Fluorescenza a tensione di serraggio in Xenopus Oociti che utilizzano aminoacidi innaturali fluorescenti

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di introdurre un amminoacido fluorescente innaturale in una proteina di membrana espressa negli ovociti di Xenopus e di determinare simultaneamente la funzione della proteina e il riarrangiamento strutturale, utilizzando la fluorometria voltaggio-clamp. Questa tecnica aiuterà a rispondere a domande chiave nel campo delle relazioni struttura-funzione delle proteine di membrana. Utilizzando la fluorimetria voltaggio-clamp, possiamo correlare direttamente i riarrangiamenti strutturali con la funzione delle proteine.

L'aggiunta di un'etichettatura fluorescente di aminoacidi innaturali aiuta a superare le precedenti limitazioni sull'etichettatura. Questo era un tempo l'accessibilità dei siti di marcatura e l'etichettatura di fondo a causa dei siti di legame endogeni. L'implicazione di questa tecnica si estende verso una migliore comprensione biofisica delle proteine di membrana perché ora è possibile sondare domini che in precedenza erano inaccessibili con la tradizionale fluorometria voltaggio-clamp.

Dopo la rimozione chirurgica degli ovociti di Xenopus, lavare gli ovociti tre volte con la soluzione SOS. Seleziona individualmente ovociti grandi e sani e incubali a 18 gradi Celsius per almeno quattro ore nella soluzione di Barth integrata con antibiotici e siero di cavallo al 5% prima dell'iniezione. Per l'iniezione nucleare di DNA, preparare una punta di iniezione lunga e sottile per raggiungere il nucleo senza danneggiare gli ovociti.

Quindi, riempire la punta di iniezione con olio e montare la punta di iniezione sul dispositivo nanoiniettore. Quindi, installa il nanoiniettore sotto uno stereomicroscopio e rompi l'estremità della punta con una pinza. Successivamente, espellere l'olio fino a quando non ci sono bolle d'aria intrappolate all'interno dell'estremità della punta.

Successivamente, mettere un microlitro di 0,1 microgrammi per microlitro di pAnap in acqua priva di nucleasi su un pezzo di Parafilm sotto lo stereoscopio e riempire la punta di iniezione con DNA. Quindi, trasferire gli ovociti in una piastra per iniezione contenente la soluzione di Barth integrata con antibiotici. Poiché il nucleo dell'ovocita si trova nel polo animale, puntare la punta dell'iniezione al centro del polo animale e impalarlo in modo che la punta raggiunga il centro dell'emisfero animale.

Successivamente, iniettare 9,2 nanolitri della soluzione di pAnap nel nucleo di ciascun ovocita. Successivamente, incubare gli ovociti in due millilitri di soluzione di Barth integrata con antibiotici e siero di cavallo al 5% a 18 gradi Celsius per sei-24 ore per consentire una robusta espressione di tRNA specifici per Anap e tRNA sintetasi. Ora, prepara di nuovo il nanoiniettore, ma questa volta la punta di iniezione non deve essere sottile come quella per l'iniezione di DNA.

Lavorare solo con luce rossa da questo punto per evitare il fotosbiancamento dell'Anap. Miscelare un microlitro di Anap da un millimolare con un microlitro da uno a due microgrammi per microlitro di mRNA direttamente su un pezzo di Parafilm e riempire la punta di iniezione con la soluzione di miscelazione. Impalando la punta nel polo vegetale appena sotto la membrana e iniettare 46 nanolitri della soluzione di miscela in ciascun ovocita iniettato con pAnap.

Quindi, proteggere gli ovociti dalla luce mettendoli in una scatola a tenuta di luce o avvolgendo il pallone in un foglio di alluminio. Incubarli nella soluzione di Barth integrata con antibiotici e siero di cavallo al 5% a 18 gradi Celsius per due o tre giorni. Sostituiscilo con una soluzione fresca di Barth ogni giorno e rimuovi gli ovociti morti per evitare contaminazioni.

In questa configurazione, l'apparecchiatura di bloccaggio della tensione è integrata in una configurazione di microscopia a fluorescenza. La camera di registrazione è installata su un cursore che le consente di spostarsi tra lo stereoscopio standard per il posizionamento dell'ovocita e il microscopio per eseguire misurazioni della fluorescenza. Un sistema di rilevamento del fotodiodo è collegato alla porta di uscita C-mount del microscopio a fluorescenza e la lettura della fotocorrente è collegata a un secondo canale di ingresso nel processore di segnale digitale.

Una lampada alogena da 100 watt e 12 volt viene utilizzata come sorgente luminosa per l'eccitazione della fluorescenza. L'eccitazione è controllata da un otturatore meccanico tra la sorgente luminosa di eccitazione e il microscopio. L'attivazione viene attivata tramite un impulso TTL proveniente dal processore di segnale digitale che viene temporizzato nel software di registrazione in modo tale che l'otturatore si apra circa 100 millisecondi prima dell'inizio della registrazione e sia necessario un cubo filtro appropriato nella torretta del cubo filtro.

Per la VCF a due colori, incubare gli ovociti preparati in maleimmide TMR a cinque micromolari in una soluzione di marcatura per 15 minuti immediatamente prima della registrazione. Quindi, lavare gli ovociti con la soluzione di marcatura tre volte per rimuovere il colorante in eccesso prima della registrazione. A questo punto, la proteina viene specificamente marcata con due diversi fluorofori.

Dopo il montaggio dell'ovocita, con l'asta dell'animale rivolta verso l'alto e permeabilizzata, far scorrere la camera al microscopio e mettere a fuoco l'ovocita utilizzando un obiettivo 4X. Successivamente, impalando l'ovocita con un elettrodo V1 sensibile alla tensione. Quindi, passa all'obiettivo a immersione in acqua 40X.

Concentrati sul palo dell'animale, che è rivolto verso l'alto. Successivamente, spegni la luce rossa. Selezionare il cubo filtrante Anap ruotando la torretta del cubo filtrante e la porta di uscita ottica collegata al fotodiodo.

Successivamente, accendi la lampada alogena alla massima intensità e apri l'otturatore da due a cinque secondi per leggere l'intensità della fluorescenza di fondo originata dall'ovocita. Successivamente, accendere il morsetto, attivare l'interruttore della vasca/protezione e regolare il potenziale della membrana sul potenziale di comando ruotando la manopola sull'headstage. Successivamente, selezionare il potenziale di mantenimento, il protocollo di passo, il numero e la lunghezza degli impulsi nel software di registrazione.

Quindi, registrare le correnti voltaggio-dipendenti e le intensità di fluorescenza Anap. Per VCF a due colori, selezionare il cubo filtro TMR ruotando la torretta del cubo. Leggere la fluorescenza di fondo per TMR, come descritto per Anap, e registrare contemporaneamente le correnti dipendenti dalla tensione e l'intensità della fluorescenza TMR.

Questa figura mostra i segnali di fluorescenza Anap e TMR utilizzando protocolli a gradini ottenuti dallo stesso ovocita che esprime un mutante Shaker. Aggiungendo una cisteina, accessibile dalla soluzione esterna, nello sfondo W434F dello stop L382 e marcandola con maleimmide TMR, è possibile sondare i movimenti in tempo reale in diverse regioni della stessa proteina contemporaneamente. La relazione tra tensione di fluorescenza si ottiene tracciando l'intensità della fluorescenza allo stato stazionario rispetto alla tensione.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come esprimere gli amminoacidi fluorescenti innaturali negli ovociti di Xenopus e di come eseguire la fluorimetria voltaggio-clamp a uno o due colori. Una volta padroneggiata la tecnica, dovrebbe richiedere all'incirca la stessa quantità di tempo degli esperimenti di elettrofisiologia tradizionali, basta il passaggio aggiuntivo di iniettare il DNA nel nucleo dell'ovocita. Quando si tenta questa procedura, è importante ricordarsi di verificare la presenza di perdite in assenza dell'aminoacido innaturale.

Questo deve essere fatto per ogni mutazione, poiché la quantità di espressione di leak dipende dal sito di inserzione del codone di stop all'interno della proteina. Questa tecnica consente ora ai ricercatori di studiare i cambiamenti conformazionali sul sito citosolico della proteina, dove si verificano molti dei meccanismi regolatori.