Name: Ablazione chirurgica Assay per lo studio degli occhi Rigenerazione in Planarie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Impara l'ablazione chirurgica degli occhi nelle planarie per studiare la rigenerazione oculare e la biologia delle cellule staminali. Questa tecnica minimizza i danni ai tessuti circostanti.

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Gli autori desiderano ringraziare Michelle Deochand per perfezionare questa tecnica di ablazione dell&#39;occhio, Taylor Birkholz per l&#39;assistenza con il saggio funzionale, Michael Levin per l&#39;anticorpo anti-arrestina, e Junji Morokuma per informazioni sulle piastre Peltier. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione SFSA da Western Michigan University per WSB.

1. Cultura e trattamento degli animali NOTA: Questo protocollo utilizza mediterranea Schmidtea, una specie planaria diploide con un genoma sequenziato 16, 17 che viene comunemente utilizzato per la ricerca di rigenerazione. Tuttavia, l&#39;analisi è altrettanto successo con altre specie, quali Girardia tigrina e Girardia dorotocephala (che sono disponibili in commercio). <ol><li> Mantenere vermi &quot;acqua verme&quot; fatta da 0,5 g sali / L di mare in ultrapura (o filtrata deionizzata) acqua. Utilizzare sterili contenitori in polipropilene o vetro per tenere l&#39;acqua verme. Vedere <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55594/Supplementary_File_1.docx" target="_blank">file supplementare 1</a> per i dettagli sulla produzione di acqua verme. NOTA: Non usare mai sapone per pulire i contenitori (o di altri fornitori) come il sapone è tossico per i vermi; invece strofinata con 70% etanolo e lasciare asciugare all&#39;aria. &lt;ol&gt; <li> Indossare guanti durante il lavoro con planaria per proteggerli dalla contaminazione. NOTA: I vermi sono molto sensibili alle tossine e sostanze chimiche ambientali, tra cui il sapone, candeggina, shampoo, balsamo e crema per le mani. </li></ol></li><li> colonie case in contenitori per alimenti polipropilene, con il coperchio parzialmente aperto lasciati per lo scambio aria a ~ 20 ° C (temperatura ambiente). Negozio vermi sperimentali in entrambe le capsule di Petri (20 vermi per piastra 100 mm) o lastre non trattate tessuto-coltura (1 verme per pozzetto, per piastre da 12 pozzetti). Per ridurre lo stress, tenere entrambe le colonie e gli esperimenti nel buio. NOTA: Le colonie devono avere non più di 500-1000 vermi per litro d&#39;acqua a vite senza fine. Per gli esperimenti, lasciare coperchi pienamente in atto, dal momento che il flusso d&#39;aria è stato progettato in questi piatti. </li><li> Nutrire i vermi non sperimentali volta alla settimana con purea carne biologica o fegato di pollo facendo cadere purea da una pipetta di trasferimento, mettendo gocce di cibo in tutto il contenitore. Lasciare Worms 2 h di consumare cibo inbuio prima di pulire il contenitore (vedi passo 1.4). Prima dell&#39;uso, purea di conservare a -20 ° C per brevi periodi (settimane) o -80 ° C per il lungo termine (mesi); non ricongelare purea per il riutilizzo (come batteri possono fiorire e danneggiare i vermi). NOTA: fegato non deve contenere ormoni o antibiotici e preferibilmente non essere congelati in precedenza. Centrifugare purea prima del congelamento (o prima dell&#39;alimentazione) per rimuovere l&#39;aria e impediscono cibo da galleggiante. Il cibo dovrebbe depositarsi sul fondo del contenitore. 1 ml di purea è sufficiente per 500-1.000 vermi. </li><li> acqua di cambio una volta alla settimana con acqua fresca senza fine per entrambe le colonie e gli esperimenti. contenitori colonia dovrebbero essere puliti con un tovagliolo di carta greggi (per rimuovere i residui di muco che i rifiuti trappola) una volta alla settimana per fame vermi, o due volte alla settimana per vermi alimentazione (2 h dopo l&#39;alimentazione e ancora 2 giorni più tardi). Al fine di mantenere il biofilm, non pulire più dell&#39;80% del contenitore. </li><li> Spostare vermi tra i contenitori (o setu chirurgiap) utilizzando una pipetta di trasferimento. Per vermi liberi aderito superfici del contenitore, spruzzare acqua sopra / dietro il verme per sganciarlo dalla superficie. Poi aspirare il verme nella pipetta, cercando di mantenere il worm all&#39;interno della porzione di fondo pollici (più sottile) della pipetta. <ol><li> pipette rinviare la con una piccola quantità di acqua verme prima di succhiare. </li><li> Provare a spostare l&#39;acqua intorno alla vite senza fine, piuttosto che il worm stesso, per aiutare a prevenire strappi vermi dal corpo molle toccandoli con la pipetta. </li><li> Mantenere piatti sperimentali coperte salvo trasferimento vermi o sostituzione dell&#39;acqua. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione <ol><li> Smettere di alimentare i vermi almeno una settimana prima di esperimenti. <ol><li> Selezionare worm che non sono stati ricevuto per almeno ≥1 settimana e sono almeno 5-7 mm di lunghezza. Trasferire i vermi ad una piastra di Petri 2/3 con acqua verme, e confermare la lunghezza verme facendo scorrere un righello sotto il piatto. Misura wORM mentre completamente estese e in movimento. NOTA: Anche se più piccolo (5-7 mm) vermi funzionano meglio durante l&#39;esecuzione successiva immunofluorescenza e analisi situ, vermi più grandi (8-10 mm) sono più facili da lavorare - soprattutto quando si impara per l&#39;ablazione. </li><li> Assicurarsi che i vermi sono tutto, non danneggiato, e non recentemente rigenerante. NOTA: Rigenerazione vermi avranno molto più leggero (o no) pigmento nella testa e / o della regione di coda rispetto ai vermi normali. </li><li> Se l&#39;esecuzione di RNAi o trattamenti farmacologici di vermi, farlo a questo punto. Se i vermi sono stati alimentati come parte del trattamento (come per RNAi), attendere almeno 7 giorni dopo l&#39;ultima alimentazione prima di passare al punto 2.2. </li></ol></li><li> Pulire il microscopio base spaziale lavoro e dissezione con il 70% di etanolo e lasciare asciugare completamente. Posizionare il piatto di vermi selezionati a sinistra del campo di applicazione. A destra del campo di applicazione, inserire un paio di # 5 forcipe, un 31 G 5/16-inch ago da insulina con un 1mL siringa, e un trasferimento pipetta pulita. <ol><li> Assicurarsi che gli strumenti sono mantenuti tocchi il banco (che potrebbe introdurre contaminanti). Utilizzare un elemento rigido (ad esempio un resto della bacchette) per mantenere la pinza, l&#39;ago, e pipetta pulita. In alternativa, posizionare gli strumenti sulla parte superiore di un marrone (greggio) tovagliolo di carta fresca. NOTA: Queste e le successive istruzioni sono scritte in cui riguardano gli individui destri. individui mancini dovrebbero invertire la destra / sinistra le direzioni. </li></ol></li><li> Accanto alla spazio di lavoro, mettere una casella di salviette panno liscio, una fonte di acqua fresca a vite senza fine, e alcune pipette di trasferimento extra (protetti dal banco). Posto acqua verme in una bottiglia di lavaggio in plastica per facilità di erogazione. Anche inserire un piatto marcato 12 pozzetti (o 100 a Petri) a destra del campo di applicazione raccoglie gli animali ablazione. </li><li> Se si utilizza una piastra Peltier su misura per immobilizzare i vermi, posizionare la piastra Peltier nella depressione in tha basamento del microscopio da dissezione e regolare l&#39;uscita del generatore di tensione CC finché la superficie di lavoro della piastra Peltier è sufficientemente fredda (tipicamente ~ 5 V) .Alternatively, fare una piastra fredda riempiendo una capsula Petri mm 100 metà con acqua e congelare per almeno 24 h. Scartare il coperchio e posizionare il fondo del piatto 100 mm base della portata dissezione, quindi posizionare il coperchio di un piatto 60 mm Petri capovolta direttamente sulla superficie del ghiaccio (Figura 1A). <ol><li> Dopo che l&#39;acqua è congelato nel piatto 100 mm, un &quot;vulcano&quot; di ghiaccio può apparire nel centro della piastra. Se questo accade, usare una lama di rasoio per raschiare il piatto ghiaccio, per eliminare irregolarità dalla superficie. NOTA: durante interventi chirurgici il ghiaccio si scioglierà, rendendo ablazioni molto più difficile. Preparare diversi piatti di ghiaccio in anticipo, e sostituire quelli congelati per la fusione quelli durante il dosaggio non appena il coperchio del piatto 60 millimetri inizia flottante. </li></ol></li><li> preparare lasuperficie chirurgia. Tagliare un pezzo 5 cm x 10 cm di parafilm plastica (4 cm 2 se si utilizza la scatola di Petri piastra fredda) e posizionarlo sul centro del dispositivo di immobilizzazione. Piegare un panno liscio pulire in un quadrato circa 2 cm 2 e posizionarlo sopra del film. Tagliare un pezzo di filtro di carta bianca 1,5-2 cm 2 e posizionarlo sulla parte superiore del wipe. Vedere Figura 1B-1E. <ol><li> Tenere il piegata pulire in posizione con un dito guantato, e utilizzare l&#39;acqua senza fine per inumidire leggermente la salvietta per garantire che rimanga piegato. Usare il lato di una pipetta di trasferimento a rotolare la salvietta piatta. NOTA: la temperatura fredda aiuta a mantenere i vermi di muoversi. Lavorare &quot;a secco&quot; aiuta anche nella immobilizzazione. Il tessuto wipe agisce per favorire l&#39;acqua attraverso la carta da filtro, mantenendo il verme umido durante l&#39;intervento chirurgico senza consentire vermi asciugare completamente (che è letale). </li></ol></li></ol> 3. ablazione chirurgica <ol><li> Utilizzare una pipetta di trasferimento di immettere sullato e verme dorsale fino sulla carta da filtro. Accendere la sorgente luminosa e dirigere le goosenecks in modo che la luce si concentra sul verme. Regolare la messa a fuoco dissezione portata e ingrandimento in modo che gli occhi sono chiaramente visibili (l&#39;intero verme non ha bisogno di essere in vista); Ingrandimento 5X è un buon punto di partenza. Orientare il verme ruotando il parafilm modo che la testa sia puntato verso il ricercatore (verso la parte anteriore del microscopio), angolati 30-40 gradi verso destra. <ol><li> Evitare l&#39;uso di luce intensa per impedire il movimento verme in eccesso. Planarians mostrano fototassi negative e tenterà di eludere luce. </li><li> Se la vite è posizionato lato ventrale rivolto verso l&#39;alto (con apertura visibile faringeo), usare il lato opaco della pinza per riposizionare delicatamente il lato dorsale verme alto (con gli occhi visibili). Evitare di avvicinarsi l&#39;animale con la punta affilata della pinza per ridurre al minimo la possibilità di strappare attraverso i tessuti molli quando riposizionamento l&#39;animale. </li><li&gt; Regolare il fuoco microscopio in modo che gli occhi sono chiaramente a fuoco. Assicurarsi inoltre che entrambi gli occhi e tessuti testa circostanti sono in vista. </li></ol></li><li> Tenere un fresco ago / siringa nella mano destra come se fosse una penna (tra il pollice e l&#39;indice). Brace il pollice sinistra contro la piastra Peltier (o scatole Petri piastra fredda), e utilizzare il pollice sinistro come fulcro su cui poggerà la porzione di fondo della siringa (Figura 2A). Guardare attraverso il microscopio, e assicurarsi che la smussatura dell&#39;ago è visibile. NOTA: Gli aghi sono molto taglienti. Siate cauti quando loro manipolazione. Indossare guanti di lattice o di nitrile in grado di offrire una certa protezione. <ol><li> Utilizzare il pollice sinistro per contribuire a tenere l&#39;ago / siringa costante durante tutta la procedura ed evitare di stringere la mano. </li><li> Formare un angolo di circa 40 ° con il pollice sinistro e l&#39;indice di sinistra (con il dito indice sulla superficie chirurgia) per contribuire a tenere la superficie stabile chirurgia. </li></ol></li><li> Conla smussatura dell&#39;ago rivolta verso l&#39;alto (come un cucchiaio), posizionare l&#39;ago perpendicolarmente alla dell&#39;occhio (Figura 2B). Utilizzare la punta dell&#39;ago per penetrare delicatamente lo strato sottile di tessuto sovrastante la tazza ottico (bianco, regione non pigmentato) dell&#39;occhio, raccogliendo da destra a sinistra. Molto rimuovere delicatamente qualsiasi tessuto pigmentato situato all&#39;interno della coppa ottica, facendo attenzione a non forare il fondo o distruggere i confini della coppa ottica. <ol><li> Se il verme è stato sulla carta da filtro per&gt; 1-2 min in qualsiasi momento durante la procedura, aggiungere una goccia di acqua verme per reidratare il verme. NOTA: La disidratazione aumenta la suscettibilità del verme a lesioni ripping. </li></ol></li><li> Ripetere passaggio 3.3 finché tutti i tessuti pigmentati neri (cellule pigmento), così come tutti i tessuti bianchi della coppa ottica (dendriti dei fotorecettori), vengono rimossi. Rimuovere tessuti asportati bloccato fino alla fine dell&#39;ago con attenzione strofinando con un tessuto wipe. Se doppio Abla occhiozione è desiderato, ablazione del secondo occhio a questo punto. NOTA: Per evitare lesioni, aghi può essere pulito afferrando l&#39;ago con un panno pulito wipe tenuto con il pollice e l&#39;indice, poi con l&#39;altra mano per tirare l&#39;ago attraverso la spazzare via dal pollice e l&#39;indice. In alternativa, l&#39;ago può essere pulito sulla superficie di un tessuto wipe ed esaminato per la pulizia. </li><li> Al termine, utilizzare una pipetta di trasferimento per spostare il verme ad un piatto etichetta contenente acqua verme fresca. Se l&#39;analisi dei dati gruppo mettere fino a 20 vermi in un singolo 100 millimetri piastra Petri. Se il monitoraggio rigenerazione negli stessi individui nel corso del tempo, mettere 1 verme in ciascun pozzetto di una 12-pozzetti. Una volta che tutti i vermi sono trasferiti, risciacquare vermi rimuovendo tutta l&#39;acqua verme dalle stoviglie / pozzetti e sostituendo con più acqua verme fresca. <ol><li> Per rimuovere i vermi dal filtro, ritardare l&#39;pipetta con una piccola quantità di acqua vite senza fine e rilasciare l&#39;acqua sulla vite senza fine. Questo dovrebbe alzare tegli verme fuori la carta da filtro, da subito risucchiato nella pipetta per il trasferimento. </li></ol></li><li> Incubare esperimenti a ~ 20 ° C (temperatura ambiente) al riparo dalla luce e seguire il processo rigenerativo. NOTA: Worms possono essere memorizzati in un incubatore a temperatura controllata per mantenere una temperatura costante, ma ciò non è strettamente necessario. La maggior parte delle temperatura ambiente variano solo da + 5 ° C, che non alteri la capacità del verme di rigenerare. </li><li> Se lo si desidera, fissare vermi per immunoistochimica (vedi figure 3-4) e / o ibridizzazione in situ analisi dell&#39;espressione genica. Esistono diversi metodi di fissazione per immunoistochimica planarian 18, 19, 20 e ibridazione in situ 21, 22, 23 protocolli. </li><li> Quando gli esperimenti sono concluse, sacrifice vivere vermi mediante eliminazione di acqua verme dal piatto e sostituzione con etanolo al 70%. Incubare vermi per 3-5 minuti, controllando per i vermi per lisare e girare grigiastra. </li><li> Posizionare i vermi non trattati nel flusso dei rifiuti normali una volta sacrificato. Evitare di introdurre vermi vivi nell&#39;ambiente, in particolare le specie non indigene. </li></ol>

<ol><li>Gentile, L., Cebria, F., Bartscherer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+planarian+flatworm%3A+an+in+vivo+model+for+stem+cell+biology+and+nervous+system+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">The planarian flatworm: an in vivo model for stem cell biology and nervous system regeneration.</a> Dis Model Mech. 4 (1), 12-19 (2011).</li>
<li>Elliott, S. A., Sanchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+and+enduring+contributions+of+planarians+to+the+study+of+animal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The history and enduring contributions of planarians to the study of animal regeneration.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (3), 301-326 (2013).</li>
<li>Emili Saló, R. B. Chapter 3. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEmili+Sal%C3%B3%2C+RB+%22Animal+Models+in+Eye+Research%22">Animal Models in Eye Research</a>. Tsonis, P. A. , Academic Press. 15-26 (2008).</li>
<li>Lapan, S. W., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dlx+and+sp6-9+Control+optic+cup+regeneration+in+a+prototypic+eye%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">dlx and sp6-9 Control optic cup regeneration in a prototypic eye.</a> PLoS Genet. 7 (8), e1002226(2011).</li>
<li>Lapan, S. W., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+the+planarian+eye+identifies+ovo+as+a+specific+regulator+of+eye+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of the planarian eye identifies ovo as a specific regulator of eye regeneration.</a> Cell Rep. 2 (2), 294-307 (2012).</li>
<li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+functional+recovery+of+the+planarian+photosensing+system+during+head+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Zoolog+Sci%22%5BJournal%5D)">Morphological and functional recovery of the planarian photosensing system during head regeneration.</a> Zoolog Sci. 21 (3), 275-283 (2004).</li>
<li>Pineda, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+network+of+prototypic+planarian+eye+regeneration+is+Pax6+independent%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The genetic network of prototypic planarian eye regeneration is Pax6 independent.</a> Development. 129 (6), 1423-1434 (2002).</li>
<li>Paskin, T. R., Jellies, J., Bacher, J., Beane, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planarian+Phototactic+Assay+Reveals+Differential+Behavioral+Responses+Based+on+Wavelength%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Planarian Phototactic Assay Reveals Differential Behavioral Responses Based on Wavelength.</a> PLoS One. 9 (12), e114708(2014).</li>
<li>Raffa, R. B., Martley, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine-induced+increase+in+planarian+locomotor+activity+and+block+by+UV+light%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Amphetamine-induced increase in planarian locomotor activity and block by UV light.</a> Brain Res. 1031 (1), 138-140 (2005).</li>
<li>Sandmann, T., Vogg, M. C., Owlarn, S., Boutros, M., Bartscherer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+head-regeneration+transcriptome+of+the+planarian+Schmidtea+mediterranea%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">The head-regeneration transcriptome of the planarian Schmidtea mediterranea.</a> Genome Biol. 12 (8), R76(2011).</li>
<li>Vasquez-Doorman, C., Petersen, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NuRD+complex+component+p66+suppresses+photoreceptor+neuron+regeneration+in+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">The NuRD complex component p66 suppresses photoreceptor neuron regeneration in planarians.</a> Regeneration (Oxf). 3 (3), 168-178 (2016).</li>
<li>Deochand, M. E., Birkholz, T. R., Beane, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+regulation+of+planarian+eye+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration%22%5BJournal%5D)">Temporal regulation of planarian eye regeneration.</a> Regeneration. 3 (4), 209-221 (2016).</li>
<li>Sakai, F., Agata, K., Orii, H., Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+regeneration+ability+of+spontaneous+supernumerary+eyes+in+planarians+-eye+regeneration+field+and+pathway+selection+by+optic+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Zoolog+Sci%22%5BJournal%5D)">Organization and regeneration ability of spontaneous supernumerary eyes in planarians -eye regeneration field and pathway selection by optic nerves.</a> Zoolog Sci. 17 (3), 375-381 (2000).</li>
<li>Asano, Y., Nakamura, S., Ishida, S., Azuma, K., Shinozawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin-like+proteins+in+planarian+eye+and+auricle%3A+detection+and+functional+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin-like proteins in planarian eye and auricle: detection and functional analysis.</a> J Exp Biol. 201 (Pt 9), 1263-1271 (1998).</li>
<li>Cross, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Maintenance+and+Regeneration+of+Planarian+Eyes+by+ovo%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Control of Maintenance and Regeneration of Planarian Eyes by ovo.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7604-7610 (2015).</li>
<li>Robb, S. M., Gotting, K., Ross, E., Sanchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SmedGD+2.0%3A+The+Schmidtea+mediterranea+genome+database%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">SmedGD 2.0: The Schmidtea mediterranea genome database.</a> Genesis. 53 (8), 535-546 (2015).</li>
<li>Robb, S. M., Ross, E., Sanchez Alvarado,, A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SmedGD%3A+the+Schmidtea+mediterranea+genome+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">SmedGD: the Schmidtea mediterranea genome database.</a> Nucleic Acids Res. 36, D599-D606 (2008).</li>
<li>Beane, W. S., Tseng, A. S., Morokuma, J., Lemire, J. M., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+planar+cell+polarity+extends+neural+growth+during+regeneration%2C+homeostasis%2C+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Inhibition of planar cell polarity extends neural growth during regeneration, homeostasis, and development.</a> Stem Cells Dev. 21 (12), 2085-2094 (2012).</li>
<li>Forsthoefel, D. J., Waters, F. A., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cell+type-specific+monoclonal+antibodies+for+the+planarian+and+optimization+of+sample+processing+for+immunolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of cell type-specific monoclonal antibodies for the planarian and optimization of sample processing for immunolabeling.</a> BMC Dev Biol. 14, 45(2014).</li>
<li>Ross, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+monoclonal+antibodies+to+study+tissue+regeneration+in+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel monoclonal antibodies to study tissue regeneration in planarians.</a> BMC Dev Biol. 15, 2(2015).</li>
<li>Cardona, A., Fernandez, J., Solana, J., Romero, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+situ+hybridization+protocol+for+planarian+embryos%3A+monitoring+myosin+heavy+chain+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">An in situ hybridization protocol for planarian embryos: monitoring myosin heavy chain gene expression.</a> Dev Genes Evol. 215 (9), 482-488 (2005).</li>
<li>King, R. S., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+protocol+for+enhanced+detection+of+gene+expression+in+the+planarian+Schmidtea+mediterranea%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea.</a> BMC Dev Biol. 13, 8(2013).</li>
<li>Pearson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde-based+whole-mount+in+situ+hybridization+method+for+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians.</a> Dev Dyn. 238 (2), 443-450 (2009).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questa tecnica di ablazione dell&#39;occhio migliora la metodologia correnti (come fori) escludendo tessuti cerebrali e limitando escissione principalmente ai tessuti oculari. Con la pratica, questa tecnica può essere eseguita dalla maggior parte degli individui, da tecnici esperti in microchirurgia per studenti universitari inesperti ma di coscienza. Si raccomanda che questa tecnica essere praticato molte volte prima di utilizzare ablazioni in esperimenti, inclusi (quando possibile) conferma della rimozione completa di...

Planarie sono un potente organismo modello per studiare la rigenerazione cellulare mediata staminali adulte. Questi platelminti acqua dolce non parassitarie possiedono la capacità di rigenerare qualsiasi e tutti i tessuti mancanti, tra loro sistema nervoso centrale e del cervello 1. Studiata fin 1700 2, progressi tecnologici nel campo planarian corso degli ultimi 10-15 anni (quali un genoma sequenziato, ibridazione in situ, immunoistochimica, interferenza RNA (RNAi), e trascrittomica) hanno aggiornato questo organismo modello storico . In particolare, planarie hanno recentemente guadagnato la popolarità come un modello emergente per la ricerca degli occhi 3. Planarians hanno occhi prototipici con solo due tipi di tessuto, i neuroni fotorecettori e cellule pigmentate; ciò ha permesso la caratterizzazione della sua popolazione dell&#39;occhio cellule staminali e dimostrato che molti degli stessi geni che regolano vertebrato occhio deluppo sono conservati in planarians 4, 5. Le coppe ottiche si trovano dorsalmente e comprende il bianco, dendriti dei neuroni non pigmentate fotorecettori e le cellule del pigmento nero semi-lunari, e gli occhi innervano il cervello attraverso un chiasma ottico. Oltre ad essere un modello per chiarire processi rigenerativi 6, l&#39;occhio planarian è adatto per studiare l&#39;evoluzione dei meccanismi visivi 7, risposte comportamentali alla luce (planarians visualizzare fototassi negativo) 8, e la base neurologiche del comportamento 9. Rigenerazione oculare planarians è stato ampiamente studiato in due contesti principali: come parte della rigenerazione testa dopo decapitazione 4, 10, e dopo l&#39;asportazione di soli tessuti oculari 11, 12 </sup&gt;. La maggior parte degli studi sulla rigenerazione planaria occhi hanno usato il metodo di decapitazione, in quanto è semplice e lineare. Il metodo escissione occhio planarian più comune è stato finora tramite perforazione con un tubo capillare vetro sottile 13, 14, anche se alcuni studi hanno anche eseguito amputazioni appena dietro gli occhi (decapitazione parziale) 15. Tuttavia, tutti questi metodi comportano la perdita di molti tessuti diversi solo l&#39;occhio (come il cervello, intestino, e nefridi), potenzialmente complicando l&#39;interpretazione dei risultati. Il protocollo ablazione occhio qui presentata limita escissione ai tessuti dell&#39;occhio (escludendo in particolare del cervello), con conseguente dati che sono più specifici per l&#39;occhio. Inoltre, a differenza di vermi decapitati che prendono 7-14 giorni per iniziare l&#39;alimentazione, occhio ablato vermi alimentare entro 24 h di ablazione 12, consentendo esperimenti RNAi (dove RNAi viene fornita mediante il cibo) da esibiràd contemporaneamente. Anche se l&#39;ablazione occhio è tecnicamente più difficile da eseguire con successo di decapitazione, gli studi in corso sulla escissione occhio non hanno incluso le istruzioni dettagliate sulle loro procedure. L&#39;obiettivo di questo articolo il video è quello di consentire ai ricercatori di rimuovere costantemente la coppa ottica planaria senza disturbare i tessuti cerebrali sottostanti e la rimozione come pochi altri tessuti come possibile. Questo metodo può essere utilizzato sia per singolo e doppio ablazione dell&#39;occhio ed è applicabile ad una vasta gamma di indagini. Come la maggior parte dosaggi di rigenerazione, l&#39;ablazione occhio è adatto per la combinazione con entrambi (RNAi) schermi farmacologiche e genetiche, così come studi comportamentali. Qui si descrivono i metodi per la gestione di vermi, il mantenimento di una colonia planaria, e la tecnica di ablazione occhio stesso.

<table><tbody><tr><td>Istantaneo Oceano sali marini</td><td>Spettro Marche&nbsp;</td><td>Scatola SS15-10</td> <td>"10 galloni"&nbsp; (peso netto 3 libbre)</td></tr><tr><td>Kimwipes EX-L salvietta fazzoletto senza lanugine</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td>4,5 x 8,5 pollici&nbsp;</td></tr><tr><td>Whatman #2 carta da filtro</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>WHA1002125</td><td>Circles, diametro 125 mm, siringa da</td></tr><tr><td>insulina Easy Touch bianca (con ago)</td><td>Pet Health Market</td><td>17175-04</td><td>&nbsp; U-100 Siringa da 1 cc, 31 G 5/16 in ago</td></tr><tr><td>100 mm Piastra di Petri</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td>100 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Piastra di Petri da 60 mm</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td>60 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Dumont #5&nbsp; pinze&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>Inox, punta dritta, 11 cm</td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento&nbsp;</td><td>Samco Scientific&nbsp;</td><td>225</td><td>Graduato, bulbo grande, 7,5 mL, non sterile</td></tr><tr><td>Film di paraffina Parafilm M</td><td></td><td>701606</td><td>&nbsp; Rotolo da 4 pollici x 125 piedi</td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale non trattata a 12 pozzetti</td><td>VWR</td><td>15705-059</td> Contenitori per alimenti <td>in plastica non trattati, a fondo piatto, sterili, di marca Falcon</td></tr><tr><td>(per colonia)&nbsp;</td><td>Ziploc</td><td>Rettangolo grande</td><td>2,25 qt (2,12 L), 10" x 6 -3/4" x 3 -3/16"&nbsp;</td></tr><tr><td>Planaria (Girardia tigrina)</td><td>Carolina Biologica</td><td>132954</td><td>Venduta come Planaria "marrone"; il più delle volte sono G. tigrina (aka Dugesia tigrina), ma a volte sono G. dorotocephala (aka Dugesia dorotocephala); entrambi funzioneranno.</td></tr><tr><td>Planaria (Schmidtea mediterranea)</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>S. mediterranea non sono disponibili in commercio. In questo momento gli animali sono ottenibili solo dai laboratori che li utilizzano e hanno animali extra.</td></tr><tr><td>Tovaglioli di carta marroni&nbsp;</td><td>Grainger</td><td>2U229</td><td>9-3/16 x 9-3/8" 1 velo di carta multipiegata, flacone di lavaggio NON SBIANCATO</td></tr><tr><td>(per acqua di vermi),</td> flaconi di lavaggio <td>VWR</td><td>16650-275</td> opzionali<td>, polietilene a bassa densità, bocca larga, 500 mL</td></tr><tr><td>di anticorpo antisinapsi, anticorpo anti-sinapsina opzionale</td><td>Hybridal Studies Hybridoma Bank</td><td>3C11</td><td>Supernatant</td></tr><tr><td>, opzionale</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Non disponibile in commercio. Gentile regalo da Michael Levin, Tufts University</td></tr><tr><td>Nalgene Lowboy damigiana con rubinetto (per conservare l'acqua dei vermi), opzionale</td><td>Nalge Nunc International Corporation</td><td>2324-0015</td><td>15 L,&nbsp; polipropilene, basso profilo facilita il riempimento di contenitori di colonie di plastica&nbsp;</td></tr><tr><td>Piastra Peltier personalizzata, macchina</td><td>Williams opzionale, Foxboro, MA&nbsp;</td><td>n/a</td><td>Specifiche del design per gentile concessione di Junji Morokuma, Tufts University:&nbsp; La piastra di Peltier è costruita con una pompa di calore termoelettrica standard (ad esempio, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2).&nbsp; La pompa di calore quadrata è ricoperta da una sottile superficie specchiata, quindi collocata all'interno di un foro quadrato da 30 mm2 in plexiglass circolare (~50 mm di diametro). Questa forma ha uno spessore simile a quello della pompa di calore e si inserisce a filo in un pozzetto ricavato al centro di un dissipatore di calore rotondo (~115 mm di diametro). La forma/pompa di calore è&nbsp; "ancorato" al lavello con base in silicone composto per dissipatore. I cavi sono filettati attraverso fori praticati sia nella forma che nel dissipatore di calore. La metà inferiore del dissipatore di calore è inserita in un "piede" che si inserisce nell'apertura della piastra di base del microscopio.</td></tr><tr><td>Fonte di alimentazione CC (per piastra Peltier), B</td><td>& Alimentatore CC a bassa tensione regolato K Precision</td><td>1665</td><td>, 1-18 V (CC), 1-10 A.</td></tr><tr><td>Altri materiali di consumo</td><td></td><td></td><td></td>comuni</tr><tr><td>Guanti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lama di rasoio&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forbici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cannocchiale da dissezione con illuminazione</td><td></td><td></td><td></td>a collo d'oca</tr><tr><td>Poggia bacchette, opzionale</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ablazione chirurgica assay per lo studio degli occhi rigenerazione in planarie

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

Nello studio di cellule staminali adulte e meccanismi rigenerativi, platelminti planarian sono una graffetta nel sistema modello in vivo. Ciò è dovuto in gran parte alla loro abbondante popolazione di cellule staminali pluripotenti e la capacità di rigenerare tutti i tipi di cellule e tessuti dopo lesioni che sarebbe catastrofico per la maggior parte degli animali. Recentemente, planarie hanno guadagnato popolarità come modello per la rigenerazione degli occhi. La loro capacità di rigenerare l&#39;intero occhio (composto da due tipi di tessuto: cellule pigmento e fotorecettori) consente la dissezione dei meccanismi che regolano la rigenerazione del sistema visivo. ablazione occhio ha diversi vantaggi rispetto ad altre tecniche (come decapitazione o fori) per l&#39;esame percorsi e meccanismi specifici occhio, il più importante dei quali è che la rigenerazione è in gran parte limitato ai soli tessuti dell&#39;occhio. Lo scopo di questo articolo il video è quello di dimostrare come rimuovere in modo affidabile la coppa ottica planarian senza disturbare il cervello o tessuti circostanti.Movimentazione di vermi e manutenzione di una colonia stabilita viene anche descritto. Questa tecnica utilizza un 31 G, ago da insulina da 5/16 pollici per raccogliere chirurgicamente la coppa ottica di planarians immobilizzati su un piatto freddo. Questo metodo comprende sia singola e doppia ablazione dell&#39;occhio, con gli occhi rigeneranti entro 1-2 settimane, consentendo una vasta gamma di applicazioni. In particolare, questa tecnica di ablazione può essere facilmente combinato con (RNA interference) schermi farmacologici e genetici per una migliore comprensione dei meccanismi rigenerativi e loro evoluzione, cellule staminali occhio e la loro manutenzione e risposte comportamentali phototaxic e la loro base neurologica.

Per la prima post chirurgia 1-2 h, animali possono esibire movimento è diminuito rispetto ai vermi intatti (tuttavia essi sposteranno comunque). Se lo si desidera, vermi mangiare entro 24 ore di chirurgia (per esempio, per l&#39;alimentazione RNAi). Quando si segue la rigenerazione degli occhi negli stessi individui nel corso del tempo, assicuratevi di prendere una fotografia di ciascuna vite senza fine sia prima dell&#39;intervento chirurgico (intatto) e al 1 ore dopo l&#39;ablazione (H...

Questo protocollo mostra come ad accisa in modo coerente gli occhi planaria (tazze ottica) senza disturbare i tessuti circostanti. L&#39;utilizzo di un ago da insulina e la siringa, uno o entrambi gli occhi possono essere ablato per facilitare le indagini i meccanismi che regolano la rigenerazione degli occhi, l&#39;evoluzione della rigenerazione visiva, e le basi neurali del comportamento indotto dalla luce.

Ablazione chirurgica Assay per lo studio degli occhi Rigenerazione in Planarie

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare come rimuovere in modo affidabile la coppa ottica planariana senza alterare il cervello o i tessuti circostanti, in modo che la tecnica possa essere applicata da ricercatori e studenti a tutti i livelli formativi. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della rigenerazione, ad esempio determinando i meccanismi che regolano il mantenimento e la differenziazione in vivo delle cellule staminali endogene dell'occhio. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente ai ricercatori di rimuovere esclusivamente i tessuti oculari con un disturbo minimo degli altri tessuti.Generalmente, è necessaria una pratica preliminare prima che soggetti inesperti in questo metodo riescano a rimuovere in modo affidabile la quantità corretta di tessuto, ablare completamente l'occhio evitando al contempo l'ablazione dei tessuti circostanti. Per iniziare, selezionare vermi che non siano stati nutriti per almeno una settimana e che abbiano una lunghezza di almeno cinque-sette millimetri. Trasferire da 15 a 30 vermi in una capsula di Petri da 100 millimetri riempita per due terzi di acqua per vermi e sostituire immediatamente il coperchio.Osservare i vermi alla ricerca di tessuti mancanti o non pigmentati, come teste o code bianche, per assicurarsi che siano integri e non in fase di rigenerazione recente. Innanzitutto, pulire la superficie di lavoro e la base del microscopio stereoscopico con una soluzione di etanolo al 70%, quindi lasciarla asciugare completamente. Posizionare la piastra contenente i vermi selezionati sul lato sinistro del microscopio.Quindi, sul lato destro del microscopio, posizionare una pinzetta n. 5, un ago per insulina da 31 gauge, 5/16 di pollice, con una siringa da un millilitro, una pipetta di trasferimento pulita e una piastra da 12 pozzetti etichettata per raccogliere i vermi ablasi. Posizionare una scatola di salviette monouso senza pelucchi, una bottiglia spray di plastica riempita con acqua fresca per vermi e ulteriori pipette di trasferimento in modo che siano facilmente accessibili durante l'intervento. Posizionare una piastra Peltier al centro della base del microscopio stereoscopico e regolare l'uscita della fonte di alimentazione in corrente continua in modo che la superficie della piastra Peltier sia sufficientemente fredda da immobilizzare i vermi.In alternativa, si può utilizzare una piastra di Petri riempita di ghiaccio al posto di una piastra Peltier. Per preparare la superficie chirurgica, tagliare innanzitutto un pezzo di pellicola di paraffina plastica di cinque centimetri per dieci centimetri e posizionarlo al centro della piastra Peltier. Successivamente, piegare un tovagliolo di carta senza pelucchi in un quadrato di circa due centimetri e appoggiarlo sulla pellicola.Quindi, tenere la salvietta piegata in posizione, inumidirla con acqua di vermi e appiattirla con una pipetta di trasferimento. Infine, tagliare un pezzo di carta filtrante bianca di 1,5-2 centimetri quadrati e appoggiarlo sulla salvietta. Per iniziare l'intervento chirurgico, posizionare un verme con il lato dorsale rivolto verso l'alto sulla carta filtrante, utilizzando la pipetta di trasferimento.Accendere la luce e focalizzare il fascio sul verme. Regolare la messa a fuoco e l'ingrandimento del microscopio stereoscopico in modo che gli occhi del verme siano chiaramente visibili. Ruotare il film di paraffina per regolare la posizione del verme in modo che la sua testa sia rivolta verso il ricercatore e inclinata di 30-40 gradi verso destra.Se il verme è posizionato con il lato ventrale rivolto verso l'alto e l'apertura faringea è visibile, utilizzare il lato smussato della pinzetta per modificare delicatamente la posizione del verme, portandolo con il lato dorsale in alto in modo che gli occhi siano visibili. Regolare nuovamente le impostazioni del microscopio affinché gli occhi siano perfettamente a fuoco. Assicurarsi inoltre che siano visibili sia gli occhi sia i tessuti circostanti della testa.Tenere una siringa pulita nella mano destra tra pollice e indice. Sostenere la parte inferiore della siringa con il pollice sinistro, appoggiato contro la piastra Peltier. Guardare attraverso il microscopio per assicurarsi che il bisellino dell'ago sia visibile.Posizionare il dito indice sinistro sulla superficie chirurgica in modo che formi un angolo di 40 gradi con il pollice sinistro, per garantire che la superficie rimanga stabile durante l'intervento. Posizionare l'ago perpendicolarmente all'occhio, con il becco dell'ago rivolto verso l'alto. Con la punta dell'ago, penetrare delicatamente lo strato sottile di tessuto sovrastante la coppa ottica dell'occhio, visibile come una regione bianca e non pigmentata.Rimuovendo con delicatezza da destra verso sinistra, eliminare con attenzione qualsiasi tessuto pigmentato nero situato all'interno della coppa ottica, insieme a tutti i tessuti bianchi. Se si esegue l'ablazione di entrambi gli occhi, ablare ora il secondo occhio. Al termine dell'intervento chirurgico, caricare il pipetto all'indietro con una piccola quantità di acqua per vermi e rilasciare l'acqua sul verme per sollevarlo dalla carta filtro.Aspirare immediatamente il verme nella pipetta di trasferimento. Spostare il verme in una piastra da 12 pozzetti etichettata, riempita per due terzi con acqua fresca per vermi. Una volta trasferiti tutti i vermi, lavarli sostituendo l'acqua nei pozzetti con acqua fresca per vermi.Incubare i vermi al riparo dalla luce in un incubatore a 20 gradi Celsius e monitorare il processo di rigenerazione. Per sacrificare i vermi vivi, rimuovere l'acqua dai vermi dalla piastra e sostituirla con etanolo al 70%. Incubare i vermi per tre-cinque minuti e osservare se i vermi lisanano e diventano grigi.Qui vengono presentate fotografie di vermi piatti sottoposti ad ablazione doppia dell'occhio e ablazione singola dell'occhio, scattate prima, quattro giorni dopo e due settimane dopo l'intervento chirurgico. Le immagini mostrano il progresso della rigenerazione nel tempo. La rigenerazione oculare nei vermi ablati è stata inoltre confermata mediante colorazione immunohistochimica dell'arrestina e dei neuroni fotoricettori di nuova formazione.Il recupero del sistema visivo nei vermi piatti dopo l'ablazione doppia degli occhi &egrave; stato studiato anche in un saggio funzionale basato sulla risposta fotofobica di tipo selvatico alla luce. 24 ore dopo l'ablazione, i vermi privi di occhi non evitano la luce e attraversano le aree illuminate. La fotofobia viene ripristinata entro sette giorni dall'intervento, indicando che il sistema visivo rigenerato &egrave; funzionale.Una volta acquisita padronanza, l'ablazione doppia degli occhi di un singolo verme può essere eseguita in circa tre minuti. Durante l'ablazione, è importante asportare completamente i tessuti pigmentati e non pigmentati dell'occhio, assicurandosi al contempo di non danneggiare il tessuto compreso tra i due occhi o di lacerare il tessuto in seguito nell'occhio. Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come immunohistochimica e interferenza dell'RNA allo scopo di esaminare il ruolo di geni specifici e del loro processo rigenerativo.Inoltre, è possibile eseguire saggi comportamentali per verificare la funzione degli occhi dopo la rigenerazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come escindere gli occhi dei planari senza alterare i tessuti circostanti. Ricorda che lavorare con aghi può essere pericoloso e che è necessario adottare precauzioni, come indossare guanti e tenere l'ago rivolto lontano dal corpo.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Danno renale acuto (AKI) negli esseri umani è un problema comune clinico causato da un danno alle cellule epiteliali che costituiscono nefroni renali e AKI è associata ad elevati tassi di mortalità del 50-70% 1. A seguito di distruzione delle cellule epiteliali, nefroni hanno una limitata capacità di rigenerarsi, anche se i meccanismi e le limitazioni che guidano questo fenomeno sono ancora poco compresi. In questo articolo video, descriviamo la nostra tecnica di ablazione laser mirato delle...

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Un modello interessante per studiare la differenziazione delle cellule staminali in un animale vivo è il verme piatto planaria. La rigenerazione è studiato da amputazione esperimenti semplici che sono facili da eseguire in un laboratorio di base e sono suscettibili di (farmacologica e...

I dosaggi farmacologici genetica e funzionale di manipolare Rigenerazione del Planaria Japonica Dugesia</em

Un metodo efficace per l'innesto di tessuto di dimensione definita e coerente tra planaria è descritto. È inclusa anche una descrizione di come la tecnica di immobilizzazione utilizzata per il trapianto può essere adattato, in combinazione con scudi piombo, per l'irradiazione parziale di animali vivi.

Planaria immobilizzazione, irradiazione parziale, e di tessuti

Fonte: Volpe, B. A.A., et al. }} Saggio di ablazione e rigenerazione laser basato su microscopio confocale in cellule interneuromast di zebrafish. J. Vis. Exp.{{TAG_ 31}} (2020) Questo video mostra il monitoraggio del recupero interneuromastocitario nel pesce zebra utilizzando la microscopia confocale, monitorando la morte e la riparazione cellulare attraverso l'imaging a fluorescenza time-lapse.

Monitoraggio del recupero delle cellule interneuromast ablate con laser in zebrafish mediante microscopia confocale

Poiché molti modelli di zebrafish di malattie neurologiche e non neurologiche sono studiate nei pesci adulti piuttosto che l'embrione / larve, abbiamo sviluppato una linea laterale rigenerativo dosaggio quantitativo che può essere applicato a modelli di malattia di zebrafish adulto. Il saggio coinvolto risoluzione al neuromast 1) e 2) livelli di cellule singolo capello.

Un test per Lateral Rigenerazione Line in Zebrafish adulti

Zebrafish è un popolare modello animale per lo studio dei meccanismi di degenerazione/rigenerazione della retina nei vertebrati. Questo protocollo descrive un metodo per indurre lesioni localizzate interrompendo la retina esterna con danno minimo per la retina interna. Successivamente, monitoriamo in vivo la morfologia retinica e la risposta di glia di Müller durante rigenerazione retinica.

Attivazione delle cellule di Glia di Müller in una degenerazione retinica indotta da Laser e un modello di rigenerazione in Zebrafish

La planaria planarie mediterranea è un eccellente modello per studiare le cellule staminali e rigenerazione dei tessuti. Questa pubblicazione descrive un metodo per rimuovere selettivamente un solo organo, la faringe, esponendo gli animali per la chimica sodio azide. Questo protocollo delinea anche metodi per il monitoraggio di rigenerazione della faringe.

Chimica l'amputazione e la rigenerazione della faringe nella Planaria planarie mediterranea

L'ablazione laser è una tecnologia ampiamente applicabile per lo studio della rigenerazione nei sistemi biologici. Il protocollo presentato descrive l'uso di un microscopio confocale a scansione laser standard per l'ablazione laser e la successiva imaging time-lapse di cellule interneuromast rigeneranti nella linea laterale zebrafish.

Saggio di ablazione e rigenerazione laser a base di microscopio confocale nelle cellule interneuromast zebrafish

L'articolo spiega come rimuovere chirurgicamente gli occhi dalle larve viventi di zebrafish come primo passo verso lo studio di come l'input retinico influenza la crescita e lo sviluppo del tectum ottico. Inoltre, l'articolo fornisce informazioni sull'anestesia larvale, la fissazione e la dissezione cerebrale, seguite da immunoistochimica e imaging confocale.

Rimozione dell'occhio nelle larve di zebrafish viventi per esaminare la crescita dipendente dall'innervazione e lo sviluppo del sistema visivo

Questo protocollo descrive la metodologia per ablare geneticamente l'epitelio pigmentato retinico (RPE) utilizzando un modello transgenico di zebrafish. L'adattamento del protocollo per incorporare la modulazione della via di segnalazione utilizzando composti farmacologici è ampiamente dettagliato. È stata sviluppata una piattaforma MATLAB per quantificare la rigenerazione RPE basata sulla pigmentazione, che viene presentata e discussa.

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Qui proponiamo tre diversi metodi per danneggiare le fibre sensoriali che innervano la cornea. Questi metodi facilitano lo studio della rigenerazione degli assoni nei topi. Questi tre metodi, adattabili ad altri modelli animali, sono ideali per lo studio della fisiologia e della rigenerazione dell'innervazione corneale.

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Ablazione chirurgica Assay per lo studio degli occhi Rigenerazione in Planarie

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