Utilizzando la trasmissione ottica straordinaria per quantificare i biomarcatori cardiaci nel siero umano
13 dicembre 2017
Questo lavoro descrive un metodo di Litografia nanoimprinting per fabbricare matrici di sensori di alta qualità che funzionano sul principio della trasmissione ottica straordinaria. Il biosensore è basso costo, robusto, facile da usare e in grado di rilevare la troponina cardiaca I nel siero a concentrazioni clinicamente rilevanti (99th percentile taglio ∼10-400 pg/mL, a seconda del dosaggio).
L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di misurare i biomarcatori presenti in un complesso background di fluidi biologici a concentrazioni clinicamente rilevanti in un ambiente di cura senza la necessità di elaborate configurazioni ottiche o elettriche. Questo metodo può aiutare a rendere i biosensori basati sulla trasmissione straordinaria una realtà in scenari point of care. Il vantaggio principale di questa tecnica è che non necessita di complicate configurazioni elettriche o ottiche.
Nei nostri esperimenti potrebbe rilevare in modo affidabile biomarcatori a concentrazioni clinicamente rilevanti. La fabbricazione del chip del sensore viene eseguita nella camera bianca e non può essere filmata. A scopo dimostrativo la procedura è qui rappresentata da un'animazione.
Per la preparazione dello stampo in nichel, rivestire uno strato di 220 nanometri di spessore di resistenza a fascio di elettroni negativi su un wafer di silicio da quattro pollici di spessore 600 micron. Scrivi l'array di nanofori progettato su questo wafer, utilizzando un sistema di litografia a fascio di elettroni. Per accelerare la scrittura del fascio di elettroni, scrivere i modelli con una mappa di punti bassi di 20.000 per ogni dimensione di campo di 300 micron.
Sviluppa il resist immergendo il wafer di silicio da quattro pollici nella soluzione di sviluppo per 10 secondi e lasciando asciugare il wafer all'aria. Deposita uno strato di semi di un metallo, come nichel, rame o alluminio sul wafer di silicio. Quindi galvanizzare il wafer in un sistema di placcatura all'interno di un bagno di nichel-solfammato in due fasi.
Separare lo stampo in nichel dal substrato di silicone applicando una forza meccanica delicata. Successivamente, utilizzando un nanoimprinter, imprimere i nano modelli su un wafer di vetro da quattro pollici che è stato rivestito con un successivo resistente alla litografia nanoimprinting fotopolimerizzabile di 300 nanometri. Trasferire lo stampo, il fotoresist e il wafer di vetro in un sistema di fotopolimerizzazione UV e fotopolimerizzare.
Se tutti i passaggi sono stati seguiti correttamente, lo stampo in nichel deve essere facilmente sformato dal fotoresist. Dopo aver eseguito un'incisione in bianco del fotoresist sul sottofondo di vetro, sul wafer di vetro, in una macchina per la deposizione di fasci di elettroni depositare uno strato di cromo per l'adesione del metallo e uno strato di oro per il sensore plasmonico. Eseguire il sollevamento del fotoresist mediante incisione al plasma di ossigeno per tre minuti, seguito da una fase di sonoficazione di 15 secondi in acetone.
Quindi, taglia il campione in fiches da cinque millimetri per cinque millimetri. L'array di nanofori occuperà il quadrato centrale, di due millimetri per due millimetri, del chip. Per acquisire i dati, impostare l'apparato per effettuare le misurazioni ottiche, in modo tale che un raggio di luce bianca che esce dall'estremità della fibra ottica del trasmettitore sia colonnato e sia incidente sulla superficie del sensore a 90 gradi.
La luce viene trasmessa attraverso l'intera matrice di nanofori. Raccogli il segnale trasmesso con la fibra ottica del ricevitore e registralo con uno spettrometro UV-visibile che opera nell'intervallo da 300 a 1.000 nanometri. Per il test di sensibilità alla massa del sensore, depositare il liquido standard con indice di rifrazione nella cella liquida con indici di rifrazione variabili da 1,31 a 1,39.
Immergere il chip del sensore nel liquido standard dell'indice di rifrazione e allinearlo con il raggio di luce bianca. Quindi ottenere lo spettro di trasmissione. Pulire il chip del sensore dopo ogni misurazione con un reagente per la pulizia tensioattivo e asciugarlo con azoto gassoso.
Per la modifica della superficie del sensore, pulire i chip del sensore mediante immersione sequenziale in isopropanolo, acetone e acqua deionizzata prima di qualsiasi modifica chimica. Quindi, asciugare i chip del sensore a temperatura ambiente in un vapore di azoto gassoso secco. Quindi, incubare i chip del sensore in una soluzione etanolica per 12 ore a temperatura ambiente.
Questo formerà un monostrato autoassemblante reattivo all'ammina. Dopo l'incubazione, utilizzare l'etanolo per sciacquare e asciugare accuratamente le patatine a temperatura ambiente. Successivamente, immergere i chip in una miscela di 75 millimolari di solfo n idrossisuccinimide e 15 millimolari EDC per 15 minuti.
Questo attiverà il gruppo carbossisilico del monostrato autoassemblante. Quindi posizionare 50 microlitri di una soluzione di anticorpi anti-triponente da 200 microgrammi per millilitro prodotta in un tampone acitato, Ph 4,5, sulla superficie del sensore. Dopo l'incubazione per 30 minuti, disattivare gli esteri non reattivi immergendo il chip del sensore in una soluzione molare di etanolammina HCL per 15 minuti.
Infine, sciacquare il chip con acqua deionizzata e asciugarlo in un getto di azoto gassoso secco a temperatura ambiente. Blocca qualsiasi legame aspecifico individuando 100 microlitri di soluzione di albumina di siero bovino all'1% sulla superficie del chip del sensore. Incubare per 15 minuti.
Sciacquare tre volte i chip del sensore in una soluzione salina tamponata con fosfato. Inserire il chip nella cella di misura per registrare lo spettro di trasmissione. Questo è lo spettro di riferimento.
Quindi posizionare 50 microlitri di troponina cardiaca uno standard sulla superficie del chip. Incubare il chip in un ambiente umido per 30 minuti. Dopo aver risciacquato tre volte i chip del sensore nella soluzione PBS, inserirli nella cella di misura per registrare lo spettro di trasmissione.
Questo è lo spettro dopo il legame. Successivamente, immergere i chip in 50 millimolare di glicina HCL per un minuto e quindi risciacquare tre volte in soluzione PBS per rigenerare la superficie del chip. Misurare lo spettro di trasmissione in PBS per verificare il successo della fase di rigenerazione.
Viene mostrata la variazione dello spettro di trasmissione del biosensore dopo l'interazione con 30 nanogrammi per millilitro di troponina cardiaca umana nel siero. Il grafico blu rappresenta prima dell'interazione, mentre il grafico rosso rappresenta dopo l'interazione. Il cerchio tratteggiato indica la banda tracciata.
Qui è mostrato lo spostamento della lunghezza d'onda per la banda due a concentrazioni di troponina di 2,5 nanogrammi per millilitro, 7,5 nanogrammi per millilitro, 30 nanogrammi per millilitro e 75 nanogrammi per millilitro. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. Questo grafico mostra lo spostamento delle lunghezze d'onda delle bande osservate dopo la rigenerazione per un chip biosensore a nanofora.
Lo spostamento della posizione della banda due nella sua posizione originale, indica che la fase di rigenerazione è andata a buon fine. Una volta padroneggiata, la misurazione può essere effettuata in un'ora se eseguita correttamente. Durante la misurazione dei bioanaliti con questo metodo, è importante utilizzare reagenti appena preparati.
Assicurati di estrarre i tuoi materiali di consumo. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come fabbricare biosensori che funzionano secondo il principio della straordinaria trasmissione ottica e possono monitorare i bioanaliti su uno sfondo complesso. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché è difficile generare array di nanofori ad alta fedeltà che consentono di interfacciare il chip con una fibra ottica senza bisogno di alcun microscopio e optando per resine riproducibili.
Questa tecnica consente di effettuare misurazioni seriali che sono cruciali in ambito medico. La fabbricazione del chip contribuisce notevolmente a garantire la riproducibilità delle misurazioni. Con la piattaforma di base che rimane la stessa, ulteriori miglioramenti a questa tecnica deriveranno dall'utilizzo della tecnica con una migliore risoluzione che migliorerà la sensibilità e dall'utilizzo di metodi di elaborazione del segnale per ottenere migliori rapporti segnale/rumore.
Le implicazioni di questa tecnica si estendono al monitoraggio di più bioanaliti su uno sfondo complesso di siero in un ambiente di cura in tempo reale.
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Panoramica
Questo lavoro descrive un metodo di litografia per nanoimpronta volto alla fabbricazione di array sensori di alta qualità che funzionano secondo il principio della trasmissione ottica straordinaria. Il biosensore è progettato per applicazioni point-of-care, consentendo la rilevazione della troponina I cardiaca nel siero a concentrazioni clinicamente rilevanti.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biotecnologie
- Ingegneria biomedica
Sfondo
- La necessità di una rilevazione affidabile di biomarcatori in fluidi biologici complessi.
- Le sfide associate alle tecnologie tradizionali di biosensori.
- Il principio della trasmissione ottica straordinaria nella biosensoristica.
- L'importanza della diagnostica point-of-care in ambito clinico.
Scopo dello studio
- Sviluppare un biosensore economico e robusto per la rilevazione della troponina cardiaca I.
- Semplificare il processo di rilevamento evitando configurazioni complesse.
- Dimostrare la fattibilità dei biosensori basati sulla trasmissione straordinaria in applicazioni cliniche.
Metodi Utilizzati
- Litografia a nanoimpronta per la fabbricazione di sensori.
- Test del biosensore su campioni di siero.
- Rappresentazione animata del processo di fabbricazione.
- Valutazione dei limiti di rilevamento e delle metriche di prestazione.
Risultati principali
- Il biosensore può rilevare la troponina I cardiaca a concentrazioni comprese tra 10 e 400 pg/mL.
- Funziona efficacemente in un contesto diagnostico presso il punto di cura.
- Affidabilità dimostrata nel rilevamento di biomarcatori in fluidi complessi.
- Elimina la necessità di complesse configurazioni ottiche o elettriche.
Conclusioni
- Questo metodo rappresenta un notevole progresso nella tecnologia dei biosensori.
- Ha il potenziale di migliorare la diagnostica point-of-care per le condizioni cardiache.
- I futuri sviluppi potrebbero concentrarsi sull'ampliamento della gamma di biomarcatori rilevabili.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questa piattaforma di biosensori risponde all'esigenza fondamentale di rilevamento affidabile ed economico di biomarcatori cardiaci in fluidi biologici complessi come il siero umano, sostenendo direttamente i flussi di lavoro diagnostici point-of-care. Permettendo misurazioni riproducibili e quantitative della troponina I cardiaca a concentrazioni clinicamente rilevanti, senza l'ausilio di complessi apparati ottici o elettrici, il metodo riduce gli ostacoli tecnici alla diagnosi precoce e alla stratificazione del rischio nelle malattie cardiovascolari. La fabbricazione tramite nanoimprint ad alta fedeltà garantisce una minima variabilità tra chip diversi, favorendo una produzione su larga scala e prestazioni costanti del saggio nelle fasi di scoperta e di traduzione clinica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Permette l'analisi della dinamica di rilascio della troponina cardiaca come biomarcatore meccanicistico di danno miocardico in modelli preclinici.
- Valore operativo: Fornisce un segnale ottico senza marcatura, compatibile con array di nano-fori ad alta fedeltà per un rilevamento del segnale costante in presenza di siero.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce output quantitativi di spostamento della lunghezza d'onda correlati alla concentrazione dell'analita, consentendo la caratterizzazione dose-risposta in matrici sieriche.
- Valore operativo: Supporta una strategia basata su un singolo chip e una singola misurazione con bassa varianza, migliorando la riproducibilità per la standardizzazione dei saggi e la selezione di reagenti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Permette il monitoraggio della cinetica dei biomarcatori cardiaci in siero umano rilevante per la patologia, migliorando la continuità traslazionale dalla scoperta alla validazione.
- Valore operativo: Elimina la necessità di microscopia grazie a grandi aree di rilevamento (1,5 mm x 1,5 mm), semplificando l'integrazione con sorgenti luminose standard di laboratorio e spettrometri.
Pipeline e integrazione dei flussi di lavoro
Il metodo si inserisce nel continuum dalla scoperta precoce all'identificazione del capostipite fornendo un'uscita quantitativa robusta per il rilevamento di biomarcatori in fluidi complessi, sostenendo decisioni di proseguimento/cessazione basate sull'interazione con il bersaglio e sulla modulazione del percorso.
- Biologia della Scoperta: Consente la verifica di ipotesi sui meccanismi di danno cardiaco mediante la rilevazione affidabile della troponina I a concentrazioni sieriche fisiologicamente rilevanti.
- Screening: Fornisce spostamenti riproducibili nello spettro di trasmissione che permettono il confronto tra livelli di biomarcatori in diverse condizioni sperimentali, senza richiedere strumentazione complessa.
- Analisi: Fornisce misurazioni dello spostamento in lunghezza d'onda (ad esempio, banda due) come output quantitativo per monitorare il legame del biomarcatore e l'efficacia della rigenerazione.
- Ricerca Translazionale: Utilizza il siero umano come matrice di rilevamento, garantendo pertinenza ai campioni clinici e riducendo il rischio di traduzione legato alla specificità della specie.
- Riutilizzo Aziendale: Il processo di fabbricazione basato sulla nanoimpronta è riutilizzabile su più generazioni di chip, favorendo la scalabilità della piattaforma per pannelli di biomarcatori multiplex.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nel rilevamento di biomarcatori grazie a un LOD clinicamente rilevante (0,55 ng/mL) e a una minima varianza tra chip.
- Valore operativo: Standardizzazione mediante litografia a nanoimpronta e compatibilità con comuni spettrometri UV-Vis e configurazioni a fibre ottiche.
- Valore strategico: Riduce il rischio biologico in fase avanzata consentendo un monitoraggio precoce e accurato dei biomarcatori in ambienti simulati di tipo point-of-care (POC).
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione basata sul rischio di candidati mirati al cuore, grazie a letture affidabili e compatibili con sieri.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze specifiche in litografia per nanoimpronta, chimica delle superfici e spettroscopia ottica per la fabbricazione e la funzionalizzazione del chip.
- È subordinato all'accesso a laboratori puliti per la generazione del modello master e a sistemi di polimerizzazione UV per la polimerizzazione del resist.
- Necessita di una preparazione standardizzata delle superfici (ad esempio, bloccaggio con BSA, risciacqui con EDTA) per ridurre al minimo il legame non specifico in matrici sieriche.
- L'adattamento ad altri biomarcatori richiede la validazione dell'efficienza di immobilizzazione degli anticorpi e della stabilità rigenerativa in fluidi complessi.
- Limite pratico: l'efficienza di rigenerazione deve essere verificata ad ogni ciclo per garantire la riproducibilità della superficie durante misurazioni in serie.
