Name: Estrazione e purificazione di polifenoli da polvere di bacche congelata per il trattamento di cellule muscolari lisce vascolari In vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Scopri l'estrazione e la purificazione di polifenoli da bacche liofilizzate per studiare i loro effetti cardioprotettivi sulle cellule muscolari lisce vascolari. Questo metodo a ultrasuoni con etanolo garantisce replicabilità e alta resa.

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Questo lavoro è stato finanziato dall&#39;American Heart Association (14GRNT20180028) e dal Florida State University Council sulla ricerca e la creatività (COFRS).

1. Preparazione dei reagenti <ol><li> Preparare l&#39;etanolo 80% (100 mL) mescolando 80 mL di etanolo assoluto (grado di biologia molecolare) e 20 mL di acqua sterile a coltura cellulare. </li><li> Per preparare l&#39;estratto di polifenolo (10 mg / ml), pesare 10 mg di CE o PE. Aggiungere 1 ml di pianta Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) sotto un cofano di cultura cellulare. Vortice la soluzione. Aliquota in porzioni da 200 μl e conservare a -20 ° C. </li><li> Preparare il buffer di lisi. <ol><li> Aggiungere 5 ml di soluzione 1 M di base di HEPES (pH 7,4, 50 mM finale), 1 ml di soluzione a base di 5 M NaCl (finale di 50 mM), 1 ml di 0,5 M soluzione EDTA (5 mM finale), 2 ml di 0,5 Soluzione finale di M NaF (10 mM finale), 286 μL di 700 mM soluzione a base di Na 3 VO 4 (finale di 2 mM), 5 ml di soluzione a base di 200 mM Na 4 P 2 O 7 (10 mM finale) e 5 ml di Soluzione di stock di 20% Triton-X-100 preparata in acqua (finale 1%). Aggiungere acqua per raggiungere un volume di 100 mL. Tenere a 4 ° C. </li><lI&gt; Aggiungere 10 μL / mL di cocktail inibitore della proteasi. Aggiungere fresco quando le cellule sono pronte per la lisi. </li></ol></li><li> Preparare il buffer di campionamento Laemmli (4x). <ol><li> Aggiungere 31,25 ml di soluzione a base di 2 M Tris (pH 6,8), 100 ml di glicerolo, 50 ml di una soluzione di sodio dodecil solfato (SDS) al 20% preparata in acqua e 50 ml di β-mercaptoetanolo. Aggiungere acqua fino a 250 ml. Tenere a 4 ° C. </li></ol></li><li> Per preparare il tampone Tris-Buffered Saline (TBS), pesare 3 g di Tris (25 mM finale), 0,18 g di KCl (2,5 mM finale) e 8,76 g di NaCl (150 mM finale). Regolare il pH a 7,4 e aggiungere acqua fino a 1 L. Tenere a RT. </li><li> Per preparare TBS-T, aggiungere 997,5 ml di TBS e 2,5 ml di una soluzione al 20% di Triton-X-100 preparata in acqua. Tenere a RT. </li></ol> 2. Preparazione degli estratti di Blackerry <ol><li> Preparazione di estratto grezzo dalla polvere di bacche congelata. <ol><li> Pesare 10 g di polvere di mirtillo congelato (o 5 g di polvere fresca). Se viene utilizzato frutto congelato, tagliarlo iIn pezzi molto piccoli prima di iniziare l&#39;estrazione. </li><li> Mescolare la polvere di frutta con 100 ml di etanolo acquoso 80% in un pallone Erlenmeyer da 1 litro rotondo. </li><li> Sonicare la miscela per 20 minuti a 42 kHz, 135 W utilizzando un bagno a ultrasuoni a 25 ° C, senza intervallo di tempo tra. Effettuare la sonicazione con continuo azoto azionato in luce sottomessa. Per la frutta congelata, aumentare il tempo di incubazione a 4 ore. </li><li> Filtrare la miscela attraverso una carta filtrante # 2 utilizzando un imbuto raffreddato Buchner con aspirazione a vuoto. NOTA: Alla fine di questo passaggio, i residui del campione appaiono sulla carta del filtro; Questo è chiamato torta di filtro. </li><li> Sciacquare la torta filtrante con 50 ml di etanolo al 100%. Salvare il filtrato e aggiungere la torta filtrante a una tazza da 1 L contenente 100 mL di etanolo acquoso 80%. </li><li> Ripetere il processo di estrazione del residuo (punti 2.1.2 - 2.1.4). </li><li> Combinare i due filtrati in un pallone a tondo con un ulteriore 50 mLDel 80% di etanolo acquoso. NOTA: Il volume finale deve essere di circa 300 ml. </li><li> Utilizzare un evaporatore rotativo a 62 ° C e 50 giri / min per evaporare il solvente. Continuare questo processo fino a quando l&#39;etanolo non si evapora più. NOTA: Questo processo dura circa 45 minuti. </li><li> Trasferire il campione in un tubo conico da 50 ml. Evaporare l&#39;etanolo iniettando gas azoto nella parte superiore del tubo per 10 min. NOTA: Questo passaggio è necessario per garantire l&#39;evaporazione completa dell&#39;etanolo. Il volume del campione a questo punto è di circa 20 ml. </li><li> Freeze il campione a -80 ° C per almeno 24 h. NOTA: questo passaggio è necessario per consentire un più efficiente processo di essiccazione a congelamento. </li><li> Asciugare il campione a -50 ° C per circa 8 ore. Conservare i campioni a -20 ° C. NOTA: L&#39;essiccatore a congelatore crea un vuoto potente a -50 ° C all&#39;interno della camera per asciugare i campioni ma conserva la maggior parte dei composti, come il polipheNOLS. </li></ol></li><li> Preparazione di estratti polifenolici purificati da estratti grezzi. <ol><li> Pesare i campioni estratti congelati. NOTA: Il volume dell&#39;estratto a questo punto è di circa 10 ml. </li><li> Aggiungere due volumi (~ 20 mL) di cloroformio all&#39;estratto grezzo e agitare la soluzione per 5 minuti in una mescola. </li><li> Versare la miscela in un imbuto separatore. Lasciare decantare l&#39;estratto grezzo per 1 h in RT per ottenere la frazione purificata. NOTA: A questo passo si forma una miscela a due fasi. </li><li> Scartare lo strato inferiore (fase di cloroformio) dall&#39;imbuto di separazione e raccogliere lo strato acquoso in un bicchiere pulito. </li><li> Aggiungere due volumi di acetato di etile alla frazione acquosa e utilizzare una barra magnetica per mescolare la miscela per 5 minuti a RT. </li><li> Filtrare la miscela con carta filtrante # 2 usando un imbuto raffreddato Buchner con aspirazione sotto vuoto. </li><li> Raccogliere il campione filtrato e trasferirlo in un pallone a tondina per essere noiCon l&#39;evaporatore rotativo. </li><li> Impostare l&#39;evaporatore rotativo a 62 ° C e 50 rpm ed evaporare l&#39;acetato di etile per circa 30 minuti. </li><li> Asciugare il campione a -50 ° C per circa 8 ore. Trasferire il campione in un tubo conico da 50 ml e conservarlo a -20 ° C. </li></ol></li></ol> 3. Trattamento di VSMC con estratti di Berry <ol><li> VSMCs cultura. <ol><li> Isolare VSMC dalle aortas toraciche dei ratti di Sprague-Dawley eseguendo una digestione enzimatica, come descritto in precedenza 29 . Coltivare i VSMC come descritto 29 . </li><li> Preparare un mezzo completo per la coltura di VSMC usando DMEM contenente 1 g / L di glucosio e completato con 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 100 U / mL penicillina, 100 mg / mL streptomicina e 2 mM L-glutamina. Conservare il supporto completo a 4 ° C. </li></ol></li><li> Incubazione di VSMC con estratti di polifenoli. <ol><li> Per dividere i VSMC, scartare il cultuRe e lavare le cellule due volte con soluzione salina fosfatizzata (PBS). Aggiungere 4 mL di PBS e 2 mL di EDP 0,25% di tripsina. Incubare le cellule per 5 min a 37 ° C in un incubatore di CO 2 . <ol><li> Raccogliere le cellule, mescolarle con 2 ml di mezzo completo in un tubo centrifugo da 15 ml e centrifugare a 1100 g per 5 min. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare con 1 ml di PBS. Conta le cellule usando un emocitometro. </li><li> Sezionare 50.000 VSMCs per pozzetto in piastre di coltura a 6 pozzetti e svilupparle in un mezzo completo contenente il 10% di FBS fino a raggiungere il 90% di confluenza (circa 3 d). Mantenere i VSMC a 37 ° C in un incubatore di umidità del 5% CO 2 . </li></ol></li><li> Preparare il mezzo per il trattamento utilizzando un mezzo di DMEM contenente 1 g / L di glucosio, 100 U / mL di penicillina, 100 mg / mL di streptomicina, 2 mM di L-glutammina e 0,5% di FBS. Conservare il supporto di trattamento a 4 ° C. NOTA: Estratti di polifenoli e Ang II vengono aggiunti direttamente alle cellule utilizzando questo medium. </li><li> Preparare una soluzione di base di 10 mg / ml di estratto grezzo (CE) o di estratto purificato (PE) di polifenoli sciogliendo 10 mg di estratto in 1 ml di mezzo DMEM normale. Conservare le azione in aliquote da 200 μL a -20 ° C. </li><li> Incubare i VSMC con 2 ml di terreno di trattamento contenente 0,5% di FBS e aggiungere estratti CE o PE per ottenere una concentrazione di 50-500 μg / ml. Cambiare il supporto ogni 24 h aggiungendo estratti di polifenoli freschi. Trattare le cellule per 3 d. </li><li> Per il trattamento con Ang II o altri ormoni e fattori di crescita, affamati le cellule per almeno 24 ore incubando le cellule con terreno di trattamento contenente 0,5% di FBS prima dell&#39;aggiunta di Ang II (100 nM). NOTA: Si raccomanda l&#39;incubazione con e senza CE e PE nel mezzo di trattamento FBS di 0,5% prima dell&#39;aggiunta di Ang II. <ol><li> Dopo 24 ore di fame, aggiungere 100 nM Ang II. Sostituire il terreno di trattamento con fresco CE, PE o Ang II ogni 24 ore per 3 d. </li></ol></li></ol></li><li> Preparazione di campioni di cellule. <ol><li> Lavare le cellule trattate due volte in PBS freddo e lipezzare con 200 μl di tampone di lisi sul ghiaccio. </li><li> Raccogli i lisati delle cellule usando i raschiatori di cellule e trasferendo i lisati in tubi di microcentrifuga da 1,5 mL. Incubare i lisati cellulari totali per 20 minuti su ghiaccio e vortex ogni 5 min. </li><li> Sonicare l&#39;estratto delle cellule con tre bursts a 125 W per 10 s ciascuno, con una pausa di 2 s in mezzo. Tenere i campioni in ghiaccio per tutta la sonicazione. </li><li> Misurare la concentrazione proteica utilizzando un reagente di analisi proteica a 595 nm. </li><li> Conservare i campioni a -20 ° C per l&#39;analisi mediante blot western. </li></ol></li><li> Western blot. <ol><li> Mescolare uguali quantità di proteine ​​(circa 50 μg) dai campioni trattati non trattati e trattati con polifenoli o trattati con Ang II con tampone di lisi per ottenere un volume totale massimo di 50 μL. Aggiungere 16 μl di un tampone di campione 4x Laemmli. Riscaldare i campioni per 5 minuti a 75 ° C. </li><li> Separare il campioneIn 10% di gel SDS-PAGE e trasferirli a membrane PDVF a 10 V per 75 minuti in un sistema di trasferimento semi-secco per analisi Western blot con anticorpi specifici. </li><li> Bloccare la membrana con 2% di latte in TBS 0.05% Triton-X100 buffer (TBS-T) per 20 minuti. </li><li> Rimuovere il latte lavando la membrana almeno tre volte con TBS (5 min ciascuno) e incubare con anticorpi primari per 1 h a RT o O / N a 4 ° C. </li><li> Lavare la membrana tre volte, 10 minuti ciascuno, con TBS-T e incubare con un anticorpo secondario collegato HRP per 45 min. </li><li> Lavare la membrana tre volte, 10 minuti ciascuno, con TBS-T e sviluppare mediante chemiluminescenza aumentata (ECL). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I polifenoli isolati dalle bacche contengono composizioni distinte. Il protocollo di estrazione a base di etanolo qui descritto ha permesso di identificare diversi livelli di acidi fenolici e flavonoidi presenti nei grezzi e purificati estratti polifenolici di BL ( Tabella 1 ). CE è stata arricchita in acido gallico, acido ferulico, acido 4-O-caffeoilchinico e acido 5-O-caffeoilchinico. Il processo di purificazione non alterava significativamente i livelli di acido gallico e acido p-cumarico. Tuttavia, ...

I polifenoli sono composti che contengono almeno un anello fenolico nella loro struttura e sono abbondantemente presenti nel regno vegetale 1 . Gli esseri umani hanno consumato piante per millenni per scopi medicinali senza essere consapevoli dell&#39;esistenza di tali composti 2 . Molti frutti e verdure hanno alcuni composti polifenolici condivisi, anche se con quantità diverse, tra cui flavonoidi, stilbene e acidi fenolici 3 . Anche se i polifenoli sono spesso associati a frutta e verdura colorati, questo non è strettamente vero. Ad esempio, zeaxantina e xantina sono presenti nelle verdure che non sono molto colorate, come le cipolle e l&#39;aglio, provenienti dalla famiglia di scalloni e sono associati a numerosi benefici per la salute 4 . Oltre ad essere associati a numerosi vantaggi sanitari 5 , i polifenoli servono anche le piante proteggendole dagli insettiD radiazione ultravioletta 2 . I polifenoli si trovano comunemente nella dieta umana e sono considerati potenti antiossidanti, in quanto possono scavare le specie reattive di ossigeno (ROS) 6 , 7 , 8 . Hanno anche antinfiammatori 9 , antimicrobici 10 , antipertensivi 11 e 12 , 13 proprietà anti-cancerogene. Gli studi epidemiologici dimostrano un&#39;associazione inversa tra il consumo di flavonoidi e la malattia cardiovascolare (CVD) 16 , 17 e la mortalità 14 , 15 . Le bacche sono ampiamente consumate negli Stati Uniti e hanno elevate quantità di polifenoli, compresi i flavonoidi. Ad esempio, il consumo di succo di mora (BL) (300<html> Ml / d) per otto settimane ha significativamente ridotto la pressione sistolica nei pazienti dislipidemici 18 . Jeong et al. 19 riportarono che gli uomini e le donne pre-ipertensivi che consumavano 2,5 g di estratto di lampone nero (BRB) al giorno avevano una pressione arteriosa più bassa di 24 ore e di notte rispetto a quelle che consumavano un placebo. Raspberries (RB) ha ridotto la pressione sanguigna mentre aumenta l&#39;espressione di superossido dismutasi (SOD) in ratti spontaneamente ipertensivi 20 . Recentemente è stato dimostrato che BL, RB e BRB riducono i livelli di ROS e senescenza indotti da angiotensina II (Ang II) in cellule muscolari lisce vascolari (VSMCs) 21 . Inoltre, la frazione di antocianina dall&#39;estratto BL ha ridotto l&#39;espressione di sintesi dell&#39;ossido nitrico induttivo (iNOS) e ha inibito l&#39;attività del fattore nucleare kappa B (NF-κB) e della chinasi extracellulare-regolata (ERK) nel lipopolisaccaride (LPS) stimolata J774 celluleAss = &quot;xref&quot;&gt; 22. Gli estratti BRB hanno ridotto l&#39;attivazione di NF-κB e l&#39;espressione cicloossigenasi 2 (COX-2) in vitro 23 , ha migliorato il profilo lipidico e ha impedito la formazione di lesioni aterosclerosi nei topi alimentati ad una dieta ad alto contenuto di grassi 24 . Le antocianine, considerate i flavonoidi più abbondanti nelle bacche, modulano la risposta infiammatoria nei macrofagi RAW 264.7 stimolati da LPS diminuendo la produzione di alfa TNF-α 25 e diminuendo la proliferazione e la migrazione di VSMCs 26 . Dal momento che è cresciuto interesse a capire il ruolo dei polifenoli nella salute umana e nelle malattie, è importante ottimizzare il metodo di estrazione. L&#39;estrazione del solvente è ampiamente utilizzata per questo scopo, in quanto è conveniente e facilmente riproducibile. In questo studio, è stata utilizzata un&#39;estrazione di solvente con l&#39;etanolo, insieme ad un estratto ad ultrasuoniN, che è stato adattato da Kim e Lee 27 . La purificazione e la frazionamento di estratti grezzi (CE) utilizzando cloroformio e acetato di etile sono state eseguite per ottenere la frazione di estratto purificato (PE) che è stato adattato da Queires et al 28 . Inoltre, sono stati confrontati l&#39;efficacia degli estratti di polifenoli grezzi e purificati da BL alla riduzione della fosforilazione basale di ERK1 / 2 e sono stati forniti esempi rappresentativi dell&#39;effetto inibitorio dell&#39;estratto policifenolo BL purificato sulle riduzioni di segnalazione induciate da Ang II in VSMCs.

<table><tbody><tr><td>Angiotensina II</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>A9525-10MG</td><td>Trattamento di VSMCs</td></tr><tr><td>&beta;-actina</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>A2228</td><td>Anticorpo primario (1:5000)</td></tr><tr><td>Mora frutto</td><td>Mercer Foods</td><td></td><td>Mora liofilizzata in polvere</td></tr><tr><td>Catalasi&nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>219010</td><td>Anticorpo primario (1:1000)</td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Biotech Grd, Inc.</td><td>97064-678</td><td>Preparazione di estratti di polifenoli purificati</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM )</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>10-014-CV</td><td>Coltura di etanolo VSMC</td></tr><tr><td>(grado assoluto di biologia molecolare)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>E7023-500ML</td><td>Preparazione di estratti di polifenoli&nbsp;</td></tr><tr><td>Acetato di etile</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>439169</td><td>Preparazione di estratti di polifenoli purificati</td></tr><tr><td>ERK1/2</td><td>Cell Signaling Technology, Inc.</td><td>9102S</td><td>Anticorpo primario (1:500)</td></tr><tr><td>EDTA, 500 mM, pH 8.0</td><td>Teknova, Inc.</td><td>E0306</td><td>Tampone di lisi</td></tr><tr><td>Liofilizzatore</td><td>Labconco</td><td>VirTis Benchtop K</td><td>Preparazione di estratti di polifenoli</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Seradigm</td><td>1400-500</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>H3375</td><td>Tampone di lisi&nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>EMD Millipore, Inc.</td><td>7760</td><td>Tampone di lisi</td></tr><tr><td>NaF</td><td>J.T.Baker, Inc.</td><td>3688-01&nbsp;</td><td>Tampone di lisi</td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>450243</td><td>Tampone di lisi</td></tr><tr><td>Na4P2O7 , decaidrato</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>S-9515</td><td>Tampone di lisi</td></tr><tr><td>fosfo ERK1/2&nbsp;</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare, Inc.</td><td>9101S</td><td>Cocktail di inibitori della proteasi (1:1000) anticorpi primari</td></tr> <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>P8340-5ml</td><td>Tampone di lisi</td></tr><tr><td>Reagente colorante per il dosaggio delle proteine</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>500-0006</td><td>Misurazione della concentrazione di proteine</td></tr><tr><td>Membrana di trasferimento PVDF</td><td>Thermo Scientific, Inc.</td><td>88518</td><td>Western blots</td></tr><tr><td>Evaporatore rotatorio</td><td>Buchi Labortechnik</td><td>Rotavapor R3000</td><td>Preparazione di estratti di polifenoli</td></tr><tr><td>Acqua sterile</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-055-CV</td><td>Preparazione di estratti di polifenoli</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>QSonica, LLC</td><td>Q125</td><td>Preparazione di estratti cellulari</td></tr><tr><td>SOD2</td><td>Enzo Life Sciences, Inc.</td><td>ADI-SOD-110-F</td><td>Anticorpo primario (1:1000)</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>X100</td><td>Western blots</td></tr><tr><td>Whatman #2 carta da filtro</td><td>GE Healthcare, Inc.</td><td>28317-241</td><td>Preparazione di estratti di polifenoli</td></tr></tbody></table>

estrazione e purificazione di polifenoli da polvere di bacche congelata per il trattamento di cellule muscolari lisce vascolari<em&gt; in vitro</em

Extraction and Purification of Polyphenols from Freeze-dried Berry Powder for the Treatment of Vascular Smooth Muscle Cells In Vitro

Gli studi epidemiologici indicano che l&#39;aumento dell&#39;assunzione di flavonoidi è correlato alla diminuzione della mortalità dovuta a malattie cardiovascolari (CVD) negli Stati Uniti (Stati Uniti) e in Europa. Le bacche sono ampiamente consumate negli Stati Uniti e hanno un elevato contenuto polifenolico. I polifenoli hanno dimostrato di interagire con molti obiettivi molecolari e di esercitare numerose funzioni biologiche positive, inclusi gli effetti antiossidanti, antinfiammatori e cardioprotettivi. I polifenoli isolati dalla mora (BL), dal lampone (RB) e dal lampone nero (BRB) riducono lo stress ossidativo e la senescenza cellulare in risposta all&#39;angiotensina II (Ang II). Questo lavoro fornisce una descrizione dettagliata del protocollo utilizzato per preparare gli estratti di polifenoli da bacche congelate. Le estrazioni di polifenoli dalla polvere di bacche congelata sono state eseguite utilizzando l&#39;etanolo acquoso al 80% ed un metodo di estrazione ad ultrasuoni. L&#39;estratto grezzo è stato ulteriormente purificato e frazionato utilizzando cloroformio e acetato di etile,rispettivamente. Gli effetti di entrambi gli estratti grezzi e purificati sono stati testati su cellule muscolari lisce vascolari (VSMCs) in coltura.

È stato dimostrato in precedenza che gli estratti di polifenoli isolati da BL, RB e BRB hanno ridotto la senescenza dei VSMC in risposta a Ang II 21 . È stato dimostrato che questi estratti polifenolici purificati modulano la segnalazione di Ang II riducendo la fosforilazione di Akt, p38 Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) e ERK1 / 2. BL impedisce la senescenza riducendo l&#39;espressione della NADPH ossidasi (Nox) 1, un enzima che produce anioni superossidich...

Questo lavoro descrive un metodo passo-passo per preparare estratti ricchi di polifenoli dalla polvere di bacche congelata. Inoltre, fornisce una descrizione approfondita di come utilizzare questi estratti ricchi di polifenoli nella coltura cellulare in presenza dell&#39;ormone peptidico angiotensino II (Ang II) utilizzando cellule muscolari lisce vascolari (VSMCs).

Estrazione e purificazione di polifenoli da polvere di bacche congelata per il trattamento di cellule muscolari lisce vascolari<em&gt; In vitro</em

Epidemiological studies indicate that increased flavonoid intake correlates with decreased mortality due to cardiovascular diseases (CVD) in the United ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è fornire un metodo semplice e riproducibile per l'estrazione e la purificazione di polifenoli vegetali che potrebbero essere utilizzati per trattare cellule in futuro. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sul ruolo delle sostanze alimentari nella salute e nelle malattie umane. L'estrazione di polifenoli assistita da etanolo e ultrasuoni è un metodo facile e riproducibile che consente un rendimento maggiore di polifenoli.L'uso del cloroformio permette la rimozione di zuccheri, acidi grassi, proteine e altre molecole, mentre l'acetato di etile consente la frazionatura dei polifenoli. Gli estratti concentrati di polifenoli così ottenuti possono quindi essere utilizzati in vitro e in vivo per studiare gli effetti dei polifenoli e i loro meccanismi d'azione su diversi tessuti, inclusivo del sistema cardiovascolare, come descritto in questo protocollo. Per iniziare questa procedura, preparare i reagenti come indicato nel protocollo testuale.Successivamente, pesare 10 grammi di polvere di more liofilizzata. Aggiungere la polvere di frutti di bosco a un pallone da un litro contenente 100 millilitri di etanolo acquoso al 80%. Posizionare il pallone in un bagno ad ultrasuoni a 25 gradi Celsius.Sotto un flusso continuo di azoto in condizioni di luce attenuata, sottoporre la miscela a sonificazione per 20 minuti a 42 kilohertz e 135 watt. Successivamente, filtrare la miscela attraverso una carta filtrante numero due utilizzando un imbuto di Buchner refrigerato con aspirazione sotto vuoto. Lavare la torta filtrata con 50 millilitri di etanolo al 100%.Conservare il filtrato e aggiungere la torta di filtrazione a un pallone da un litro contenente 100 millilitri di etanolo acquoso al 80%. Quindi, ripetere il processo di estrazione sonicando, filtrando e lavando la miscela. Unire i due filtrati in un pallone contenente 50 millilitri di etanolo acquoso al 80%.Utilizzando un evaporatore rotante a 62 gradi Celsius e 50 giri al minuto, evaporare il solvente. Proseguire fino a quando l'etanolo non evapora più. Successivamente, trasferire il campione in un tubo conico da 50 millilitri.Iniettare gas azoto nella parte superiore del tubo per 10 minuti per far evaporare l'eventuale etanolo residuo. Congelare il campione a 80 gradi Celsius sotto zero per almeno 24 ore. Successivamente, liofilizzare il campione a 50 gradi Celsius sotto zero per circa otto ore.Conservare i campioni a meno 20 gradi Celsius fino al momento dell'utilizzo. Per iniziare, pesare i campioni estratti liofilizzati. Aggiungere circa 20 millilitri di cloroformio in un becher da 100 millilitri contenente il campione.Utilizzando un agitatore magnetico, mescolare la soluzione per cinque minuti. Successivamente, versare la miscela in un imbuto separatore. Lasciare decantare l'estratto grezzo per un'ora a temperatura ambiente.Successivamente, scartare lo strato inferiore e raccogliere lo strato acquoso in un becher pulito. Aggiungere al becher due volumi di acetato di etile. Utilizzando una barretta magnetica, agitare la miscela per cinque minuti a temperatura ambiente.Successivamente, utilizzare un imbuto di Buchner freddo con aspirazione a vuoto per filtrare la miscela attraverso carta da filtro numero due. Trasferire il campione filtrato in un pallone a fondo rotondo. Utilizzando un evaporatore rotante a 62 gradi Celsius e 50 giri al minuto, evaporare l'acetato di etile per 30 minuti.Dopo questo, liofilizzare il campione a meno 50 gradi Celsius per otto ore. Trasferire il campione in un tubo conico da 50 millilitri e conservare a meno 20 gradi Celsius fino al momento dell'uso. Dopo aver coltivato le cellule muscolari lisce vascolari, scartare il mezzo di coltura e lavare le cellule due volte con soluzione salina tamponata al fosfato.Quindi, aggiungere quattro millilitri di PBS e due millilitri di tripsina-EDTA 0,25%. Incubare in un incubatore a diossido di carbonio a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Successivamente, trasferire le cellule in un tubo da centrifuga da 15 millilitri contenente due millilitri di mezzo completo.Centrifugare a 1.100 ×g per cinque minuti. Eliminare il soprannatante e risospendere il pellet cellulare con un millilitro di PBS. Contare le cellule utilizzando un emocitometro.Successivamente, in piastre di coltura a sei pozzetti, seminare 50.000 cellule per pozzetto. Far crescere le cellule fino a raggiungere una confluenza del 90% in terreno completo contenente il 10% di siero fetale bovino. Preparare il terreno di trattamento come indicato nel protocollo testuale e conservarlo a quattro gradi Celsius.Quindi, aggiungere 10 milligrammi di estratto grezzo o purificato a un millilitro di DMEM semplice per preparare una soluzione madre da 10 milligrammi per millilitro. Conservare la soluzione madre in aliquote da 200 microlitri a meno 20 gradi Celsius. Successivamente, aggiungere due millilitri di mezzo di trattamento, contenente il 0,5% di siero fetale bovino e la concentrazione desiderata della soluzione madre, alle cellule.Incubare per tre giorni a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con 5% di CO2. Successivamente, se si prevede un trattamento con ormoni o fattori di crescita, privare le cellule di siero per almeno 24 ore incubandole con il mezzo di trattamento contenente 0,5% di siero fetale bovino. Dopo il periodo di privazione, aggiungere l'ormone desiderato, sostituendo il mezzo di trattamento ogni 24 ore per tre giorni, come descritto nel protocollo nel testo.Successivamente, lavare le cellule trattate due volte in PBS freddo. Lisare le cellule utilizzando 200 microlitri di buffer di lisi su ghiaccio. Utilizzando spatole per cellule, raccogliere il lisato cellulare e trasferirlo in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitro.Incubare il lisato raccolto per 20 minuti sul ghiaccio, eseguendo una vortexazione ogni cinque minuti. Successivamente, sottoporre gli estratti cellulari a sonicazione con tre impulsi a 125 watt per 10 secondi ciascuno, con una pausa di due secondi tra ogni impulso. Utilizzando un reagente per saggio proteico a 595 nanometri, misurare la concentrazione proteica.Mescolare 50 microgrammi di proteina con il buffer di lisi per ottenere un volume totale massimo di 50 microlitri. Aggiungere 16 microlitri di un buffer campione 4x Laemmli. Successivamente, riscaldare i campioni per cinque minuti a 75 gradi Celsius.Separare i campioni in gel di elettroforesi SDS-PAGE al 10% e trasferirli su membrane in PVDF per l'analisi Western blot con anticorpi specifici. In questo studio, viene utilizzata un'estrazione basata sull'etanolo per identificare i diversi livelli di acidi fenolici e flavonoidi presenti negli estratti di more grezzi e purificati. Mentre il processo di purificazione non ha modificato in modo significativo i livelli di acido gallico o di acido p-cumarico, ha invece aumentato i livelli di acido 3-O-caffeoilchinico da 170,5 a 235,3 ppm e di quercetina da 24,5 a 95 ppm.Al contrario, l'acido ferulico e la rutina sono stati persi durante la purificazione dell'estratto grezzo. Dopo l'estrazione, le cellule muscolari lisce vascolari sono state incubate per tre giorni in un mezzo contenente dal 50 al 500 microgrammi per millilitro di estratto di lampone grezzo o purificato, in presenza di siero bovino fetale allo 0,5%. Si osserva che entrambi gli estratti sono efficaci nel ridurre la fosforilazione basale di ERK.Tuttavia, si osserva che l'estratto purificato riduce fortemente la regolazione a 100 microgrammi per millilitro, mentre sono necessari da 400 a 500 microgrammi per millilitro di estratto grezzo. Ciò suggerisce che la maggiore efficienza dell'estratto purificato nell'inibire la fosforilazione di ERK è dovuta alle sue concentrazioni più elevate di composti polifenolici. Successivamente, le VSMC vengono trattate per 24 ore con 200 microgrammi per millilitro di estratto purificato di lampone prima dell'aggiunta di 100 nanomoli di angiotensina II. Come riportato in precedenza, l'estratto polifenolico di lampone riduce la fosforilazione di ERK indotta dall'angiotensina II, ma non dimostra alcun effetto sull'espressione di catalasi o SOD2.Una volta padroneggiata, l'estrazione dei polifenoli può essere eseguita in poche ore. Questa tecnica può aiutare i ricercatori nel campo degli alimenti funzionali a esplorare il ruolo dei polifenoli in vitro e in modelli animali. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe essere in grado di estrarre e purificare i polifenoli da frutta e verdura e utilizzare gli estratti polifenolici per trattare cellule in coltura.Abbiamo utilizzato questo metodo per dimostrare il ruolo dei polifenoli del lampone nero nella prevenzione dell'invecchiamento delle cellule muscolari lisce vascolari aortiche. Questo è significativo, considerando che l'invecchiamento del sistema vascolare è un fattore di rischio importante per lo sviluppo di malattie cardiovascolari.

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