Un nuovo metodo per modellare l'encefalopatia traumatica cronica in Drosophila

L'obiettivo generale di questa nuova procedura è quello di infliggere lesioni cerebrali traumatiche chiuse nel moscerino della frutta, Drosophila, per stabilire un nuovo modello di encefalopatia traumatica cronica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'encefalopatia traumatica cronica, come ad esempio il modo in cui il trauma ripetitivo induce la degenerazione neuronale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che eroga gli impatti ripetitivi di forze regolabili direttamente alla testa della mosca senza causare danni ad altre parti del corpo dell'animale.

La dimostrazione nel mondo reale di questo metodo è fondamentale in quanto l'assemblaggio del dispositivo e le fasi di caricamento al volo sono difficili da imparare, perché la testa della Drosophila è così piccola ed è importante applicare l'impatto solo alla testa. Per realizzare l'apparecchio utilizzato per commozione cerebrale o colpire i moscerini della frutta, in primo luogo, realizzare la parte dell'impattatore dell'apparecchio. Rimuovere lo stantuffo da una siringa di tubercolina in policarbonato da un millilitro e poi tagliare il fusto in corrispondenza del segno di un millilitro.

Per un impattatore, utilizzare la barriera aerosol che si trova su un puntale per pipette da 200 microlitri. Questo impattatore dovrebbe essere lungo tre millimetri e avere un diametro di quattro millimetri. Quindi, inserire l'impattatore nel cilindro della siringa con il lato piatto rivolto verso l'ugello.

Per fornire forza, collegare il corpo della siringa a un regolatore di flusso di anidride carbonica. Il regolatore deve essere dotato di un interruttore a levetta On Off e di un buon controllo della portata del gas. Quindi, fissare la canna verticalmente a un supporto di ferro, in modo tale che l'impattatore cada sul fondo della canna.

Quindi, crea il supporto per mosche. Iniziare con un puntale per pipetta da 200 microlitri. Tagliare la punta della pipetta a cinque millimetri dall'estremità piccola per creare un'apertura di 8 millimetri di diametro.

Una testa di mosca passerà attraverso questo foro, ma il torace no. Infine, crea un per il supporto della mosca e il dispositivo di impatto. Per prima cosa, tagliare un puntale per pipetta da un millilitro a 44 millimetri dalla piccola apertura.

In secondo luogo, tagliare una lunghezza di sei millimetri dal coperchio dell'ago per una siringa da un millilitro. Quindi, unisci i due. Anestetizzare una mosca femmina adulta di due giorni usando l'anidride carbonica.

Dal cuscinetto di anidride carbonica, utilizzare una spazzola fine per trasferire delicatamente la mosca nel supporto. Quindi, picchiettare delicatamente il supporto fino a quando la testina non sporge dalla punta. Se la proboscide è esposta, usa un ago da siringa smussato da un millilitro per infilarlo delicatamente all'interno della punta.

È fondamentale mantenere il corpo della mosca, in particolare la parte della bocca, all'interno del supporto. In caso contrario, la mosca potrebbe morire per danni agli organi interni o per non essere in grado di ingerire cibo. Quindi, impostare la pressione del gas su 100 kilopascal e regolare il flusso secondo necessità.

Una volta caricata la mosca, serrare il supporto al cilindro della siringa utilizzando il connettore, in modo che la testa della mosca sia rivolta verso il basso. Quindi, utilizzando l'interruttore a levetta, invia una raffica di gas che muove l'impattatore per colpire la mosca una e una sola volta. Ora, stacca il portamosche e scarica nuovamente la mosca sul cuscinetto di anidride carbonica.

Spazzolare la mosca in una fiala vuota finché non si riprende. Conservare una mosca per fiala. Il recupero richiede solo pochi minuti.

Ripetere il processo per testare quattro mosche per gruppo sperimentale. L'elaborazione di due gruppi, un test e uno sham, dovrebbe richiedere solo dai 20 ai 30 minuti. Trattare le finzioni proprio come gli animali da esperimento, tranne per il fatto che non includere una barriera aerosol nel tubo dell'impatto.

Per tracciare i movimenti delle mosche in una capsula di Petri, per prima cosa, riempi una piastra di sei centimetri con elastomero siliconico trasparente per creare l'arena di tracciamento. Lascia uno spazio di tre millimetri tra il silicone e il coperchio in modo che le mosche possano camminare liberamente nello spazio, ma non spiccare il volo. Sotto l'arena di tracciamento, hanno uno sfondo bianco.

Successivamente, anestetizzare quattro mosche dello stesso gruppo di trattamento e posizionarle nell'arena. Lascia che le mosche si acclimatino per un'ora all'arena, che dovrebbe essere completamente illuminata e a circa 22 gradi Celsius. Non più caldo della temperatura ambiente.

Dopo un'ora, utilizza una fotocamera del dispositivo ad accoppiamento di carica posizionata sopra l'arena per registrare l'attività della mosca per cinque minuti. Dopo i cinque minuti di registrazione, anestetizzare le mosche nell'arena e rimetterle in una nuova fiala domestica. Quindi, smaltisci l'arena.

Successivamente, analizza le registrazioni utilizzando il software Ctrax disponibile gratuitamente. Questo software genera dati di tracciamento, che possono essere esportati in un formato compatibile con il linguaggio programmabile, come il formato MATLAB. Dai dati, calcola la distanza percorsa per fotogramma, la distanza media percorsa a piedi per ogni mosca e la distanza media percorsa per mosca.

Per la significatività statistica, aspettatevi di testare circa 100 mosche per gruppo di trattamento. Per stabilire un modello di encefalopatia traumatica cronica, l'efficacia di una singola lesione alla testa chiusa causata dall'apparato impattante a velocità diverse è stata analizzata utilizzando femmine di Canton-S di due giorni. La pressione del gas è stata mantenuta a 100 kilopascal.

Mosche esposte a un singolo colpo alla massima portata testata, hanno mostrato difetti esterni minimi. Nonostante non ci siano prove evidenti di danni esterni, le lesioni a una velocità di flusso di 15 litri al minuto sono state estremamente letali, con una sopravvivenza inferiore al 10% entro 24 ore. La sopravvivenza aumentava con velocità di flusso inferiori.

La sopravvivenza al cento per cento è stata raggiunta a cinque litri al minuto o meno, quindi cinque litri al minuto sono stati selezionati come standard per il modello. Subito dopo essere state colpite, le mosche hanno gradualmente recuperato la loro mobilità in quattro minuti. Il recupero per le finzioni è stato di circa un minuto più veloce.

Dopo l'impatto, il tracciamento del movimento video-assistito è stato utilizzato per misurare la funzione della locomotiva. Durante i due giorni successivi all'impatto, la locomozione è tornata lentamente alla normalità. Questa evidenza di un recupero graduale è in linea con il recupero della CTE nell'uomo.

Per valutare gli effetti a lungo termine, è stato applicato un protocollo ripetitivo di lesioni cerebrali traumatiche di cinque colpi in cinque giorni. Venti giorni dopo il trattamento, è stata confrontata la locomozione dei membri sopravvissuti in ciascun gruppo e il gruppo trattato ha chiaramente camminato meno. Anche la durata della vita del gruppo trattato è stata sostanzialmente ridotta, con una mediana a 26 giorni rispetto ai 37 giorni dei controlli.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo delle lesioni cerebrali traumatiche ripetitive lievi per esplorare i meccanismi patogenetici nel classico modello animale di Drosophila melanogaster. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di proteggere la proboscide, il torace e l'addome dall'impatto diretto della barriera aerosol.