Un metodo integrato per l'analisi della chimotassi rapida dei neutrofili direttamente da una goccia di sangue

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare un metodo per separare i neutrofili da una goccia di sangue intero e quindi eseguire un successivo test di chemiotassi utilizzando un singolo dispositivo microfluidico. Questo metodo fornisce il nostro codice per eseguire un test di chemiotassi dei neutrofili utilizzando un piccolo volume di sangue intero. E può essere facilmente applicato dai ricercatori per rispondere a domande biologiche relative alla migrazione delle cellule immunitarie.

Il vantaggio principale di questa tecnica è l'integrazione e il nostro test di chemiotassi su un singolo dispositivo microfluidico. Ciò consente l'assemblaggio e l'analisi in 25 minuti. Per iniziare, prepara il master maldus descritto nel protocollo di testo allegato.

Quindi silanizzare la superficie dello stampo SU8 per facilitare il rilascio del PDMS dallo stampo. Quindi, mescolare 40 grammi di base PDMS e quattro grammi di agente di trasporto in un becher di plastica. Posizionare lo stampo master SU8 preparato in una capsula di Petri e versare con cura la soluzione PDMS miscelata sullo stampo.

Mettere la capsula di Petri in un essiccatore e applicare un vuoto per degassare la soluzione PDMS per 20 minuti. Quindi, metti la capsula di Petri in un forno e polimerizza il PDMS a 80 gradi Celsius per due ore. Dopo la cottura, tagliare e staccare con cura la lastra PDMS dallo stampo SU8.

Tagliare la soletta PDMS per separarla in singoli dispositivi. Tagliare il dispositivo PDMS per creare due pareti attorno alla porta di caricamento delle celle per contenere i magneti. Quindi, perforare la porta di caricamento delle celle utilizzando un perforatore di tre millimetri di diametro.

Quindi, passare a un punzone da sei millimetri e rimuovere i serbatoi di ingresso della sostanza chimica nell'uscita dei rifiuti. Utilizzando un pezzo di nastro adesivo, rimuovere la polvere sulla superficie della lastra PDMS. Posizionare la lastra pulita in un vetrino pulito nella macchina al plasma.

Applicare l'aspirapolvere per tre minuti. E poi accendi l'alimentazione al plasma e imposta il livello su alto. Regolare delicatamente la valvola dell'aria e trattare al plasma il PDMS e il vetrino per tre minuti.

Al termine, spegnere l'alimentazione al plasma e rilasciare l'aspirapolvere. Estrarre con cautela la lastra PDMS nel vetrino utilizzando una pinzetta, posizionare immediatamente la lastra PDMS sopra il vetrino, con le strutture dei canali rivolte verso il basso, premere delicatamente la lastra PDMS per legarla al vetro e quindi riempire immediatamente il canale microfluidico con acqua deionizzata. I PDMS sono stati generalmente premuti sul substrato di vetro per evitare che il pozzetto entri nel canale barriera.

Rimuovere l'acqua deionizzata dal dispositivo e aggiungere 100 microlitri di soluzione di Fribronectina dalla presa. Attendere tre minuti per assicurarsi che tutti i canali siano riempiti con una soluzione di fibronectina. Quindi, incubare il dispositivo in una capsula di Petri coperta per un'ora a temperatura ambiente.

Quindi, rimuovere la soluzione di fibronectina dal dispositivo e aggiungere 100 microlitri di terreno di migrazione dalla presa. Ancora una volta, attendere tre minuti per assicurarsi che tutti i canali siano riempiti con il mezzo di migrazione. Incubare il dispositivo per un'altra ora a temperatura ambiente prima di utilizzare il dispositivo nell'esperimento di chemiotassi.

Metti dieci microlitri di sangue intero in una provetta da 1,5 millilitri. Quindi, aggiungi due microlitri del cocktail di anticorpi. E due microlitri di particelle magnetiche da un kit di isolamento dei neutrofili e mescolare delicatamente il tubo per marcare magneticamente le cellule marcate con anticorpi.

Incubare la miscela dell'etichetta per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, collegare due piccoli dischi magnetici ai due lati della porta di caricamento della cella del dispositivo. Aspirare il fluido da tutte le porte del dispositivo.

Quindi, pipettare lentamente due microlitri della miscela di sangue marcata nel dispositivo microfluidico dalla porta di caricamento delle cellule. Posizionare il dispositivo microfluidico sul tavolino del microscopio a temperatura controllata a 37 gradi Celsius. Attendere qualche minuto fino a quando un numero sufficiente di neutrofili non è intrappolato nell'area di aggancio delle cellule.

Quindi, aggiungere 100 microlitri della soluzione chemioattrattiva e 100 microlitri di terreno di migrazione ai serbatoi di ingresso designati utilizzando due pipettatori. Ciò genererà un gradiente chemioattrattivo mediante miscelazione chimica a flusso laminare continuo. Il chemioattrattivo può essere costituito da proteine ricombinanti come la FMLP o da un campione clinico come il surnatante dell'espettorato di pazienti con BPCO.

Una volta che il flusso si è stabilizzato, acquisire immagini a fluorescenza del gradiente di destrano FitZ nel canale. Quindi, incubare il dispositivo sul tavolino del microscopio a temperatura controllata o in un incubatore per colture cellulari convenzionale per 15 minuti. Dopo l'incubazione, è possibile visualizzare il canale del gradiente utilizzando un obiettivo dieci volte per registrare le posizioni finali della cellula per l'analisi dei dati.

I neutrofili vengono selezionati negativamente da una goccia di sangue intero direttamente nel dispositivo microfluidico utilizzando la marcatura degli anticorpi con particelle magnetiche e una coppia di magneti. Al fine di confermare la purezza dei neutrofili isolati su chip, è stata eseguita la colorazione Giemsa. I risultati mostrano i tipici nuclei a forma di anello e a forma di lobo dei neutrofili.

Dopo il caricamento delle celle, la struttura di aggancio allinea efficacemente le celle accanto al canale del gradiente prima di applicare un gradiente chimico. Se esposto a un gradiente chimico per 15 minuti, si verifica la chemiotassi. E può essere misurato utilizzando l'imaging.

Questi risultati mostrano che dopo 15 minuti, poche cellule sono strisciate attraverso il canale barriera nel campione controllato al terreno. Al contrario, molti neutrofili si sono spostati rapidamente attraverso il canale barriera e sono migrati verso un gradiente FMLP a 100 nanomolari. Una volta che questo può spedire la chemiotassi direttamente dal nostro in 25 minuti.

Questo offre uno strumento utile ai ricercatori per studiare i meccanismi della migrazione dell'intera cellula. E uno strumento per applicazioni cliniche.