Un modello di ratto di occhi seccari autoimmuni cronici con un aumento delle cellule T di memoria di Effector in tessuto Eyeball

L'obiettivo generale di questa procedura è indurre le caratteristiche cliniche della disfunzione lacrimale e dell'infiammazione della ghiandola lacrimale nei ratti utilizzando l'immunizzazione sottocutanea e l'iniezione sottocongiuntivale e intralacrimale di estratti della ghiandola lacrimale per la valutazione delle terapie nell'occhio secco autoimmune. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nell'occhio secco, ad esempio se i farmaci che sopprimono le cellule T nelle malattie autoimmuni sono efficaci. Il vantaggio principale di questa tecnica, produce segni di malattia oculare simili all'occhio secco umano e quantifica anche le cellule T che si infiltrano nella ghiandola lacrimale e nell'occhio.

Le implicazioni di questo modello animale si estendono alla comprensione del traffico dei linfociti perché la milza e i linfonodi possono essere studiati. In generale, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà a causa della mancanza di strumentazione adeguata per documentare i cambiamenti nell'occhio del piccolo ratto. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto alcuni passaggi sono difficili da imparare a causa della rapida essiccazione dell'occhio del ratto e della mancanza di battiti di ciglia dopo l'anestesia.

Dopo aver soppresso una femmina di ratto Sprague Dawley secondo il protocollo di testo, posiziona l'animale con un orecchio appoggiato al tavolo e l'altro rivolto verso l'alto. Con un paio di forbici, praticare un'incisione di 10 millimetri superiormente-inferiormente sotto l'orecchio esposto. Quindi, rimuovere la ghiandola lacrimale sezionandola dal tessuto connettivo circostante e dal condotto di drenaggio.

Quindi, usando le forbici, tritare il fazzoletto il più finemente possibile sul ghiaccio. Quindi, aggiungere 150 microlitri di PBS con 1X inibitore della proteasi per ghiandola lacrimale. Con il sonicatore impostato su 10 secondi di accensione, 10 secondi di spegnimento e 30% di ampiezza, sonicare i campioni sul ghiaccio a 20 kilohertz per cinque minuti.

Quindi, centrifugare i campioni sonicati a 13.000 volte g e quattro gradi Celsius per 20 minuti. Trasferire il surnatante in una nuova provetta. Quindi, aliquotare il surnatante in provette da 1,5 millilitri e conservarle a meno 80 gradi Celsius.

Trasferire l'adiuvante di Freund completo contenente cinque milligrammi per millilitro di Mycobacterium tuberculosis H37Ra o l'adiuvante di Freund incompleto in una provetta da 50 millilitri, assicurandosi che il volume dell'adiuvante della miscela di antigeni sia in un rapporto di uno a uno. Aggiungere la miscela di antigene contenente due milligrammi per millilitro di ovoalbumina e 10 milligrammi per millilitro di estratto della ghiandola lacrimale goccia a goccia nella soluzione adiuvante mentre si agita con la massima velocità che non provoca fuoriuscite. Continuare a vorticare per cinque minuti dopo che tutto l'antigene è stato aggiunto.

Trasferire l'emulsione in una siringa da cinque millilitri e utilizzare un connettore per siringa per collegarla con un'altra siringa da cinque millilitri. Quindi, spingere l'emulsione da una siringa all'altra per mescolarla. Il giorno zero, distribuire 200 microlitri di emulsione, che contiene un milligrammo di estratto di ghiandola lacrimale e 200 microgrammi di ovoalbumina in adiuvante completo di Freund, in siringhe Luer lock da un millilitro e dotare le siringhe di aghi da 27 gauge.

Senza usare l'anestesia, iniettare per via sottocutanea l'emulsione alla base delle code di topo. Quindi, il giorno 14, in modo simile, iniettare 200 microlitri dello stesso antigene nell'adiuvante di Freund incompleto. Lo stesso giorno, iniettare per via intraperitoneale 300 nanogrammi di tossina della pertosse in 100 microlitri di PBS.

Il giorno 48, pesare la quantità richiesta di ovoalbumina e scioglierla in PBS. Quindi, combina l'ovoalbumina con l'estratto di ghiandola lacrimale scongelato preparato in precedenza in questo video, creando una soluzione antigenica contenente un milligrammo per millilitro di ovoalbumina e un milligrammo per millilitro di estratto di ghiandola lacrimale. Dopo aver anestetizzato il ratto, iniettare cinque microlitri di antigene nella sottocongiuntiva fornicolare dell'occhio.

Quindi, iniettare 20 microlitri di antigene nella ghiandola lacrimale. Mentre si tiene in mano un ratto anestetizzato secondo il protocollo di testo, per misurare il volume lacrimale con il filo rosso fenolo, utilizzare un paio di pinze per tenere il filo e un altro per tirare la palpebra inferiore del ratto. Posizionare il filo nell'angolo prossimale del fornice inferiore per un minuto, quindi rimuovere il filo.

Quindi, posiziona il filo accanto a un righello con segni millimetrici e scatta un'immagine della lunghezza della parte bagnata del filo. Per misurare la levigatezza lacrimale della cornea, posizionare il ratto sotto uno stereomicroscopio dotato di un illuminatore anulare e di una fotocamera. Quindi, applicare cinque microlitri di soluzione salina sulla cornea del ratto.

Con le dita guantate, sbatti le palpebre passivamente muovendo le palpebre superiore e inferiore circa cinque volte per diffondere la soluzione salina. Con un ingrandimento inferiore a 1,6 volte, focalizzare l'illuminatore anulare al centro della superficie della cornea. Quindi, dopo 10 secondi, acquisire immagini fotografiche.

Utilizzare la scansione con fluoresceina per misurare il danno corneale aggiungendo due microlitri di fluoresceina allo 0,2% alla cornea del ratto. Con un dito guantato, apri e chiudi passivamente le palpebre del ratto tre volte per stendere il colorante fluoresceina sulla superficie dell'occhio. Dopo un minuto, utilizzare una siringa da tre millilitri per aspirare un millilitro di soluzione fisiologica.

Quindi, posizionare la siringa a circa due o tre millimetri anteriormente alla cornea e applicare delicatamente la soluzione salina sull'occhio. Con la luce di fondo spenta, acquisire le immagini sotto il filtro blu cobalto di un microscopio per immagini oculari. Dopo l'eutanasia del ratto secondo il protocollo di testo, usa le forbici per rimuovere le palpebre superiori e inferiori.

Libera il globo recidendo i muscoli extraoculari, il nervo ottico e la congiuntiva fornicale. Fai un'incisione per aprire il bulbo oculare. Rimuovere la lente in vitreo.

Quindi, metti i bulbi oculari sezionati in tubi da 1,5 millilitri su ghiaccio. Infine, raccogli le ghiandole lacrimali come descritto in precedenza in questo video. Questa figura mostra immagini rappresentative dei fili rosso fenolo dal ratto di controllo e DED.

La lunghezza dei fili rosso fenolo nel gruppo DED è più corta rispetto al gruppo di controllo, indicando un volume di strappo inferiore. La fluoresceina si lega all'epitelio corneale danneggiato e quindi viene utilizzata per misurare l'entità del danno. In questo esperimento, le macchie di fluoresceina sulla superficie corneale dei ratti DED sono state classificate da zero a due e confrontate con i ratti di controllo.

I ratti con DED hanno più colorazione con fluoresceina rispetto ai ratti di controllo, suggerendo un danno corneale. Come si vede qui, se la superficie corneale è liscia con un'elevata stabilità lacrimale, l'immagine dell'anello illuminatore sulla superficie oculare è rotonda e perfetta. La distorsione dell'immagine indica una ridotta levigatezza corneale e un film lacrimale instabile, come è stato osservato con un grado di distorsione più elevato nel gruppo DED.

Questa analisi di citometria a flusso mostra che il sottogruppo predominante di cellule T nei tessuti normali del bulbo oculare di ratto sono le cellule T effettrici di memoria. Nei bulbi oculari dei ratti DED, circa il 70% delle cellule T CD3-positive sono cellule T effettrici di memoria, mentre nei ratti di controllo questo numero è di circa il 50%I bulbi oculari dei ratti DED hanno cellule T effettrici di memoria significativamente più elevate rispetto a quelle dei ratti di controllo. Dopo questa procedura, è possibile eseguire la colorazione per altri tipi di cellule immunitarie per rispondere a ulteriori domande.

Ad esempio, puoi colorare le cellule immunitarie innate o i linfociti B. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per comprendere l'immunologia della superficie oculare e, inoltre, per studiare l'occhio secco nell'uomo e la sindrome di Sjogren. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come indurre l'occhio secco autoimmune nei ratti e condurre una solida documentazione dei risultati.