di pazienti di interesse. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire la citologia per impressione e di come isolare ed elaborare le cellule immunitarie dalla superficie oculare.

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