Le reti neurali ricalcolate anatomicamente tridimensionali dei micro-tessuti per la ricostruzione, la modulazione e la modellazione del sistema nervoso

Questo protocollo descrive la fabbricazione di reti neurali ingegnerizzate con micro-tessuti o micro-TENN, che sono costrutti tridimensionali in miniatura costituiti da lunghi tratti assonali allineati che si estendono su popolazioni neuronali discrete all'interno del lume di un idrogel tubulare. I micro-TENN replicano l'anatomia generale a livello di sistema del connettoma cerebrale, in particolare, gruppi funzionalmente simili di neuroni collegati da lunghi tratti assonali. Poiché sono pre-cresciuti per emulare la citoarchitettura dei percorsi cerebrali, i micro-TENN possono essere applicati per la ricostruzione mirata di circuiti neurali persi a causa di traumi o malattie neurodegenerative e come modelli biofidelici per studi neurobiologici.

Uno degli aspetti più impegnativi di questo protocollo è lavorare con il fattore di forma su scala micron, che è in definitiva necessario per consentire una somministrazione minimamente invasiva nel cervello. Inizia rompendo manualmente i tubi capillari di vetro in frammenti da 2 a 2,5 centimetri e inserisci un ago per agopuntura in ciascun frammento. Trasferire un millilitro di agarosio al tre percento in DPBS sulla superficie di una capsula di Petri vuota.

Tenendo il tubo capillare nell'ago introdotto, posizionare un'estremità del tubo a contatto con la piscina di agarosio liquido per riempirla mediante azione capillare. Quando il liquido cessa di salire, rimuovere il tubo capillare dalla piscina e posizionarlo orizzontalmente sulla superficie di una capsula di Petri. Quindi, posiziona il pollice e l'indice su entrambi i lati del tubo e afferralo saldamente.

Usa l'altra mano per estrarre rapidamente l'ago mentre il pollice e l'indice impediscono alla microcolonna stessa di scivolare fuori dal tubo. Quindi inserire un ago calibro 30 nel tubo capillare per spingere lentamente la microcolonna in un piatto contenente DPBS. Trasferire con cautela una microcolonna dal DPBS a una piastra vuota utilizzando una pinza fine.

Aggiungere 10 microlitri di DPBS sulla parte superiore della microcolonna con un micropipettato per evitare che si secchi. Mentre si lavora sotto uno stereomicroscopio, far scattare la microcolonna con un microbisturi per accorciarla alla lunghezza desiderata. Quindi utilizzare una pinza fine per trasferire la microcolonna tagliata in una diversa capsula di Petri contenente DBPS.

Sterilizzare le microcolonne nelle piastre di Petri contenenti DPBS sotto luce ultravioletta per 30 minuti. Usa una punta da trapano per perforare 16 fori come un array 4 per 4 di 4 centimetri con una distanza di 1 centimetro nel coperchio di una capsula di Petri da 10 centimetri. All'interno di una cappa chimica, utilizzare il pezzo inferiore di una capsula di Petri per pesare 27 grammi di PDMS e tre grammi di agente indurente.

Mescolare con una micro spatola per distribuire uniformemente l'agente. Quindi coprire l'agente indurente PDMS con il coperchio forato. Collegare un'estremità di un tubo flessibile alla porta di aspirazione della cappa aspirante e inserire l'altra estremità nello stelo di un imbuto di dimensioni adeguate.

Posizionare un bulbo per pipetta da 1 millilitro su una punta da 1 millilitro nel tubo e tirare il tubo verso l'alto finché il bulbo non sigilla il tubo nello stelo dell'imbuto. Quindi, posizionare l'imbuto sul coperchio del piatto forato e fissare il tubo con un supporto robusto disponibile. Aprire la valvola del vuoto per cinque minuti per aspirare e portare le bolle d'aria in superficie.

Dopo cinque minuti, chiudere la valvola, rimuovere l'imbuto e colpire alcune volte la capsula di Petri contro la superficie della cappa aspirante per far scoppiare le bolle d'aria rimanenti. Posiziona uno stampo stampato in 3D in ciascuno dei pozzetti in una piastra di coltura a 12 pozzetti con le piramidi rivolte verso l'alto. Quindi versare l'agente indurente PDMS sopra gli stampi fino a riempire ogni pozzetto della piastra.

Trasferite la piastra coperta in forno per un'ora a 60 gradi Celsius ad asciugare. Dopo aver sterilizzato gli array PDMS mediante autoclave e aver lavorato in una cappa di biosicurezza, inserire un array di micropozzetti in ciascun pozzetto di una piastra sterile a 12 pozzetti. Per formare gli aggregati neuronali, utilizzare un micropipettato per aggiungere 12 microlitri di sospensione cellulare in ciascun micropozzetto dell'array PDMS.

Centrifugare la piastra a 200 volte g per cinque minuti per forzare l'aggregazione delle cellule sul fondo dei micropozzetti. Quindi aggiungere con cautela circa due millilitri di terreno di coltura alla parte superiore di ciascun array PDMS per coprire tutti i micropozzetti seminati. Incubare la piastra per 12-24 ore a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%.

Per iniziare la fabbricazione del nucleo CEM, mescolare il collagene di tipo 1, la laminina e il terreno di coltura in una provetta per microcentrifuga e regolare il pH da 7,2 a 7,4. Quindi posizionare il tubo contenente CEM sul ghiaccio. Utilizzare una pinza sterile per trasferire le microcolonne in piastre di Petri vuote da 35 o 60 millimetri.

Quindi, mentre si lavora sotto uno stereomicroscopio, utilizzare una punta da 10 microlitri attaccata a una punta da 1000 microlitri per estrarre DPBS residui e bolle d'aria dal lume. Aspirare rapidamente da quattro a cinque microlitri di CEM in una micropipetta, quindi posizionare la punta della micropipettata a un'estremità di una microcolonna e scaricare una quantità di CEM sufficiente a riempire il lume. Per prevenire la disidratazione, aggiungere due microlitri di CEM attorno a ciascuna microcolonna.

Incubare le microcolonne di idrogel CEM in piastre di Petri a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per 15 minuti. Procedere alla semina cellulare subito dopo l'incubazione. Trasferire circa 10-20 microlitri di terreno di coltura in due aree libere nelle piastre di Petri che contengono le microcolonne.

Utilizzare un micropipettato per raccogliere gli aggregati neuronali singolarmente e trasferirli nella capsula di Petri contenente i costrutti. Spostare gli aggregati con una pinza in una delle piccole vasche di terreno di coltura per preservare la salute delle cellule. Durante l'osservazione al microscopio, utilizzare una pinza per inserire un aggregato a un'estremità delle micro-colonne per micro-TENN unidirezionali o a ciascuna estremità per l'architettura bidirezionale.

Quindi spostare la microcolonna seminata nell'altro piccolo pool di terreno di coltura per evitare la disidratazione e preservare la salute dell'aggregato. Quando tutte le microcolonne sono state caricate, incubare a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per 45 minuti per consentire agli aggregati di aderire alla CEM. Dopo l'incubazione, verificare che gli aggregati rimangano alle estremità delle microcolonne utilizzando lo stereomicroscopio.

Infine, inondare accuratamente le piastre di Petri contenenti i micro-TENN con terreno di coltura utilizzando una pipetta. Metti i piatti in un'incubatrice a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per una coltura a lungo termine. Queste immagini a contrasto di fase mostrano micro-TENN lunghi 2 millilitri unidirezionali fino a otto giorni in vitro.

In queste immagini, si notino gli aggregati neuronali agli estremi della microcolonna mentre i tratti assonali allineati sporgono attraverso il lume. Come si vede qui, i tratti assonali estendono quasi l'intera lunghezza della microcolonna di cinque giorni in vitro. Per i micro-TENN bidirezionali da 5 millimetri, i tratti assonali popolano la lunghezza della microcolonna a 5 giorni in vitro e questa architettura viene mantenuta almeno fino a 10 giorni in vitro.

Le due immagini seguenti possono aiutare a risolvere i problemi relativi alla procedura. Questa immagine mostra una microcolonna di idrogel essiccata completamente disidratata a seguito della completa rimozione e/o evaporazione di DPBS, CEM o terreno di coltura durante la fabbricazione. Questa immagine mostra una microcolonna con il lume che riveste la parete esterna a causa della mancanza di allineamento concentrico dell'ago per agopuntura con il tubo capillare.

Infine, questa immagine confocale mostra un micro-TENN bidirezionale a 28 giorni in vitro, colorato per i nuclei cellulari con Hoechst in blu, e con assoni marcati con tudge one in rosso, e bottoni pre-sinaptici marcati con sinapsina 1 in verde. La migrazione cellulare dagli aggregati lungo i tratti assonali si osserva in presenza di terminali pre-sinaptici, come suggerito. I Micro-TENN sono costrutti autonomi, di ispirazione anatomica, che emulano aspetti chiave della citoarchitettura del connettoma; pertanto, i micro-TENN possono fornire un mezzo per sostituire i percorsi neurali persi al momento dell'impianto nel cervello.

I componenti cruciali di questo metodo includono lo schema di rivestimento tubolare del biomateriale, che consente la crescita assonale longitudinale, e il metodo aggregato, che garantisce l'ottenimento della corretta citoarchitettura dei corpi cellulari limitati alle estremità dei tratti assonali lungo l'interno. A seguito della padronanza di questi metodi, i principi di questa tecnica possono essere applicati per costruire micro-TENN con altri fenotipi cellulari e componenti di biomateriali, a seconda dell'applicazione specifica.