Misurazione ripetuta di attività muscolare respiratoria e ventilazione in modelli murini di malattie neuromuscolari

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare ripetutamente l'attività dei muscoli respiratori e la ventilazione durante la progressione della malattia. A seguito dell'impianto chirurgico di un dispositivo di telemetria con elettromiografie inserite in muscoli selezionati. Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande chiave su come i muscoli respiratori accessori compensano la compromissione della funzione del diaframma a seguito di malattia o lesione.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che la ventilazione e l'attività dei muscoli respiratori possono essere misurate sullo stesso topo che si comporta liberamente durante la progressione della malattia. Questo metodo può fornire informazioni sulla diagonsi e sul trattamento della SLA, ma può anche essere applicato ad altri modelli di malattia neuromuscolare o lesione del midollo spinale. Inizia preparando gli elettrocavi EMG.

Utilizzare le forbici riservate alla manipolazione dei fili per tagliare gli elettrocateteri distali, in modo che ci siano circa tre centimetri di piombo per raggiungere il muscolo bersaglio. Quindi utilizzare un bisturi per spegnere 0,5 centimetri di copertura in plastica senza tagliare il filo stesso. Quindi usa gli strumenti per la manipolazione dei fili per allungare le estremità dei cavi a quattro o cinque volte la loro lunghezza originale.

Tagliare il filo esposto dei cavi in modo che siano lunghi 0,5 centimetri. Quindi preparare i cappucci di piombo per coprire le estremità del filo tagliando i tubi da 0,25 centimetri dall'involucro di plastica precedentemente rimosso. Dopo aver anestetizzato il topo, eseguire un pizzicamento delle dita dei piedi e un pizzico della coda per assicurarsi che il topo sia completamente anestetizzato dall'assenza di una reazione.

Quindi trasferire il topo nell'ambulatorio e posizionare il cono nasale per mantenere l'anestesia durante l'intervento chirurgico. Applicare un unguento oftalmico lubrificante per evitare che gli occhi si secchino durante l'intervento chirurgico. Agganciare le unghie dei piedi omolateralmente al sito chirurgico per ridurre la possibilità che il topo estragga le mine o causi ferite graffiando durante il processo di guarigione.

Radere il mouse per esporre un sito chirurgico tra l'orecchio e la spalla. Alternare quindi il tampone sul sito chirurgico, prima con disinfettante e poi con isopropanolo. Per iniziare l'impianto, tirare l'arto anteriore verso il piede omolaterale per spostare caudalmente la scapola, fornendo l'accesso chirurgico ai muscoli scaleno e trapezio.

Usa una pinza smussata e curva per trattenere la zampa anteriore omolateralmente al sito chirurgico e fissa la zampa con del nastro adesivo. Dopo aver indossato un nuovo paio di guanti chirurgici, utilizzare il bisturi per praticare un'incisione obliqua di due centimetri tra la spalla e l'orecchio. Quindi, con 2 pinze per laminectomia in ciascuna mano, tirare indietro il cuscinetto adiposo e allargare i muscoli trapezio e platisma per esporre la fascia che copre i muscoli sternocleidomastoideo e scaleno.

Usa il muscolo sternocleidomastoideo pallido e il nervo frenico come punti di riferimento per identificare i muscoli scaleni. Si noti che il nervo frenico corre parallelo ai muscoli scaleni, mentre lo sternocleidomastoideo si trova in posizione inferiore. I muscoli scaleni corrono obliquamente dalle vertebre cervicali alle costole sotto il muscolo trapezio.

Gli elettrocateteri biopotenziali saranno inseriti nel muscolo scaleno anteriore che può essere identificato come il muscolo che corre adiacente al nervo frenico. Quindi crea una tasca per il trasmettitore inserendo le punte delle forbici di separazione del tessuto sotto la pelle del mouse e allargandole fino a formare una tasca leggermente più grande della larghezza del trasmettitore. Sciacquare la tasca con soluzione fisiologica sterile calda.

Quindi inserire il trasmettitore con il lato più piatto contro il muscolo. Posizionare il trasmettitore in modo che sia piatto e che i fili emergano dalla tasca, paralleli tra loro anziché attorcigliati. Far passare gli elettrocateteri dal trasmettitore ai muscoli scaleno e trapezio, in modo che i due set di elettrocateteri biopotenziali siano piatti e paralleli l'uno all'altro.

Quindi, usa la pinza per laminectomia per separare lo scaleno anteriore dai muscoli circostanti. Quindi inserire un ago calibro 25 attraverso il muscolo scaleno perpendicolare alle fibre muscolari. Inserire un guinzaglio nella punta dell'ago e poi estrarre l'ago dal muscolo lasciando dietro di sé il piombo inserito nel muscolo fino all'isolamento del filo.

Registra quali mine colorate vengono inserite in quale muscolo. Applicare una goccia di adesivo cianoacrilato su un ago calibro 21 per facilitare l'applicazione della colla sulle mine. Quindi posizionare l'adesivo sull'estremità esposta del filo vicino al muscolo in cui è inserito l'elettrocatetere.

Far scorrere rapidamente il cappuccio del cavo sul filo in modo che nessun filo sia esposto tra il cappuccio del cavo e il muscolo. Tagliare il filo in eccesso distalmente al cappuccio e applicare una goccia di adesivo cianoacrilato all'estremità del cappuccio e del filo. Dare alla colla il tempo di polimerizzare prima di rilasciarla.

Quindi inserire l'elettrocatetere di polarità opposta parallelo al primo nello stesso muscolo nello stesso modo. Questo cavo dovrebbe essere a uno o due millimetri di distanza dal primo piombo. Ripetere la procedura per inserire gli elettrocateteri nel muscolo trapezio, situato appena anteriormente al muscolo scaleno come mostrato qui.

Quindi controlla che i cavi siano fissati in posizione e che ci sia abbastanza gioco nei cavi per consentire all'animale di eseguire movimenti del corpo senza tirare i cavi. Quindi rimuovere delicatamente il nastro che tiene premuto l'arto anteriore. Tira indietro il cuscinetto adiposo sopra il muscolo e usalo per coprire gli elettrocateteri inseriti.

Quindi, stuzzicare i lembi di pelle in modo che l'incisione si allinei. Pizzicare una parte dei lembi di pelle insieme con una pinza curva e applicare una piccola linea di adesivo cianoacrilato lungo questa linea. Iniettare 0,1 millilitri di carprofene per via sottocutanea per alleviare il dolore postoperatorio mentre l'animale è ancora sotto anestesia.

Rimuovi l'animale dall'ogiva e mettilo in una gabbia pulita nell'incubatrice preriscaldata fino a quando l'animale non è sveglio e si muove volontariamente nella gabbia. Posizionare il topo nella camera di pletismografia per almeno un'ora per acclimatarlo prima di registrare l'EMG e la pletismografia. Prima della registrazione ma dopo la calibrazione, accendere il trasmettitore posizionando un potente magnete a un pollice dall'animale impiantato.

Una luce rossa sulla parte anteriore del ricevitore indicherà quando il trasmettitore è acceso. Avviare l'acquisizione utilizzando il menu a discesa Acquisizione e scegliere Avvia acquisizione. Sebbene la durata della registrazione possa variare in base all'esperimento, una tipica pletismografia e una registrazione EMG durano da una a tre ore.

Al termine dell'acquisizione, spegnere il trasmettitore con un magnete e riportare l'animale nella gabbia di casa. Di seguito sono riportate le tracce WBP ed EMG dei muscoli scaleno e trapezio da un topo SOD-1 (G93A) presintomatico il giorno postnatale 98. Per l'analisi vengono utilizzati i periodi in cui l'animale è a riposo.

Il riquadro rosso mostra tracce EMG a riposo prive di attacchi EMG, caratteristica di un topo presintomatico. Le tracce al di fuori del riquadro rosso mostrano picchi ampi e irregolari nelle tracce di pletismografia e nell'attività muscolare e nelle tracce EMG, tipiche quando un animale è in movimento. Questa immagine mostra le tracce WBP ed EMG del muscolo trapezio da un topo SOD-1 (G93A) sintomatico il giorno postnatale 126, quando è presente un attacco EMG mentre il topo è a riposo.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 35 minuti se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura, gli animali impiantati possono essere utilizzati per valutare l'efficacia dei farmaci per migliorare l'attività dei muscoli respiratori accessori in modelli di malattia o lesione.