Ablazione chirurgica Assay per lo studio degli occhi Rigenerazione in Planarie

Questo protocollo mostra come ad accisa in modo coerente gli occhi planaria (tazze ottica) senza disturbare i tessuti circostanti. L'utilizzo di un ago da insulina e la siringa, uno o entrambi gli occhi possono essere ablato per facilitare le indagini i meccanismi che regolano la rigenerazione degli occhi, l'evoluzione della rigenerazione visiva, e le basi neurali del comportamento indotto dalla luce.

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare come rimuovere in modo affidabile la coppa ottica planaria senza disturbare il cervello o i tessuti circostanti in modo che la tecnica possa essere implementata da ricercatori e studenti a tutti i livelli di istruzione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo rigenerativo, come determinare i meccanismi che regolano il mantenimento e la differenziazione delle cellule staminali oculari endogene in vivo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che permette ai ricercatori di rimuovere solo i tessuti oculari con il minimo disturbo degli altri tessuti.

In generale, è necessaria la pratica prima che le persone nuove a questo metodo possano rimuovere in modo affidabile la giusta quantità di tessuto, ablando l'intero occhio evitando l'ablazione dei tessuti circostanti. Per iniziare, seleziona i vermi che non sono stati nutriti per almeno una settimana e sono lunghi almeno da cinque a sette millimetri. Trasferire da 15 a 30 vermi in una capsula di Petri da 100 millimetri piena per due terzi di acqua di vermi e riposizionare immediatamente il coperchio.

Osserva i vermi per verificare la presenza di tessuti mancanti o non pigmentati, come teste o code bianche, per assicurarti che non siano danneggiati e non si siano rigenerati di recente. Innanzitutto, pulire l'area di lavoro e la base del microscopio da dissezione con una soluzione di etanolo al 70% e lasciarla asciugare completamente. Posizionare il piatto con i vermi selezionati sul lato sinistro del microscopio.

Quindi, sul lato destro del microscopio, posizionare un paio di pinze numero cinque, un ago da insulina calibro 31 da 5/16 di pollice con una siringa da un millilitro, una pipetta di trasferimento pulita e una piastra a 12 pozzetti etichettata per la raccolta dei vermi ablati. Metti una scatola di salviette in tessuto prive di lanugine, un flacone di plastica riempito con acqua di vermi fresca e pipette di trasferimento aggiuntive in modo che siano facilmente accessibili durante l'intervento chirurgico. Posizionare una piastra di Peltier al centro della base del microscopio da dissezione e impostare l'uscita sulla fonte di alimentazione CC in modo che la superficie della piastra di Peltier sia sufficientemente fredda da immobilizzare i vermi.

In alternativa, è possibile utilizzare una capsula di Petri riempita di ghiaccio al posto di una piastra di Peltier. Per preparare la superficie chirurgica, tagliare prima un pezzo di pellicola di paraffina di plastica di cinque centimetri per dieci centimetri e posizionarlo al centro della piastra di Peltier. Quindi, piega una salvietta di fazzoletto priva di lanugine in un quadrato di circa due centimetri e posizionala sopra la pellicola.

Quindi, tieni in posizione la salvietta piegata, inumidila con acqua di vermi e arrotola la salvietta con una pipetta di trasferimento. Infine, taglia un pezzo di carta da filtro bianca da 1,5 a due centimetri quadrati e adagialo sopra la salvietta. Per iniziare l'intervento chirurgico, posizionare un verme con il lato dorsale rivolto verso l'alto sulla carta da filtro, utilizzando la pipetta di trasferimento.

Accendi la luce e concentra il suo raggio sul verme. Regolare la messa a fuoco e l'ingrandimento del microscopio da dissezione in modo che gli occhi del verme siano chiaramente visibili. Ruotare la pellicola di paraffina per regolare la posizione del verme in modo che la sua testa sia puntata verso il ricercatore e inclinata di 30-40 gradi a destra.

Se il verme è posizionato con il lato ventrale rivolto verso l'alto e l'apertura faringea è visibile, utilizzare il lato opaco della pinza per cambiare delicatamente la posizione del verme verso il lato dorsale rivolto verso l'alto con gli occhi visibili. Regolare nuovamente le impostazioni del microscopio in modo che gli occhi siano chiaramente a fuoco. Assicurati inoltre che sia gli occhi che i tessuti della testa circostanti siano in vista.

Tenere una siringa pulita nella mano destra tra il pollice e l'indice. Sostenere la parte inferiore della siringa sul pollice sinistro, appoggiandola alla placca di Peltier. Guarda attraverso il microscopio per assicurarti che lo smusso dell'ago sia visibile.

Posizionare l'indice sinistro sulla superficie dell'intervento chirurgico in modo che formi un angolo di 40 gradi con il pollice sinistro per garantire che la superficie rimanga stabile durante la procedura. Posizionare l'ago con un angolo di 90 gradi rispetto alla cruna con lo smusso dell'ago rivolto verso l'alto. Con la punta dell'ago, penetrare delicatamente il sottile strato di tessuto sovrastante la coppa ottica dell'occhio visibile come regione bianca e non pigmentata.

Raccogliendo da destra a sinistra, rimuovere molto delicatamente qualsiasi tessuto pigmentato nero situato all'interno della coppa ottica e tutti i tessuti bianchi. Se si esegue l'ablazione del doppio occhio, ablare il secondo occhio ora. Dopo aver completato l'intervento chirurgico, caricare nuovamente la pipetta con una piccola quantità di acqua di verme e rilasciare l'acqua sul verme per sollevarlo dalla carta da filtro.

Aspirare immediatamente il verme nella pipetta di trasferimento. Sposta il verme in una piastra a 12 pozzetti etichettata piena per due terzi di acqua fresca di vermi. Una volta che tutti i vermi sono stati trasferiti, lavarli sostituendo l'acqua dei pozzi con acqua fresca di vermi.

Incubare i vermi al riparo dalla luce in un'incubatrice a 20 gradi Celsius e monitorare il processo di rigenerazione. Per sacrificare i vermi vivi, rimuovere l'acqua di verme dalla piastra e sostituirla con etanolo al 70%. Incubare i vermi per tre-cinque minuti e osservare se i vermi si lisano e diventano grigi.

Qui sono presentate fotografie di vermi piatti sottoposti ad ablazione a doppio occhio e ablazione a occhio singolo, scattate prima, quattro giorni dopo e due settimane dopo la procedura chirurgica. Le immagini mostrano l'avanzamento della rigenerazione nel tempo. La rigenerazione oculare nei vermi ablati è stata confermata anche dalla colorazione immunoistochimica dell'arrestina e dei neuroni fotorecettori di nuova concezione.

Il recupero del sistema visivo nei platelminti dopo l'ablazione del doppio occhio è stato studiato anche in un test funzionale basato sulla risposta fotofobica wildtype alla luce. 24 ore dopo l'ablazione, i vermi senza occhi non evitano la luce e viaggiano attraverso i punti luminosi. La fotofobia viene ripristinata entro sette giorni dalla procedura, indicando che il sistema visivo rigenerato è funzionale.

Una volta padroneggiata, la procedura di ablazione del doppio occhio di un verme può essere eseguita in circa tre minuti. Durante l'ablazione, è importante asportare tutti i tessuti pigmentati e non pigmentati dell'occhio, assicurandosi di non danneggiare il tessuto tra gli occhi o di strappare il tessuto in un secondo momento nell'occhio. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come l'immunoistochimica e l'interferenza dell'RNA per esaminare il ruolo di geni specifici e il loro processo rigenerativo.

Inoltre, è possibile eseguire saggi comportamentali per testare la funzione oculare dopo la ricrescita. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come asportare gli occhi planari senza disturbare i tessuti circostanti. Non dimenticare che lavorare con gli aghi può essere pericoloso e che è necessario prendere precauzioni come indossare guanti e tenere l'ago rivolto lontano da te.