Estrazione e purificazione di polifenoli da polvere di bacche congelata per il trattamento di cellule muscolari lisce vascolari

L'obiettivo generale di questo protocollo è fornire un metodo semplice e riproducibile per l'estrazione e la purificazione di polifenoli vegetali che potrebbero essere utilizzati per trattare cellule in futuro. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sul ruolo delle sostanze alimentari nella salute e nelle malattie umane. L'estrazione di polifenoli assistita da etanolo e ultrasuoni è un metodo facile e riproducibile che consente un rendimento maggiore di polifenoli.

L'uso del cloroformio permette la rimozione di zuccheri, acidi grassi, proteine e altre molecole, mentre l'acetato di etile consente la frazionatura dei polifenoli. Gli estratti concentrati di polifenoli così ottenuti possono quindi essere utilizzati in vitro e in vivo per studiare gli effetti dei polifenoli e i loro meccanismi d'azione su diversi tessuti, inclusivo del sistema cardiovascolare, come descritto in questo protocollo. Per iniziare questa procedura, preparare i reagenti come indicato nel protocollo testuale.

Successivamente, pesare 10 grammi di polvere di more liofilizzata. Aggiungere la polvere di frutti di bosco a un pallone da un litro contenente 100 millilitri di etanolo acquoso al 80%. Posizionare il pallone in un bagno ad ultrasuoni a 25 gradi Celsius.

Sotto un flusso continuo di azoto in condizioni di luce attenuata, sottoporre la miscela a sonificazione per 20 minuti a 42 kilohertz e 135 watt. Successivamente, filtrare la miscela attraverso una carta filtrante numero due utilizzando un imbuto di Buchner refrigerato con aspirazione sotto vuoto. Lavare la torta filtrata con 50 millilitri di etanolo al 100%.

Conservare il filtrato e aggiungere la torta di filtrazione a un pallone da un litro contenente 100 millilitri di etanolo acquoso al 80%. Quindi, ripetere il processo di estrazione sonicando, filtrando e lavando la miscela. Unire i due filtrati in un pallone contenente 50 millilitri di etanolo acquoso al 80%.

Utilizzando un evaporatore rotante a 62 gradi Celsius e 50 giri al minuto, evaporare il solvente. Proseguire fino a quando l'etanolo non evapora più. Successivamente, trasferire il campione in un tubo conico da 50 millilitri.

Iniettare gas azoto nella parte superiore del tubo per 10 minuti per far evaporare l'eventuale etanolo residuo. Congelare il campione a 80 gradi Celsius sotto zero per almeno 24 ore. Successivamente, liofilizzare il campione a 50 gradi Celsius sotto zero per circa otto ore.

Conservare i campioni a meno 20 gradi Celsius fino al momento dell'utilizzo. Per iniziare, pesare i campioni estratti liofilizzati. Aggiungere circa 20 millilitri di cloroformio in un becher da 100 millilitri contenente il campione.

Utilizzando un agitatore magnetico, mescolare la soluzione per cinque minuti. Successivamente, versare la miscela in un imbuto separatore. Lasciare decantare l'estratto grezzo per un'ora a temperatura ambiente.

Successivamente, scartare lo strato inferiore e raccogliere lo strato acquoso in un becher pulito. Aggiungere al becher due volumi di acetato di etile. Utilizzando una barretta magnetica, agitare la miscela per cinque minuti a temperatura ambiente.

Successivamente, utilizzare un imbuto di Buchner freddo con aspirazione a vuoto per filtrare la miscela attraverso carta da filtro numero due. Trasferire il campione filtrato in un pallone a fondo rotondo. Utilizzando un evaporatore rotante a 62 gradi Celsius e 50 giri al minuto, evaporare l'acetato di etile per 30 minuti.

Dopo questo, liofilizzare il campione a meno 50 gradi Celsius per otto ore. Trasferire il campione in un tubo conico da 50 millilitri e conservare a meno 20 gradi Celsius fino al momento dell'uso. Dopo aver coltivato le cellule muscolari lisce vascolari, scartare il mezzo di coltura e lavare le cellule due volte con soluzione salina tamponata al fosfato.

Quindi, aggiungere quattro millilitri di PBS e due millilitri di tripsina-EDTA 0,25%. Incubare in un incubatore a diossido di carbonio a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Successivamente, trasferire le cellule in un tubo da centrifuga da 15 millilitri contenente due millilitri di mezzo completo.

Centrifugare a 1.100 ×g per cinque minuti. Eliminare il soprannatante e risospendere il pellet cellulare con un millilitro di PBS. Contare le cellule utilizzando un emocitometro.

Successivamente, in piastre di coltura a sei pozzetti, seminare 50.000 cellule per pozzetto. Far crescere le cellule fino a raggiungere una confluenza del 90% in terreno completo contenente il 10% di siero fetale bovino. Preparare il terreno di trattamento come indicato nel protocollo testuale e conservarlo a quattro gradi Celsius.

Quindi, aggiungere 10 milligrammi di estratto grezzo o purificato a un millilitro di DMEM semplice per preparare una soluzione madre da 10 milligrammi per millilitro. Conservare la soluzione madre in aliquote da 200 microlitri a meno 20 gradi Celsius. Successivamente, aggiungere due millilitri di mezzo di trattamento, contenente il 0,5% di siero fetale bovino e la concentrazione desiderata della soluzione madre, alle cellule.

Incubare per tre giorni a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con 5% di CO2. Successivamente, se si prevede un trattamento con ormoni o fattori di crescita, privare le cellule di siero per almeno 24 ore incubandole con il mezzo di trattamento contenente 0,5% di siero fetale bovino. Dopo il periodo di privazione, aggiungere l'ormone desiderato, sostituendo il mezzo di trattamento ogni 24 ore per tre giorni, come descritto nel protocollo nel testo.

Successivamente, lavare le cellule trattate due volte in PBS freddo. Lisare le cellule utilizzando 200 microlitri di buffer di lisi su ghiaccio. Utilizzando spatole per cellule, raccogliere il lisato cellulare e trasferirlo in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitro.

Incubare il lisato raccolto per 20 minuti sul ghiaccio, eseguendo una vortexazione ogni cinque minuti. Successivamente, sottoporre gli estratti cellulari a sonicazione con tre impulsi a 125 watt per 10 secondi ciascuno, con una pausa di due secondi tra ogni impulso. Utilizzando un reagente per saggio proteico a 595 nanometri, misurare la concentrazione proteica.

Mescolare 50 microgrammi di proteina con il buffer di lisi per ottenere un volume totale massimo di 50 microlitri. Aggiungere 16 microlitri di un buffer campione 4x Laemmli. Successivamente, riscaldare i campioni per cinque minuti a 75 gradi Celsius.

Separare i campioni in gel di elettroforesi SDS-PAGE al 10% e trasferirli su membrane in PVDF per l'analisi Western blot con anticorpi specifici. In questo studio, viene utilizzata un'estrazione basata sull'etanolo per identificare i diversi livelli di acidi fenolici e flavonoidi presenti negli estratti di more grezzi e purificati. Mentre il processo di purificazione non ha modificato in modo significativo i livelli di acido gallico o di acido p-cumarico, ha invece aumentato i livelli di acido 3-O-caffeoilchinico da 170,5 a 235,3 ppm e di quercetina da 24,5 a 95 ppm.

Al contrario, l'acido ferulico e la rutina sono stati persi durante la purificazione dell'estratto grezzo. Dopo l'estrazione, le cellule muscolari lisce vascolari sono state incubate per tre giorni in un mezzo contenente dal 50 al 500 microgrammi per millilitro di estratto di lampone grezzo o purificato, in presenza di siero bovino fetale allo 0,5%. Si osserva che entrambi gli estratti sono efficaci nel ridurre la fosforilazione basale di ERK.

Tuttavia, si osserva che l'estratto purificato riduce fortemente la regolazione a 100 microgrammi per millilitro, mentre sono necessari da 400 a 500 microgrammi per millilitro di estratto grezzo. Ciò suggerisce che la maggiore efficienza dell'estratto purificato nell'inibire la fosforilazione di ERK è dovuta alle sue concentrazioni più elevate di composti polifenolici. Successivamente, le VSMC vengono trattate per 24 ore con 200 microgrammi per millilitro di estratto purificato di lampone prima dell'aggiunta di 100 nanomoli di angiotensina II. Come riportato in precedenza, l'estratto polifenolico di lampone riduce la fosforilazione di ERK indotta dall'angiotensina II, ma non dimostra alcun effetto sull'espressione di catalasi o SOD2.

Una volta padroneggiata, l'estrazione dei polifenoli può essere eseguita in poche ore. Questa tecnica può aiutare i ricercatori nel campo degli alimenti funzionali a esplorare il ruolo dei polifenoli in vitro e in modelli animali. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe essere in grado di estrarre e purificare i polifenoli da frutta e verdura e utilizzare gli estratti polifenolici per trattare cellule in coltura.

Abbiamo utilizzato questo metodo per dimostrare il ruolo dei polifenoli del lampone nero nella prevenzione dell'invecchiamento delle cellule muscolari lisce vascolari aortiche. Questo è significativo, considerando che l'invecchiamento del sistema vascolare è un fattore di rischio importante per lo sviluppo di malattie cardiovascolari.