Fluorescenza a tensione di serraggio in

L'obiettivo generale di questa procedura è introdurre un aminoacido non naturale fluorescente in una proteina di membrana espressa in oociti di Xenopus e determinare contemporaneamente la funzione della proteina e i suoi riarrangiamenti strutturali, utilizzando la fluorimetria in condizione di blocco del voltaggio. Questa tecnica contribuirà a rispondere a domande fondamentali nel campo delle relazioni tra struttura e funzione delle proteine di membrana. Mediante la fluorimetria in condizione di blocco del voltaggio, possiamo correlare direttamente i riarrangiamenti strutturali con la funzione proteica.

L'aggiunta di un'etichettatura con aminoacidi non naturali fluorescenti aiuta a superare i precedenti limiti dell'etichettatura, come la disponibilità dei siti di etichettatura e l'etichettatura di fondo dovuta a siti di legame endogeni. L'implicazione di questa tecnica si estende verso una migliore comprensione biofisica delle proteine di membrana, poiché ora è possibile esplorare domini che in precedenza non erano accessibili con la fluorometria tradizionale accoppiata al voltage-clamp.

Dopo l'asportazione chirurgica degli oociti di Xenopus, lavare gli oociti tre volte con soluzione SOS. Selezionare singolarmente oociti grandi e sani e incubarli a 18 gradi Celsius per almeno quattro ore in soluzione di Barth integrata con antibiotici e siero di cavallo al 5% prima dell'iniezione. Per l'iniezione nucleare di DNA, preparare una punta di iniezione lunga e sottile in modo da raggiungere il nucleo senza danneggiare gli oociti.

Quindi, riempire la punta di iniezione con olio ed applicare la punta sull'apparecchio nanoiniettore. Successivamente, installare il nanoiniettore sotto un microscopio stereoscopico e spezzare l'estremità della punta con una pinzetta. Dopodiché, espellere l'olio finché non rimangono bolle d'aria intrappolate all'estremità della punta.

In seguito, posizionare un microlitro di pAnap a 0,1 microgrammi per microlitro in acqua priva di nucleasi su un pezzo di Parafilm sotto lo stereomicroscopio e riempire la punta di iniezione con il DNA. Quindi, trasferire gli oociti in una piastra di iniezione contenente una griglia e riempita con soluzione di Barth's integrata con antibiotici. Poiché il nucleo dell'oocita si trova al polo animale, mirare la punta di iniezione al centro del polo animale e infilzarlo in modo che la punta raggiunga una posizione prossima al centro dell'emisfero animale.

Successivamente, iniettare 9,2 nanolitri della soluzione pAnap nel nucleo di ciascun oocita. Incubare poi gli oociti in due millilitri di soluzione di Barth integrata con antibiotici e siero equino al 5% a 18 gradi Celsius per un periodo compreso tra 6 e 24 ore, per consentire una forte espressione delle tRNA e delle aminoacil-tRNA sintetasi specifiche per Anap. A questo punto, preparare nuovamente il nanoiniettore, ma questa volta la punta di iniezione non deve essere sottile come quella utilizzata per l'iniezione di DNA.

Lavorare esclusivamente alla luce rossa da questo punto in poi per evitare il fotoblesamento dell'Anap. Mescolare un microlitro di Anap uno millimolare con un microlitro di mRNA da uno a due microgrammi per microlitro direttamente su un pezzo di Parafilm e riempire la punta di iniezione con la soluzione ottenuta. Infilare la punta al polo vegetale appena sotto la membrana e iniettare 46 nanolitri della soluzione in ciascun oocita iniettato con pAnap.

Quindi, proteggere gli oociti dalla luce collocandoli in una scatola opaca alla luce o avvolgendo il matraccio con carta d'alluminio. Incubarli in soluzione di Barth integrata con antibiotici e siero equino al 5% a 18 gradi Celsius per due o tre giorni. Sostituire la soluzione ogni giorno con soluzione di Barth fresca ed eliminare gli oociti morti per evitare contaminazioni.

In questa configurazione, l'apparato per la tecnica del cut-open voltage-clamp è integrato in un sistema di microscopia a fluorescenza. La camera di registrazione è montata su un cursore che ne permette lo spostamento tra lo stereomicroscopio standard, utilizzato per posizionare l'ovocita, e il microscopio destinato alle misurazioni di fluorescenza. Un sistema di rilevamento con fotodiodo è collegato al porto di uscita C-mount del microscopio a fluorescenza, e il segnale della corrente fotoelettrica è connesso a un secondo canale di ingresso del processore del segnale digitale.

Una lampada alogena da 100 watt e 12 volt viene utilizzata come sorgente luminosa per l'eccitazione della fluorescenza. L'eccitazione è controllata da uno scatto meccanico posizionato tra la sorgente luminosa di eccitazione e il microscopio. L'attivazione viene innescata tramite un impulso TTL proveniente dal processore del segnale digitale, che viene temporizzato nel software di registrazione in modo che lo scatto si apra circa 100 millisecondi prima dell'inizio della registrazione; è inoltre necessario un apposito cubo filtro nella torretta dei cubi filtro.

Per la VCF a due colori, incubare gli oociti preparati in solfuro di maleimide TMR cinque micromolari in soluzione di marcatura per 15 minuti immediatamente prima della registrazione. Successivamente, lavare gli oociti con la soluzione di marcatura per tre volte per rimuovere l'eccesso di colorante prima della registrazione. A questo punto, la proteina è specificamente marcata con due fluorofori diversi.

Dopo aver montato l'ovocita con il polo animale rivolto verso l'alto e averlo reso permeabile, spostare la camera sul microscopio e mettere a fuoco l'ovocita utilizzando un obiettivo 4X. Successivamente, infilzare l'ovocita con un elettrodo V1 sensibile alla tensione. Poi, passare all'obiettivo ad immersione in acqua 40X.

Puntare sull'asse animale, che è rivolto verso l'alto. Successivamente, spegnere la luce rossa. Selezionare il cubo filtro Anap ruotando la torretta dei cubi filtro e l'uscita ottica collegata al fotodiodo.

In seguito, accendere la lampada alogena all'intensità massima e aprire l'otturatore per due-cinque secondi per rilevare l'intensità della fluorescenza di fondo proveniente dall'ovocita. Successivamente, accendere il clamp, spostare l'interruttore bagno/protezione su attivo e regolare il potenziale della membrana al potenziale di comando ruotando la manopola sul testa. In seguito, selezionare nel software di registrazione il potenziale di mantenimento, il protocollo a gradino, il numero e la durata degli impulsi.

Quindi, registrare le correnti dipendenti dalla tensione e le intensità di fluorescenza di Anap. Per la VCF a due colori, selezionare il cubo filtro TMR ruotando la torretta del cubo. Leggere la fluorescenza di fondo per TMR, come descritto per Anap, e registrare contemporaneamente le correnti dipendenti dalla tensione e l'intensità di fluorescenza TMR.

Questa figura mostra i segnali di fluorescenza di Anap e TMR ottenuti mediante protocolli a gradini da un singolo ovocita che esprime un mutante di Shaker. Introducendo una cisteina accessibile dalla soluzione esterna nel contesto del background L382 stop W434F ed etichettandola con TMR maleimide, è possibile esplorare in tempo reale i movimenti di diverse regioni della stessa proteina simultaneamente. La relazione tra fluorescenza e potenziale è ottenuta riportando l'intensità di fluorescenza allo stato stazionario in funzione del potenziale.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come esprimere aminoacidi non naturali fluorescenti in oociti di Xenopus e di come eseguire la fluorimetria in blocco voltammetrico a uno o due colori. Una volta padroneggiata la tecnica, il tempo richiesto sarà all'incirca lo stesso degli esperimenti tradizionali di elettrofisiologia, con l'aggiunta del solo passaggio di iniezione del DNA nel nucleo dell'oocita. Quando si tenta questa procedura, è importante ricordarsi di verificare l'espressione di perdita in assenza dell'aminoacido non naturale.

Questo deve essere eseguito per ogni mutazione, poiché la quantità di espressione di fuga dipende dal sito di inserimento del codone di stop all'interno della proteina. Questa tecnica consente ora ai ricercatori di studiare i cambiamenti conformazionali nel sito citosolico della proteina, dove avvengono molti dei meccanismi di regolazione.