Approccio preciso di ablazione cellulare per la modellazione di lesioni acute del rene nello sviluppo di zebrafish

L'obiettivo generale di questa procedura è indurre l'ablazione mirata delle cellule epiteliali del rene del pesce zebra per modellare il danno e la riparazione del nefrone. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della rigenerazione degli organi, in particolare del rene, come ad esempio: quali sono i principali processi cellulari coinvolti nella rigenerazione, qual è il grado di plasticità dei tessuti sopravvissuti e molte altre.

Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente un controllo preciso spaziale e temporale del danno, oltre alla possibilità di regolare il livello di lesione. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia o alla diagnosi dell'insufficienza renale acuta, poiché permette una valutazione precisa dei processi cellulari e molecolari coinvolti nel danno e nella rigenerazione delle cellule renali, sia dal punto di vista spaziale che temporale. Per iniziare, generare embrioni incrociando Zebrafish fluorescenti GFP nei reni.

Per 24 ore successive alla fecondazione, mantenere gli embrioni in soluzione E3 a 28,5 gradi Celsius. Successivamente, utilizzare PTU allo 0,003% in E3 per sostituire il mezzo E3. Reintrodurre gli embrioni nell'incubatrice per sei giorni o più, al termine dei quali i reni saranno maturati.

Per mappare il pesce zebra per l'immagine in tempo reale, preparare da 1% a 2% di agarosio a basso punto di fusione con una soluzione di tricaina 0,2 milligrammi per millilitro. Assicurarsi che la soluzione di agarosio e tricaina si sia raffreddata prima di utilizzare una pipetta in plastica o vetro per trasferire un embrione nella soluzione. Successivamente, utilizzando una pipetta di trasferimento, aspirare la larva nell'agarosio e posizionarla al centro di una piastra da 35 millimetri.

Stendere rapidamente l'agarosio contenente il pesce zebra in modo da coprire uniformemente il fondo della piastra. Quindi utilizzare una sonda di vetro per orientare la larva per l'ablazione fotoindotta e l'acquisizione delle immagini, in modo che il segmento renale di interesse sia perpendicolare al percorso del fascio, mentre il segmento controlaterale sia lontano dal fascio laser. L'orientamento del pesce zebra è cruciale per i passaggi successivi che prevedono l'ablazione laser.

Si consiglia una buona tecnica per assicurare che le larve mantengano una posizione perpendicolare nell'agarosio. Coprire la piastra di Petri per ridurre al minimo l'evaporazione e lasciare solidificare l'agarosio per circa 15 minuti. Dopo aver configurato il microscopio confocale, secondo il protocollo descritto nel testo, in configurazione eretta, posizionare la piastra di Petri contenente la larva sopra un vetrino e utilizzare argilla modellabile per mantenerla in posizione.

Successivamente, posizionare la piastra di Petri scorrevole sul tavolino del microscopio. Poi, aggiungere tre millilitri di soluzione per l'acquisizione delle immagini. Con una lente ad immersione in acqua, sollevare lentamente il tavolino, assicurandosi che la lente sia leggermente inclinata per evitare che l'aria rimanga intrappolata nel percorso del fascio.

Una volta che la lente tocca la soluzione con un angolo, centrarla in modo che si trovi nel campo visivo all'altezza dell'embrione. A questo punto, utilizzando la sorgente di luce fluorescente, individuare il segmento di interesse, quindi mettere a fuoco sul ramo superficiale per colpirlo con l'infortunio. I rami superficiali vengono scelti per minimizzare la diffusione della luce.

Nel software del microscopio, accedere a visualizzazione, controllo acquisizione, interfaccia utente compatta C2plus. Impostare il tempo di permanenza del pixel a 1,9 microsecondi, la dimensione del fotogramma a 512 per 512 pixel e la dimensione del pinhole a 90 micron. Impostare l'intensità del laser a 405 nanometri a zero e l'intensità del laser a 488 nanometri a un valore basso.

Utilizzando il laser a 488 nanometri, fare clic su "scan" nell'interfaccia software. Individuare il segmento di interesse perpendicolare al percorso del fascio e ben visualizzato con una buona fluorescenza GFP. Una volta identificata questa regione, accedere a ROI e disegnare una ROI ellittica per definire l'area di interesse.

Successivamente, passare alla visualizzazione, ai controlli di acquisizione, all'area di scansione C2plus e selezionare l'area di scansione a banda; nella relativa interfaccia apparirà una maschera rettangolare. Utilizzando il cursore, definire manualmente una scansione rettangolare che copra il segmento destinato all'ablazione laser. Fare clic con il tasto destro all'interno dell'area della maschera per accettare la selezione.

Utilizzando solo il laser a 488 nanometri per attivare la GFP, iniziare la misurazione del tempo monitorando il canale verde. Assicurarsi che l'intensità del laser a 488 nanometri sia relativamente bassa. Misurare l'intensità media della GFP nella regione di interesse selezionando misura, misurazione del tempo.

Utilizzare il grafico o la scheda dati per monitorare i livelli medi di intensità all'interno dell'area di interesse (ROI). Utilizzando il laser violetto, indurre danni alle cellule renali aumentando l'intensità al 100% spostando il controllo della potenza del laser completamente a destra. Nella scheda del grafico, osservare un grafico a linee oppure utilizzare la scheda dati per osservare i valori numerici dell'intensità di GFP e attendere finché non scende a un livello desiderato.

Ad esempio, il 50% del valore iniziale. Una volta che l'intensità della GFP all'interno dell'area ellittica di interesse (ROI) è diminuita al livello desiderato, ridurre immediatamente a zero l'intensità del laser violetto tramite il pannello di controllo del software, spostando completamente a sinistra il cursore della potenza del laser. Infine, acquisire un nuovo valore iniziale della fluorescenza della GFP.

Come mostrato in questa figura, dopo l'esposizione alla luce laser a 405 nanometri, la fluorescenza della GFP continua a scomparire una cellula alla volta. Fino a quando, a 220 minuti, l'intero segmento ablato perde il 100% della positività per GFP. Ciò è dovuto alla morte cellulare e non alla riduzione dell'espressione di GFP, come evidenziato dall'apparizione di nuclei positivi al propidio ioduro fluorescente rosso nelle cellule che perdono la positività per GFP.

Queste immagini dimostrano che variando l'esposizione iniziale è possibile regolare il danno e la risposta dell'epitelio leso. Con un'iniziale foto-sbiancamento del GFP compreso tra il 10% e il 20%, a cinque ore dal trauma non si osserva praticamente alcuna riduzione della positività al GFP. Il 50% e il 60% portano a una completa scomparsa del GFP a cinque ore, mentre lo sbiancamento al 30% e al 40% dà risultati intermedi, con una mortalità stimata del 50% osservata a circa il 35% di foto-sbiancamento.

Questo è confermato dalla colorazione con ioduro di propidio, in cui il foto-sbiancamento al 20% non determina praticamente alcuna colorazione con ioduro di propidio a 100 minuti dall'ablazione. Tuttavia, il foto-sbiancamento al 50% porta a una positività continua all'ioduro di propidio nell'epitelio ablato dopo 60 minuti. Mentre il foto-sbiancamento al 30% e al 40% determina un incorporamento intermedio di ioduro di propidio.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 30 minuti se effettuata correttamente. Non dimenticare che lavorare con laser e reagenti chimici può essere estremamente pericoloso e precauzioni come evitare di guardare direttamente il fascio laser e utilizzare guanti durante la manipolazione di sostanze chimiche devono sempre essere osservate durante l'esecuzione di questa procedura. Dopo aver completato questa procedura, altri metodi come la microscopia a tempo-lampo, la colorazione immunofluorescente e altri possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande finalizzate allo studio del danno renale e della sua riparazione a livello cellulare e molecolare.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della rigenerazione renale, per esplorare il ruolo della migrazione collettiva delle cellule e della riparazione renale dopo un danno nel pesce zebra. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare la microscopia confocale per danneggiare segmenti renali specifici nei larve e negli embrioni di pesce zebra transgenici GPF.