Misurazione ripetuta di attività muscolare respiratoria e ventilazione in modelli murini di malattie neuromuscolari

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare ripetutamente l'attività dei muscoli respiratori e la ventilazione durante tutta la progressione della malattia. Dopo l'impianto chirurgico di un dispositivo di telemetria con elettrodi di elettromiografia inseriti in muscoli selezionati. Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande fondamentali su come i muscoli respiratori accessori compensino il deficit della funzione del diaframma in seguito a malattia o lesione.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che la ventilazione e l'attività muscolare respiratoria possono essere misurate sullo stesso mouse libero di muoversi durante tutta la progressione della malattia. Questo metodo può fornire informazioni utili per la diagnosi e il trattamento della SLA, ma può essere applicato anche ad altri modelli di malattie neuromuscolari o lesioni del midollo spinale. Iniziare preparando i fili elettrodi per l'EMG.

Utilizzare forbici riservate alla manipolazione dei fili per tagliare i capi distali, in modo da lasciare circa tre centimetri di filo per raggiungere il muscolo bersaglio. Successivamente, utilizzare un bisturi per rimuovere 0,5 centimetri del rivestimento in plastica senza tagliare il filo stesso. Quindi, utilizzare strumenti per la manipolazione dei fili per allungare le estremità dei capi a quattro o cinque volte la loro lunghezza originale.

Tagliare il filo scoperto dei conduttori in modo che abbiano una lunghezza di 0,5 centimetri. Preparare quindi i cappucci per i conduttori tagliando spezzoni lunghi 0,25 centimetri dalla guaina di plastica rimossa in precedenza. Dopo aver anestetizzato il topo, eseguire una compressione del dito del piede e una compressione della coda per verificare che il topo sia completamente anestetizzato, in assenza di reazione.

Quindi trasferire il topo nell'area chirurgica e posizionare il cono nasale per mantenere l'anestesia durante l'intervento. Applicare un unguento oftalmico lubrificante per prevenire l'essiccamento degli occhi durante l'intervento. Tagliare le unghie dei piedi controlaterali rispetto al sito chirurgico per ridurre il rischio che il topo estragga i fili o causi ferite graffiando durante il processo di guarigione.

Rasare il topo per esporre un'area chirurgica tra l'orecchio e la spalla. Alternare quindi tamponamenti dell'area chirurgica, prima con disinfettante e poi con isopropanolo. Per iniziare l'implantazione, tirare l'arto anteriore verso il piede controlaterale in modo da spostare caudalmente la scapola, permettendo l'accesso chirurgico ai muscoli scaleni e trapezio.

Utilizzare pinze curve smussate per trattenere la zampa anteriore controlaterale al sito chirurgico e fissare la zampa con del nastro. Dopo aver indossato un nuovo paio di guanti chirurgici, utilizzare il bisturi per praticare un'incisione obliqua lunga due centimetri tra la spalla e l'orecchio. Successivamente, con una pinza da laminectomia in ciascuna mano, tirare indietro il cuscinetto adiposo e separare i muscoli trapezio e platisma per esporre la fascia che ricopre i muscoli sternocleidomastoideo e scaleni.

Utilizzare il muscolo sternocleidomastoideo pallido e il nervo frenico come punti di riferimento per identificare i muscoli scaleni. Si noti che il nervo frenico corre parallelo ai muscoli scaleni, mentre lo sternocleidomastoideo si trova in posizione inferiore. I muscoli scaleni si estendono obliquamente dalle vertebre cervicali alle costole, sotto il muscolo trapezio.

Le derivazioni biopotenziali verranno inserite nel muscolo scaleno anteriore, identificabile come il muscolo che corre adiacente al nervo frenico. Successivamente, creare una tasca per il trasmettitore inserendo le punte delle forbici separanti sotto la pelle del topo e allargandole fino a formare una tasca leggermente più grande della larghezza del trasmettitore. Sciacquare la tasca con soluzione salina sterile tiepida.

Inserire quindi il trasmettitore con il lato più piatto contro il muscolo. Posizionare il trasmettitore in modo che giaccia piatto e i fili escano dalla tasca in maniera parallela tra loro, anziché intrecciati. Condurre i cavi dal trasmettitore ai muscoli scaleno e trapezio, in modo che i due set di elettrodi per biopotenziali giacciano piatti e paralleli l'uno all'altro.

Successivamente, utilizzare le pinze per laminectomia per separare il muscolo scaleno anteriore dai muscoli circostanti. Inserire quindi un ago da 25 gauge attraverso il muscolo scaleno in modo perpendicolare alle fibre muscolari. Inserire un elettrodo nella punta dell'ago ed estrarre poi l'ago dal muscolo, lasciando l'elettrodo inserito nel muscolo fino all'isolamento del filo.

Registrare quale colore dei cavi viene inserito in ciascun muscolo. Applicare una goccia di adesivo cianoacrilico su un ago da 21 gauge per facilitare l'applicazione della colla sui cavi. Successivamente, applicare l'adesivo sull'estremità esposta del filo in prossimità del muscolo in cui il cavo viene inserito.

Fare scorrere rapidamente il cappuccio del filo sul filamento in modo che nessuna parte del filo sia esposta tra il cappuccio e il muscolo. Tagliare l'eccesso di filo in posizione distale rispetto al cappuccio e applicare una goccia di adesivo cianoacrilato sull'estremità del cappuccio del filo e sul filo stesso. Attendere che la colla polimerizzi prima di rilasciare.

Inserire quindi il secondo elettrodo di polarità opposta parallelamente al primo, nello stesso muscolo e con lo stesso metodo. Questo elettrodo deve trovarsi a una distanza di uno o due millimetri dal primo. Ripetere la procedura per inserire gli elettrodi nel muscolo trapezio, situato appena anteriormente al muscolo scaleno, come mostrato in figura.

Verificare quindi che i cavi siano fissati saldamente e che ci sia un po' di gioco sufficiente nei cavi per consentire all'animale di compiere movimenti del corpo senza tirare i cavi stessi. Rimuovere quindi delicatamente il nastro che tiene premuto l'arto anteriore. Riposizionare il cuscinetto adiposo sopra il muscolo e utilizzarlo per coprire i cavi inseriti.

Successivamente, riportare insieme i lembi cutanei in modo che l'incisione risulti allineata. Pinzare una porzione dei lembi cutanei con pinze curve ed applicare una sottile striscia di adesivo a base di cianoacrilato lungo questa linea. Iniettare 0,1 millilitri di carprofene per via sottocutanea per alleviare il dolore postoperatorio mentre l'animale è ancora sotto anestesia.

Rimuovere l'animale dal cono nasale e posizionarlo in una gabbia pulita all'interno dell'incubatrice preriscaldata fino a quando non si sveglia e si muove spontaneamente all'interno della gabbia. Posizionare il topo nella camera di pletismografia per almeno un'ora per abituarlo prima di registrare l'EMG e la pletismografia. Prima della registrazione ma dopo la calibrazione, accendere il trasmettitore avvicinando un magnete potente entro un pollice dall'animale impiantato.

Una luce rossa sulla parte anteriore del ricevitore indica quando il trasmettitore è acceso. Avviare l'acquisizione utilizzando il menu a discesa denominato Acquisition e selezionare Start Acquisition. Sebbene la durata della registrazione possa variare a seconda dell'esperimento, una tipica registrazione di pletismografia ed EMG dura da una a tre ore.

Al termine dell'acquisizione, spegnere il trasmettitore con un magnete e restituire l'animale alla gabbia di mantenimento. Di seguito sono riportati i tracciati WBP e EMG dei muscoli scaleno e trapezio di un topo SOD-1(G93A) presintomatico al giorno postnatale 98. I periodi in cui l'animale è a riposo vengono utilizzati per l'analisi.

La scatola rossa mostra tracce di elettromiografia (EMG) a riposo prive di scariche EMG, caratteristiche di un topo presintomatico. Le tracce al di fuori della scatola rossa mostrano picchi ampi e irregolari nei tracciati della pletismografia e nell’attività muscolare e nelle tracce EMG, tipici quando un animale è in movimento. Questa immagine mostra i tracciati di pletismografia a tutto corpo (WBP) e di EMG del muscolo trapezio di un topo sintomatico SOD-1(G93A) al giorno postnatale 126, quando è presente una scarica EMG mentre il topo è a riposo.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 35 minuti se effettuata correttamente. Dopo questa procedura, gli animali impiantati possono essere utilizzati per valutare l'efficacia di farmaci nel potenziare l'attività dei muscoli respiratori accessori in modelli di malattia o lesione.