Name: La misurazione della legame proteico con F-actina mediante co-sedimentazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Scopri il saggio di co-sedimentazione per misurare l'affinità di legame tra proteine e F-actina. Questo metodo biochimico utilizza ultracentrifuga e SDS-PAGE per quantificare l'interazione proteica in modo affidabile.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health Grant HL127711 a AVK.

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Il saggio di co-sedimentazione dell&#39;azione è una tecnica diretta che può rapidamente determinare se una proteina lega F-actina. Con alcune modifiche, la tecnica può essere utilizzata anche per misurare l&#39;affinità dell&#39;interazione. Oltre ai punti sollevati nel precedente protocollo, dovrebbero essere considerati i seguenti problemi durante la progettazione, la conduzione e l&#39;interpretazione del dosaggio. Proteina d&#39;interesse Proteine ​​appena preparate o congelate possono essere utilizzate nel dosaggio. Se si utilizzano proteine ​​congelate, si raccomanda vivamente di confrontare i risultati con proteine ​​fresche (non congelate) per garantire che il congelamento non influisca sul legame di F-actina. G-actin Source Molti esperimenti di pelleting usano G-actina isolata dal muscolo a causa della relativa abbondanza. Ci sono tre isotipi principali di actina nei mammiferi - alfa, beta e gamma - che sono notevolmente simili (&gt; 90% identi di sequenzaty). Tuttavia, esistono differenze funzionali tra gli isotipi 12 , 13 . Se possibile, l&#39;isotipo del G-actin usato nel test di associazione dovrebbe corrispondere all&#39;isotipo in vivo . Ad esempio, se la prova di una proteina espressa in muscoli scheletrici, l&#39;alpha-actina è la scelta migliore; Se esaminando una proteina espressa in fibroblasti, si consiglia l&#39;beta-actina. Uso di Phalloidin Dal momento che il falloidino lega F-actina, può interferire o addirittura bloccare il legame di alcune proteine ​​leganti F-actina ( ad es. Blocchi di phalloidin bloccare cofilin da legame ai filamenti di actina). Pertanto, il falloidino deve essere usato con cautela e i risultati rispetto ai campioni trattati non falloidini quando possibile. Alto sfondo Non è raro che le proteine ​​si sedimentino in assenza di F-actina ( Figura 1A , nessun campione di pellet F-actinaS). Tuttavia, elevati livelli di sedimentazione in background possono mascherare la co-sedimentazione reale dell&#39;azione e rendere difficile, se non impossibile, determinare se una proteina lega F-actina o misurare l&#39;affinità dell&#39;interazione. L&#39;aggiunta di polidicanol al tampone di reazione (fase 4.1) può ridurre significativamente lo sfondo e costituire una soluzione facile. Se ciò non riduce lo sfondo, può essere utile regolare il buffer di reazione, la concentrazione di sale e / o la temperatura di incubazione. Curva legante Per generare una curva di legame, è necessario variare la concentrazione della proteina di interesse o dell&#39;attin-F su una serie di reazioni. In pratica, è più facile e preferibile mantenere F-actina ad una concentrazione fissa e variare la concentrazione della proteina di interesse. Il mantenimento di F-actina ad una concentrazione fissa ( es. 2 μM) nel saggio di pelletizzazione limita la cattura non specifica a concentrazioni superiori di F-actina e previeneDepolimerizzazione a concentrazioni inferiori (&lt;0,5 μM) di F-actina. La depolimerizzazione può essere impedita usando il phalloidin, anche se questo introduce un potenziale fattore complicante nel sistema (vedere punto 3.3 e sopra). Il mantenimento di F-actina ad una concentrazione fissa consente anche di confrontare (e normalizzare) il pellet di F-actina attraverso i campioni e di individuare esperimenti falliti ( cioè, dove il pellet F-actin è altamente variabile, impedendo l&#39;analisi in concentrazioni). Infine, mantenere F-actina ad una concentrazione fissa consente di determinare se il legame al filamento dell&#39;attin è cooperativo ( Figura 1C ). Legatura satura Come in tutti gli esperimenti di legame, è fondamentale che il legame con F-actina sia saturo e che la concentrazione di proteine ​​più gli alti F-actin ( Figura 1C ). Senza un plateau, non è possibile calcolare una precisa costante di equilibrio di dissociazione. CosìÈ importante pianificare attentamente la serie di diluizione da sottoporre a test e includere sempre più alte concentrazioni di proteine ​​( cioè almeno 5- 10 volte più elevate del previsto K d ). Analisi del legame Affinché le costanti di dissociazione misurate siano conclusive, il test dovrebbe essere eseguito usando una concentrazione di actina F che consente la concentrazione di siti di legame su F-actina per la proteina di interesse essere molto più bassa dell&#39;affinità. Per verificare se questo criterio è stato raggiunto, stimare la concentrazione dei siti di legame da B max . Ad esempio, se [F-actin] era 2 μM e B max = 0,5, quindi [siti di legame] ≈ 1 μM. Il K d dovrebbe essere almeno 5-10 volte più grande di [siti di legame]. Se la misura K d è dello stesso ordine di grandezza di [siti di legame], allora è possibile che la curva di legame osservata rappresenti una titolazione di legame ad alta affinitàPiuttosto che una vera isoterma vincolante. Se ciò viene osservato, ripetere il test utilizzando una concentrazione di 10 volte più bassa di actina per misurare un&#39;affinità accurata. Per interazioni di elevata affinità, la stabilizzazione di falloidina (fase 3.3) può essere necessaria per ottenere una concentrazione di actina sufficiente a misurare con precisione l&#39;affinità. Infine, ci sono limiti fondamentali con il test di co-sedimentazione che i ricercatori dovrebbero essere consapevoli durante l&#39;esecuzione e la valutazione del dosaggio. Il più importante, il test di co-sedimentazione non produce una vera costante di equilibrio. I prodotti di legame ( cioè proteine ​​e F-actina) vengono separati dai reagenti durante la centrifugazione, dopo di che i prodotti possono dissociarsi per creare un nuovo equilibrio. Di conseguenza, il test di co-sedimentazione può erroneamente calcolare o non riescono a rilevare interazioni a bassa affinità. Poiché molte proteine ​​leganti di actina hanno una bassa affinità ( cioè, micromolare) per l&#39;F-actina, un risultato negativo ( <eM&gt; cioè nessun legame rilevabile) nel test non significa necessariamente che una proteina non lega F-actina. In alternativa, i test di associazione a filo a filamenti basati sulla microscopia TIRF sono più sensibili e più accurati per determinare una costante di dissociazione (per recensioni su questa tecnica, vedere i riferimenti 15,16 ). Nonostante queste limitazioni, il dosaggio di pelleting è all&#39;interno dei mezzi della maggior parte dei ricercatori ed è uno strumento efficace per determinare se una proteina lega F-actina e misurare l&#39;affinità dell&#39;interazione.

Actin è una proteina citoscheletrica essenziale che svolge un ruolo fondamentale nei processi cellulari multipli, tra cui la motilità, la contrazione, l&#39;adesione e la morfologia 1 . Actin esiste in due forme: actina globulare monomerica (G-actina) e actina filamentosa polimerizzata (F-actina). All&#39;interno delle cellule, l&#39;organizzazione di F-actin è controllata da una grande collezione di proteine ​​che regolano la nucleazione, la crescita, la reticolazione e lo smontaggio dei filamenti attinenti 2 , 3 , 4 . Tuttavia, come funzionano in concorrenza molteplici proteine ​​leganti di actina per regolare l&#39;organizzazione della rete di actine è ancora in gran parte poco chiara. La misurazione delle interazioni proteine-proteine ​​è un approccio importante per capire come le proteine ​​esercitano i loro effetti sul comportamento cellulare a livello biochimico. Molti test possono essere usati per rilevare le interazioni tra proteine ​​purificate.Gli approcci comuni per le proteine ​​solubili includono i pull-down, la polarizzazione di fluorescenza, la calorimetria di titolazione isoterma e la risonanza di plasmone superficiale. Importante, tutti questi dosaggi richiedono che le proteine ​​siano solubili e siano quindi difficili da adattare per l&#39;uso con una proteina polimerica, filamentosa come F-actina. Qui descriviamo una tecnica - la co-sedimentazione di actina o il comportamento di pellet, per determinare se un dominio proteico o proteico lega F-actina e misurare l&#39;affinità dell&#39;interazione. Il test di pelleting di actina è una tecnica relativamente semplice che non richiede attrezzature specializzate, oltre ad un ultracentrifuga. Tutti i reagenti possono essere realizzati assumendo la conoscenza della biochimica di base o acquistati. Una volta stabilito un legame con F-actina, il saggio può essere utilizzato per misurare l&#39;apparente affinità ( cioè la costante di equilibrio della dissociazione) 5 . Inoltre, una volta stabilita un&#39;affinità, il saggio di pelletingÈ uno strumento utile per misurare come le modifiche alla proteina di interesse ( cioè modificazioni post-traslazionali, mutazioni o legame legame) influenzino la sua interazione con F-actin 6 . La tecnica ha limitazioni (vedi Discussione ) che il ricercatore deve essere a conoscenza prima di tentare il test.

<table><tbody><tr><td>Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrifuga</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46960</td><td></td></tr><tr><td>S100-AT3 rotore</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45585</td><td></td></tr><tr><td>Provette per ultracentrifuga - 0,2 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45233</td><td></td></tr><tr><td>Actina, muscolo scheletrico di coniglio</td><td>Citoscheletro</td><td>AKL99</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino</td><td>Albumina Sigma</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>Polidicanolo (Thesit)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>88315</td><td></td></tr><tr><td>Falloidina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3457</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina trifosfato (ATP)</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Imidazolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3196</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio (MgCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>Glicole etilenico-bis(&beta;-amminoetiletere)-N,N,N',N'-acido tetraacetico (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>3779</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey CLx Sistema di imaging</td><td>LI-COR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Colorante blu R-250</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Kit di colorazione blu colloidale</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC6025</td><td></td></tr></tbody></table>

la misurazione della legame proteico con f-actina mediante co-sedimentazione

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

L&#39;organizzazione filamentosa di actina (F-actin) all&#39;interno delle cellule è regolata da un gran numero di proteine ​​legate all&#39;attinità che controllano la nucleazione, la crescita, la reticolazione e / o lo smontaggio dell&#39;attin. Questo protocollo descrive una tecnica - la co-sedimentazione di actina o il processo di pelletizzazione - per determinare se un dominio proteico o proteico lega F-actina e misurare l&#39;affinità dell&#39;interazione ( cioè la costante di equilibrio della dissociazione). In questa tecnica, una proteina di interesse viene prima incubata con F-actina in soluzione. Successivamente, la centrifugazione differenziale viene usata per sedimentare i filamenti di actina e il materiale pelletato viene analizzato mediante SDS-PAGE. Se la proteina di interesse lega F-actina, co-sedimenti con i filamenti di actina. I prodotti della reazione di legame ( cioè F-actina e la proteina di interesse) possono essere quantificati per determinare l&#39;affinità dell&#39;interazione. Il test di pelleting di actina è una tecnica diretta per determinareSe una proteina di interesse lega F-actina e per valutare come le modifiche a quella proteina, come il binding del ligando, influenzano la sua interazione con F-actina.

Abbiamo esaminato l&#39;associazione dell&#39;omodimero di αE-catenina all&#39;actin F nel test di co-sedimentazione. Dato che gli esperimenti passati hanno dimostrato che l&#39;affinità dell&#39;omodimero αE-catenina per F-actina è di circa 1 μM e il B max vicino a 11 , abbiamo eseguito il saggio con una bassa concentrazione di F-actina (0,2 μM piuttosto che 2 μM; la discussione). Poiché 0,2 μM è al di sotto della concentrazione critica, è stato aggiunto il falloidina per stabilizzare l&#39;actina F-polimerizzata dal muscolo scheletrico G-actina (fase 3.3). Aumento delle concentrazioni di homodimer αE-catenina (0,125-12,0 μM) sono state incubate in presenza o in assenza di 0,2 μM di F-actina. I campioni sono stati centrifugati e le pellicole risultanti sono state analizzate ( figura 1A ). Come previsto, l&#39;omodimero αE-catenina co-sedimentato con F-actina sopra lo sfondo ( Figura 1A , confrontare i campioni di pellet F-actin con il no-F-acCampioni di pellets di stagno). BSA è stato eseguito come un controllo negativo ( Figura 1B ). La proteina legata è stata quantificata e tracciata su proteine ​​libere per calcolare l&#39;affinità dell&#39;interazione ( Figura 1C ). I dati grafici mostrano meglio l&#39;equazione di Hill. La K d calcolata era 2.9 μM, il B max era 0.2 e il coefficiente Hill (h) era 4.8. Così, l&#39;omodimero αE catenina lega F-actina in cooperativa con una bassa affinità micromolare, coerente con il precedente lavoro (Kd di 2,9 μM rispetto a ~ 1,0 μM) 11 . <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig1.jpg" /> Figura 1: Saggio di co-sedimentazione ad alta velocità di F-actina. ( A ) Concentrazioni aumentanti (0,125-12,0 μM) di homodimero αE-catenina sono state incubate con (pannelli sinistri) o senza (pannelli destro) 0,2 μM F-actina stabilizzata con phalloidin. Sono stati incubati per 30 minuti a RT e centrifugati. Il totale (7,5% del materiale di partenza) e il materiale pelletato (50% del materiale pelletato) sono stati separati da SDS-PAGE e macchiati con colorante Coomassie. ( B ) 4 μM BSA è stato eseguito come un controllo negativo. I campioni totali e di pellet, con (+) o senza (-) F-actina, sono stati separati da SDS-PAGE e colorati con colorante Coomassie. ( C ) La lega αE-catenina (μM / μM actina) da A è stata plottata contro la catenina αE libera (μM) ei dati sono adatti ad un&#39;equazione della collina (linea rossa). Sono elencati i coefficienti K d , B max e Hill (h). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig2.jpg" /> Figura 2: Quantificazione di pellet di Actin </sTrong&gt; - diagramma di flusso. Questo schema descrive i punti chiave nella sezione 5, con esempi di campioni di Total e Pellet ( A , CE ) e la curva standard ( B ) utilizzata per la quantificazione. 5.13 passi: 1 ) Misura la quantità di proteine ​​di interesse nei campioni totali (A). 2 ) Generare una curva standard plottando l&#39;intensità della banda rispetto alla massa proteica (B). 3 ) Misurare la quantità di proteine ​​di interesse che co-sedimentate con F-actin ( C ). 4 ) Misurare la quantità di proteine ​​di interesse che vengono pelletate in assenza di F-actina ( D ). 5 ) Sottrai D da C per determinare la quantità di proteina legata all&#39;Actin F. 6 ) Misurare la quantità di F-actina in ogni pellet (E), calcolare la quantità media di F-actina per campione e dividere ogni campione per la media (i numeri riportati di seguito mostrano il rapporto). 7 )Per ogni campione, dividere la quantità di proteina legata (calcolata nella fase 5) dal rapporto di pellet F-actin (calcolato al punto 6) per regolare le differenze nel pellet. 8 ) Utilizzare la curva standard ( B ) per calcolare la quantità (massa) della proteina legata normalizzata in ciascun campione (passo 7). 9 ) Determinare la concentrazione di proteine ​​libere e proteine ​​legate per creare una curva di legame. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questo protocollo descrive un metodo per testare la capacità di una proteina a co-sedimentare con l&#39;actina filamentosa (F-actina) e, se si osserva il legame, per misurare l&#39;affinità dell&#39;interazione.

La misurazione della legame proteico con F-actina mediante co-sedimentazione

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

L'obiettivo generale di questa tecnica è verificare la capacità di una proteina di co-sedimentare con l'actina filamentosa e, qualora venga osservata un'interazione, misurare l'affinità di tale legame. Questo metodo rappresenta una tecnica semplice per determinare se una proteina si lega all'actina F. I vantaggi di questa tecnica sono che non richiede attrezzature specializzate, a parte un ultracentrifugo, e tutti i reagenti possono essere preparati o acquistati.Per iniziare, preparare una proteina ad alta purezza come descritto nel protocollo testuale. Determinare la concentrazione proteica misurando l'assorbanza a 280 nanometri. Poco prima dell'uso, eseguire una centrifugazione ad alta velocità della proteina per rimuovere gli aggregati di proteina insolubile.Se la solubilità è un problema, misurare nuovamente la concentrazione proteica dopo la centrifugazione. Successivamente, prelevare un'aliquote di actina globulare o g-actina dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e scongelarla rapidamente. Aggiungere il buffer di polimerizzazione 10X alla G-actina e diluire fino a una concentrazione finale di 1X con acqua.Incubare la miscela per un'ora a temperatura ambiente per consentire la polimerizzazione dell'actina. Dopo la polimerizzazione, conservare l'actina filamentosa polimerizzata, o F-actina, in soluzione a quattro gradi Celsius, dove rimarrà stabile per alcune settimane. Prima di utilizzare l'F-actina dopo la conservazione, capovolgere delicatamente o scuotere il tubo più volte per assicurarsi che tutta l'actina sia disciolta e uniformemente distribuita in soluzione.Stabilire il legame della proteina di interesse con l'F-actina come descritto nel protocollo testuale. Una volta stabilito il legame con l'F-actina, diluire in serie la proteina per ottenere una serie di concentrazioni composta da sette a otto campioni a due volte la concentrazione finale da testare. Ad esempio, se l'intervallo da testare è compreso tra 0,1 e otto micromolar, preparare diluizioni di 16, otto, quattro, due, uno, 0,5 e 0,2 micromolar di proteina in tampone di reazione 1X in provette per microcentrifuga.Diluire la proteina di interesse alla concentrazione finale in tampone di reazione 1X in provette per ultracentrifuga. Aggiungere l'F-actina ai campioni appropriati. Successivamente, incubare tutti i campioni per 30 minuti a temperatura ambiente.Dopo 30 minuti, prelevare un quinto di ciascun campione e mescolarlo con il buffer del campione. Questi sono i campioni totali. Caricare i tubi del campione per ultracentrifuga nel rotore e centrifugare per 20 minuti a 100.000 ×g e a quattro gradi Celsius.Dopo la centrifugazione, rimuovere i tre quarti del soprannatante da ogni provetta e mescolare con un buffer campione 4X in una provetta microcentrifuga separata. Questi sono i campioni di soprannatante. Rimuovere il soprannatante rimanente con una punta per caricamento su gel, avendo cura di non disturbare il pellet.Quindi aggiungere tampone per campione 1X a tutti i tubi e incubare per almeno cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, triturare il campione da otto a dieci volte con una punta per pipetta p200, lavando continuamente la zona del pellet nel tubo. Scrape leggermente la punta della pipetta sul pellet durante la triturazione per favorire la risospensione.Trasferire la proteina ri-sospesa in una provetta da microcentrifuga. Questi sono i campioni del pellet. Infine, analizzare i campioni totali e quelli del pellet mediante elettroforesi SDS-PAGE.Acquisire le immagini dei gel colorati con coomassio utilizzando un sistema di imaging in grado di misurare le intensità delle bande proteiche su un ampio intervallo lineare. Concentrazioni crescenti di omodimero di alfa-e catenina sono state incubate in presenza o assenza di 0,2 micromolare di F-actina. I campioni sono stati centrifugati e i pellet ottenuti sono stati analizzati.Come previsto, l'omodimero di alfa e catenina ha co-sedimentato con l'F-actina al di sopra del valore di fondo. L'albumina sierica bovina (BSA) è stata utilizzata come controllo negativo. La proteina legata è stata quantificata e riportata in grafico rispetto alla proteina libera per calcolare l'affinità dell'interazione.Questa tecnica può essere eseguita in quattro ore o meno, a condizione che l'F-actina sia già polimerizzata. Durante il tentativo di questa procedura, è fondamentale rimuovere rapidamente il sopranatante dopo la centrifugazione e risospendere completamente il pellet. Come in tutti gli esperimenti di legame, è essenziale che il legame all'F-actina sia saturo e che la purezza e l'F-actina raggiungano un plateau; in assenza di un plateau, non è possibile calcolare una costante di equilibrio di associazione accurata.Esistono limitazioni fondamentali del saggio di co-sedimentazione di cui i ricercatori dovrebbero essere a conoscenza; in particolare, questo saggio non produce una vera costante di equilibrio e, di conseguenza, può calcolare in modo errato o non rilevare interazioni a bassa affinità. Nonostante queste limitazioni, il saggio di co-sedimentazione rappresenta uno strumento accessibile ed efficace per determinare se una proteina si lega all'F-actina e per misurare l'affinità dell'interazione.

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Proteine ​​si legano l'actina filamentosa (F-actina) attraverso i moduli di legame actina. In questo video ci dimostra la procedura di actina co-sedimentazione, che è un test in vitro solitamente usata per analizzare le proteine ​​o domini specifici che legano la F-actina.

Actina Co-sedimentazione di analisi, per l&#39;Analisi del Binding Protein a F-Actina

Noi applichiamo un'etichetta priva di analisi di interazioni proteina utilizzando X100 Biacore per la struttura-funzione di analisi del legame di mutanti diversi cistatina B di papaina attraverso la caratterizzazione cinetica. Calibrazione senza analisi concentrazione (ACCP) misura la concentrazione di proteine ​​con attività di legame mantenuto senza la necessità di una curva standard. Abbiamo dimostrato che la conferma delle concentrazioni utilizzando ACCP aumenta l'affidabilità delle analisi...

L&#39;importanza della concentrazione della proteina corretta per Cinetica e determinazione affinità nella struttura-funzione di analisi

In questo video, descriviamo la tecnica dell'anisotropia a fluorescenza per studiare le interazioni tra la proteina della sindrome di Shwachman-diamond (SBDS) marcata con fluorofori e la 1 GTPasi simile al fattore di allungamento (EFL1). All'incubazione di proteine SBDS con concentrazioni gradualmente crescenti di EFL1, si osserva un costante aumento dell'anisotropia, indicando una riuscita interazione tra le due proteine.

Rilevamento basato sull'anisotropia della fluorescenza delle interazioni proteina-proteina

Polimerizzazione di FtsZ è essenziale per la divisione cellulare batterica. In questo rapporto, dettaglio semplici protocolli per monitorare l'attività di polimerizzazione FtsZ e discutere l'influenza della composizione del tampone. I protocolli possono essere usati per studiare l'interazione di FtsZ con proteine ​​regolatrici o farmaci antibatterici che influiscono FtsZ polimerizzazione.

FtsZ polimerizzazione saggi: protocolli semplici e considerazioni

Questo protocollo confronta le affinità relative dei partner di legame per le GTPasi della famiglia Rho, incluso Rac1. In vivo, le proteine leganti Rac1 competono per una singola interfaccia di legame, la cui conformazione è dettata da un nucleotide legato. Il nucleotide è importante e difficile da controllare sperimentalmente, a causa dell'alto tasso di idrolisi.

Confrontando l&#39;affinità delle proteine-GTPasi legame con saggi Concorso

interazioni proteina sono al centro della funzione di una cellula. tecniche calorimetriche e spettroscopiche sono comunemente usati per caratterizzare loro. Qui si descrive anisotropia di fluorescenza come strumento per studiare l'interazione tra la proteina mutata nella sindrome di Shwachman-Diamond (SBDS) e il fattore di allungamento-simile 1 GTPase (EFL1).

Anisotropia di fluorescenza come strumento per studiare le interazioni proteina-proteina

Presentiamo un metodo che combina la purificazione delle proteine della membrana e la ricostituzione in peptidi in un'unica fase cromatografica. Gli scaffold biotinylati vengono utilizzati per l'attaccamento diretto della superficie e la misurazione delle interazioni proteina-ligando tramite interferometria biostrato.

PeptiQuick, un'incorporazione in un solo passaggio di proteine membrana in Peptidiscbio biotinylated per analisi di legame proteico semplificato

Questo protocollo descrive la formazione di doppi strati lipidici supportati e l'aggiunta di filamenti citoscheletrici e proteine motorie per studiare la dinamica delle reti citoscheletriche ricostituite e legate alla membrana utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Ricostituzione di cortecce di actina minima legate alla membrana su doppi strati lipidici supportati

Questo protocollo descrive come produrre comete di actina sulle superfici delle perle utilizzando ingredienti proteici disponibili in commercio. Tali sistemi imitano le strutture protrusive presenti nelle cellule e possono essere utilizzati per esaminare i meccanismi fisiologici della produzione di forza in modo semplificato.

Ricostituzione della motilità a base di actina con proteine disponibili in commercio

Questo metodo descrive un saggio di sedimentazione in vitro basato sulla lectina per quantificare l'affinità di legame della fosfatasi glucana e dell'amilopectina. Questo saggio di co-sedimentazione è affidabile per misurare il legame del substrato della glucanofosfatasi e può essere applicato a vari substrati di glucano solubilizzati.

Saggio di sedimentazione basato sulla concanavalina A per misurare il legame del substrato delle fosfatasi glucane

È stato dimostrato che molte proteine intrinsecamente disordinate partecipano alla formazione di condensati biomolecolari altamente dinamici, un comportamento importante per numerosi processi cellulari. Qui, presentiamo un metodo basato sull'imaging a singola molecola per quantificare le dinamiche con cui le proteine interagiscono tra loro nei condensati biomolecolari nelle cellule vive.

Misura a singola molecola delle dinamiche di interazione proteica all'interno di condensati biomolecolari

Scopri il saggio di co-sedimentazione per misurare l'affinità di legame tra proteine e F-actina. Questo metodo biochimico utilizza ultracentrifuga e SDS-PAGE per quantificare l'interazione proteica in modo affidabile.

La misurazione della legame proteico con F-actina mediante co-sedimentazione

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