Approccio preciso di ablazione cellulare per la modellazione di lesioni acute del rene nello sviluppo di zebrafish

L'obiettivo generale di questa procedura è indurre un'ablazione mirata delle cellule degli epiteli renali di Zebrafish per modellare il danno e la riparazione del nefrone. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo degli organi e in particolare della rigenerazione renale. Ad esempio, quali sono i principali processi cellulari coinvolti nella rigenerazione, qual è il grado di plasticità dei tessuti sopravvissuti e molti altri.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente un preciso controllo temporale spaziale della lesione, nonché la capacità di regolare il livello della lesione. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia o alla diagnosi di danno renale acuto, perché consente una precisa valutazione spaziale e temporale dei processi cellulari e molecolari coinvolti nel danno e nella rigenerazione delle cellule renali. Per iniziare, generare embrioni incrociando il rene GFP fluorescente Zebrafish.

Per 24 ore dopo la fecondazione, conservare gli embrioni in soluzione E3 a 28,5 gradi Celsius. Quindi utilizzare lo 0,003% di PTU in E3, per sostituire il mezzo E3. Riporta gli embrioni nell'incubatrice per sei o più giorni, a quel punto i reni sarebbero maturati.

Per mappare il pesce zebra per l'imaging dal vivo, preparare l'agarosio a basso punto di fusione dall'1% al 2% con una soluzione di trigaina da 0,2 milligrammi per millilitro. Assicurarsi che la soluzione di agarosio trigaina sia fredda prima di utilizzare una pipetta di plastica o di vetro per trasferire un embrione nella soluzione. Successivamente, utilizzando una pipetta di trasferimento, aspirare la larva nell'agarosio e depositarla al centro di un piatto da 35 millimetri.

Spalmare velocemente l'agarosio contenente il Zebrafish fino a coprire uniformemente il fondo del piatto. Quindi utilizzare una sonda di vetro per orientare la larva per la fotoablazione e l'imaging, in modo che il segmento renale di interesse sia perpendicolare al percorso del raggio, mentre il segmento controlaterale sia lontano dal raggio laser. L'orientamento del pesce zebra è fondamentale per le fasi successive che coinvolgono l'ablazione laser.

Una buona tecnica è consigliata per assicurarsi che le larve mantengano una posizione perpendicolare nell'agarosio. Coprire la capsula di Petri per ridurre al minimo l'evaporazione e lasciare solidificare l'agarosio per circa 15 minuti. Dopo aver impostato il microscopio confocale, secondo il protocollo di testo, nella configurazione verticale, posizionare la capsula di Petri contenente la larva sopra un vetrino da microscopio e utilizzare l'argilla da modellare per tenerla in posizione.

Quindi, posizionare la piastra di Petri scorrevole sul tavolino del microscopio. Quindi, aggiungere tre millilitri di soluzione di imaging. Sotto una lente per immersione in acqua, sollevare lentamente il tavolino, assicurandosi che la lente sia leggermente angolata per evitare che l'aria rimanga intrappolata nel percorso del raggio.

Una volta che la lente tocca la soluzione ad angolo, centrala in modo che si trovi nel campo visivo dell'embrione. Ora, utilizzando la sorgente di luce fluorescente, trova il segmento di interesse, quindi concentrati sul ramo superficiale per indirizzarlo per lesioni. I rami superficiali scelti per ridurre al minimo la dispersione della luce.

Nel software del microscopio, navigare per visualizzare, controllo dell'acquisizione, GUI compatta C2plus. Impostate il tempo di permanenza dei pixel su 1,9 microsecondi, le dimensioni del fotogramma su 512 x 512 pixel e le dimensioni del foro stenopeico su 90 micron. Impostare l'intensità del laser a 405 nanometri su zero e l'intensità del laser a 488 su un valore basso.

Durante l'utilizzo del laser a 488 nanometri, fare clic su scansione nell'interfaccia del software. Trova il segmento di interesse che è perpendicolare al percorso del fascio e che è ben visualizzato con una buona fluorescenza GFP. Una volta identificata la regione, passare a ROI, disegnare ROI ellittico per disegnare una regione di interesse.

Quindi, vai a visualizza, controlli di acquisizione, area di scansione C2plus e scegli l'area di scansione della banda, la maschera rettangolare apparirà all'interno di quell'interfaccia. Utilizzando il cursore, definire manualmente una scansione rettangolare per coprire il segmento da sottoporre all'ablazione laser. Fare clic con il pulsante destro del mouse all'interno dell'area della maschera per accettare la selezione.

Utilizzando solo il laser a 488 nanometri per attivare la GFP, inizia la misurazione del tempo monitorando il canale verde. Assicurarsi che l'intensità del laser 488 sia relativamente bassa. Misurare l'intensità media della GFP nella regione di interesse selezionando misura, misurazione del tempo.

Utilizza il grafico o la scheda dati per monitorare i livelli di intensità medi all'interno del ROI. Usando il laser viola, induci danni alle cellule renali aumentando l'intensità al 100% facendo scorrere il controllo della potenza del laser, completamente a destra. All'interno della scheda grafico, osservare un grafico a linee o utilizzare la scheda dati per osservare i valori numerici dell'intensità GFP e attendere che scenda al livello desiderato.

Ad esempio, il 50% della linea di base. Una volta che l'intensità della GFP all'interno del ROI ellittico è scesa al livello desiderato, diminuire immediatamente l'intensità del laser viola a zero nel pannello di controllo del software spostando il cursore di potenza del laser, completamente a sinistra. Infine, ottenere una nuova linea di base di fluorescenza GFP.

Come mostrato in questa figura, dopo l'esposizione alla luce laser a 405 nanometri, la fluorescenza GFP continua a scomparire una cellula alla volta. Fino a quando a 220 minuti, l'intero segmento dell'ablato perde il 100% della sua positività alla GFP. Ciò è dovuto alla morte cellulare e non alla sottoregolazione dell'espressione della GFP, come si vede dalla comparsa di nuclei positivi allo ioduro di propidio fluorescenti rossi nelle cellule che perdono la positività alla GFP.

Queste immagini dimostrano che variando l'esposizione iniziale, è possibile regolare la lesione e la risposta all'epitelio danneggiato. Con il 10%-20% di sbiancamento iniziale della GFP, non si osserva praticamente alcuna riduzione della positività alla GFP a cinque ore dall'infortunio. Il 50% e il 60% portano a una completa scomparsa della GFP a cinque ore, mentre il 30% e il 40% di sbiancamento portano a risultati intermedi con il 50% di morte stimata osservata a circa il 35% di sbiancamento fotografico.

Ciò è supportato dalla colorazione con ioduro di propidio, in cui il 20% di sbiancamento fotografico non provoca praticamente alcuna colorazione con ioduro di propidio a 100 minuti dopo l'ablazione. Tuttavia, il 50% di fotosbiancamento porta a una continua positività allo ioduro di propidio nell'epitelio ablato, dopo 60 minuti. Mentre il 30% e il 40% di fotosbiancamento porta all'incorporazione intermedia di ioduro di propidio.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 30 minuti se eseguita correttamente. Non dimenticare che lavorare con laser e reagenti chimici può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura dovrebbero essere sempre prese precauzioni come evitare di guardare il raggio laser e usare guanti quando si maneggiano sostanze chimiche. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la microscopia time lapse, la colorazione in immunofluorescenza e altri per rispondere a ulteriori domande volte a sezionare il danno renale e la riparazione a livello cellulare e molecolare.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della rigenerazione renale. Esplorare il ruolo della migrazione cellulare collettiva e della riparazione renale dopo una lesione nel pesce zebra. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la microscopia confocale per danneggiare segmenti renali specifici nelle larve e negli embrioni di pesce zebra transgenico GPF.