Le reti neurali ricalcolate anatomicamente tridimensionali dei micro-tessuti per la ricostruzione, la modulazione e la modellazione del sistema nervoso

Questo protocollo descrive la fabbricazione di reti neurali ingegnerizzate su microscala, o micro-TENNs, che sono costrutti tridimensionali miniaturizzati costituiti da lunghi tratti assonali allineati che si estendono tra popolazioni neuronali distinte all'interno del lume di un idrogel tubolare. Le micro-TENNs replicano l'anatomia generale a livello di sistema del connettoma cerebrale, in particolare gruppi funzionalmente simili di neuroni collegati da lunghi tratti assonali. Poiché vengono pre-coltivate per emulare la citotessitura dei percorsi cerebrali, le micro-TENNs possono essere utilizzate per la ricostruzione mirata di circuiti neurali andati perduti a causa di traumi o malattie neurodegenerative e come modelli biofedeli per studi neurobiologici.

Uno degli aspetti più complessi di questo protocollo è lavorare con una dimensione su scala micrometrica, che è fondamentale per consentire una somministrazione minimamente invasiva nel cervello. Iniziare rompendo manualmente dei capillari di vetro in frammenti lunghi da 2 a 2,5 centimetri, e inserire un ago da agopuntura in ciascun frammento. Trasferire un millilitro di agarosio al tre percento in DPBS sulla superficie di una piastra di Petri vuota.

Tenendo il capillare nell'ago inserito, appoggiare un'estremità del tubo a contatto con la pozzetta di agarosio liquido in modo da riempirlo per azione capillare. Quando il liquido smette di salire, rimuovere il capillare dalla pozzetta e posizionarlo orizzontalmente sulla superficie di una piastra di Petri. Successivamente, appoggiare pollice e indice su entrambi i lati del tubo e stringere saldamente.

Usare l'altra mano per estrarre rapidamente l'ago mentre il pollice e l'indice impediscono alla micro-colonna stessa di scivolare fuori dal tubo. Inserire quindi un ago da 30 gauge nel tubo capillare per spingere lentamente la micro-colonna in una piastra contenente DPBS. Trasferire con attenzione una micro-colonna da DPBS a una piastra vuota utilizzando pinzette fini.

Aggiungere 10 microlitri di DPBS sulla sommità della micro-colonna mediante micropipetta per prevenire l'essiccamento. Mentre si lavora al microscopio stereoscopico, tagliare la micro-colonna con un microbisturi per accorciarla alla lunghezza desiderata. Successivamente, utilizzare pinze fini per trasferire la micro-colonna tagliata in una diversa piastra di Petri contenente DPBS.

Sterilizzare le microcolonne nelle piastre di Petri contenenti DPBS sotto luce ultravioletta per 30 minuti. Utilizzare una punta da trapano per forare 16 fori disposti in un reticolo 4×4 di 4 centimetri con un’interasse di 1 centimetro nel coperchio di una piastra di Petri da 10 centimetri. All’interno di una cappa chimica, utilizzare la parte inferiore di una piastra di Petri per pesare 27 grammi di PDMS e 3 grammi di agente indurente.

Mescolare con una spatola micro per distribuire uniformemente il reagente. Quindi coprire l'agente indurente del PDMS con il coperchio forato. Collegare un'estremità di un tubo al porto sottovuoto della cappa, e inserire l'altra estremità nel gambo di un imbuto di dimensioni adeguate.

Posizionare una pipetta da 1 millilitro con punta da 1 millilitro nel tubo e tirare verso l'alto il tubo fino a quando la pipetta sigilla il tubo nel gambo del imbuto. Successivamente, posizionare l'imbuto sul coperchio del piatto forato e fissare il tubo con un supporto robusto disponibile. Aprire la valvola del vuoto per cinque minuti per aspirare e portare le bolle d'aria in superficie.

Dopo cinque minuti, chiudere la valvola, rimuovere il imbuto e battere la piastra di Petri contro la superficie della cappa alcune volte per eliminare eventuali bolle d'aria rimaste. Posizionare un modello di pozzetto piramidale stampato in 3D in ciascuno dei pozzetti di una piastra da coltura a 12 pozzetti, con le piramidi rivolte verso l'alto. Quindi versare l'agente indurente del PDMS sopra i modelli fino a riempire ciascun pozzetto della piastra.

Trasferire la piastra coperta in un forno per un'ora a 60 gradi Celsius per farla asciugare. Dopo aver sterilizzato gli array in PDMS mediante autoclave e operando in un armadio di sicurezza biologica, inserire un array di micropozzetti in ciascun pozzetto di una piastra sterile a 12 pozzetti. Per formare gli aggregati neuronali, utilizzare una micropipetta per aggiungere 12 microlitri di sospensione cellulare in ciascun micropozzetto dell'array in PDMS.

Centrifugare la piastra a 200 volte g per cinque minuti per favorire l'aggregazione delle cellule sul fondo delle micropozzette. Quindi aggiungere con attenzione circa due millilitri di mezzo di coltura sulla sommità di ogni array in PDMS in modo da coprire tutte le micropozzette seminate. Incubare la piastra per 12-24 ore a 37 gradi Celsius in presenza di anidride carbonica al 5%.

Per iniziare la fabbricazione del nucleo del CEM, mescolare il collagene di tipo 1, la laminina e il mezzo di coltura in un tubo da microcentrifuga e regolare il pH a 7,2-7,4. Successivamente, mettere il tubo contenente il CEM sul ghiaccio. Utilizzare pinze sterili per trasferire le microcolonne in piastre di Petri vuote da 35 o 60 millimetri.

Quindi, lavorando sotto un microscopio stereoscopico, utilizzare una punta da 10 microlitri collegata a una pipetta da 1000 microlitri per rimuovere il DPBS residuo e le bolle d'aria dalla cavità. Aspirare rapidamente quattro-cinque microlitri di CEM con una micropipetta, quindi posizionare la punta della micropipetta a un'estremità di una micro-colonna ed espellere una quantità sufficiente di CEM per riempire la cavità. Per prevenire la disidratazione, aggiungere due microlitri di CEM intorno a ciascuna micro-colonna.

Incubare le microcolonne di idrogel CEM in piatti di Petri a 37 gradi Celsius in presenza di anidride carbonica al 5% per 15 minuti. Procedere immediatamente alla semina cellulare dopo l'incubazione. Trasferire circa da 10 a 20 microlitri di mezzo di coltura in due aree libere dei piatti di Petri contenenti le microcolonne.

Utilizzare una micropipetta per raccogliere singolarmente gli aggregati neuronali e trasferirli nella piastra di Petri contenente le costruzioni. Spostare gli aggregati con pinzette in una delle piccole pozzette di mezzo di coltura per preservare la vitalità cellulare. Osservando al microscopio stereoscopico, utilizzare le pinzette per inserire un aggregato a un'estremità delle micro-colonne per micro-TENNs unidirezionali, oppure a ciascuna estremità per una architettura bidirezionale.

Quindi spostare la micro-colonna seminata nell'altra piccola pozzetta di mezzo di coltura per evitare la disidratazione e preservare la vitalità degli aggregati. Una volta caricati tutti i micro-colonne, incubare a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di anidride carbonica al 5% per 45 minuti, in modo da permettere agli aggregati di aderire al CEM. Al termine dell'incubazione, verificare che gli aggregati siano ancora presenti alle estremità delle micro-colonne utilizzando il microscopio stereoscopico.

Infine, aggiungere con attenzione il mezzo di coltura nelle piastre di Petri contenenti i micro-TENNs utilizzando una pipetta. Posizionare le piastre in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per la coltura a lungo termine. Queste immagini a contrasto di fase mostrano micro-TENNs lunghi 2 millilitri con crescita unidirezionale fino a otto giorni in vitro.

In queste immagini, osservare gli aggregati neuronali alle estremità della micro-colonna, mentre i tratti assonali allineati si estendono attraverso la cavità. Come mostrato qui, i tratti assonali si sviluppano per quasi tutta la lunghezza della micro-colonna entro cinque giorni in vitro. Per micro-TENNs bi-direzionali di 5 millimetri, i tratti assonali occupano l'intera lunghezza della micro-colonna a 5 giorni in vitro, e questa architettura viene mantenuta almeno fino a 10 giorni in vitro.

Le due immagini seguenti possono aiutare a risolvere i problemi relativi alla procedura. Questa immagine mostra una microcolonna di idrogel completamente disidratata a causa della rimozione totale e/o dell'evaporazione del DPBS, del CEM o del mezzo di coltura durante la fabbricazione. Questa immagine mostra una microcolonna con il lume allineato alla parete esterna a causa della mancanza di allineamento concentrico dell'ago da agopuntura con il tubo capillare.

Infine, questa immagine confocale mostra un micro-TENN bidirezionale a 28 giorni in vitro, colorato per i nuclei cellulari con Hoechst in blu, con assoni marcati con tudge one in rosso e bouton pre-sinaptici marcati con sinapsin 1 in verde. La migrazione cellulare dagli aggregati lungo i tratti assonali è visibile in presenza di terminali pre-sinaptici, come suggerito. I micro-TENN sono costrutti autonomi, ispirati all'anatomia, che riproducono aspetti chiave della citarchitettura del connettoma; pertanto, i micro-TENN potrebbero fornire un mezzo per sostituire i percorsi neurali persi dopo l'impianto nel cervello.

Componenti fondamentali di questo metodo includono lo schema di incapsulamento del biomateriale tubolare, che permette la crescita assoniale longitudinale, e il metodo aggregato, che garantisce l'ottenimento della corretta citotessitura dei corpi cellulari limitati alle estremità dei tratti assoniali lungo l'interno. Dopo aver padroneggiato questi metodi, i principi di questa tecnica possono essere applicati per costruire micro-TENNs con altri fenotipi cellulari e componenti biomateriali, in base all'applicazione specifica.