Name: Un metodo integrato per lanalisi della chimotassi rapida dei neutrofili direttamente da una goccia di sangue (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Impara un metodo rapido per isolare i neutrofili da una goccia di sangue intero e analizzarne la chimotassi con un unico dispositivo microfluidico. Questa tecnica consente risultati in soli 25 minuti, semplificando lo studio della migrazione cellulare.

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Questo lavoro è in parte sostenuto da sovvenzioni del Consiglio scientifico delle scienze naturali e ingegneria del Canada (NSERC) e dell&#39;Istituto canadese di ricerca sulla salute (CIHR). Ringraziamo l&#39;Istituto Clinico per la Ricerca Applicata e l&#39;Educazione presso l&#39;Ospedale Generale Victoria di Winnipeg e il Sette Oaks General Hospital di Winnipeg per la gestione di campioni clinici da soggetti umani. Ringraziamo il dottor Hagit Peretz-Soroka per una utile discussione sulle strategie di funzionamento del dosaggio. <style type="text/css">
</style> Ringraziamo il professor Carolyn Ren e il dottor Xiaoming (Cody) Chen dell&#39;università di Waterloo per il loro generoso sostegno nel processo di ripresa.

Tutti i protocolli per la raccolta di campioni umani sono stati approvati dal Board of Ethics per la Ricerca congiunta presso l&#39;Università di Manitoba, Winnipeg. 1. Fabbricazione del dispositivo microfluidico ( Figura 1A ) <ol><li> Maschera di trasparenza di progettazione e stampa. <ol><li> Disegnare il dispositivo come descritto in precedenza 25 . Vedere la Figura 1A . NOTA: Il dispositivo include due livelli. Il primo strato (alto 4 μm) definisce il canale della barriera di ancoraggio cellulare per intrappolare le cellule accanto al canale di gradiente. Il secondo strato (alto 60 μm) definisce il canale di generazione del gradiente, la porta e il canale per il caricamento delle celle, i serbatoi di ingresso chimico e la presa di scarico. I segni di allineamento sono progettati per i due strati. Per il secondo strato, la lunghezza e la larghezza del canale d&#39;ingresso serpentino a monte sono rispettivamente di 60 mm e 200 μm; La lunghezza e la larghezza della valleIl canale di ingresso serpentino è rispettivamente di 6 mm e 280 μm. </li><li> Stampare le funzioni di primo e secondo livello a una maschera di trasparenza utilizzando una stampante ad alta risoluzione. NOTA: la risoluzione di stampa dipende dalle caratteristiche minime del disegno. Nell&#39;attuale disegno, 32.000 dpi è stato scelto per la funzionalità minima di 10 μm. </li></ol></li><li> Pulire il wafer di silicio. <ol><li> Mettere un wafer in silicone da 3 pollici nel pulitore al plasma. Applicare vuoto per 3 min. </li><li> Accendere la potenza del plasma e impostare il livello su HIGH. Utilizzare il plasma ad ossigeno per trattare il wafer di silicio per 30 min. </li><li> Spegnere il pulitore del plasma e togliere il wafer di silicio; Il wafer di silicio è pronto per la fabbricazione dello stampo del dispositivo. </li></ol></li><li> Fabbricare il primo strato con fotolitografia in un impianto di stanza pulita. NOTA: i parametri di fabbricazione esatti possono variare a seconda della struttura di fabbricazione. <ol><li> Diluire 10 mL SU-8 2025 con 10 mL SU-8 2000 in un interruttore di vetro per preparare il fotoresist progettato. Lasciare la miscela nel cappuccio per 10 minuti fino a scomparire le bolle. </li><li> Posizionare con cautela il wafer di silicio pulito sul filatore con l&#39;apposito mandrino e applicare il vuoto per immobilizzare il wafer di silicio. </li><li> Spalmare con cautela 3 ml della miscela fotoresistiva al centro del wafer di silicio. Spin a 500 rpm per 5 s. Poi ruotare a 3.000 giri / min per 30 s per ottenere un rivestimento fotoresistivo di spessore finale di 4 μm sul wafer di silicio. </li><li> Rimuovere con cautela il wafer di silicio dal filatore e cuocere la cialda di silicio su una piastra per 4 minuti a 95 ° C. </li><li> Posizionare con cautela il wafer di silicio su un allineatore di maschera e impostare il tempo di esposizione UV a 6 s. Attaccare con cautela la maschera trasparente del primo strato su una lastra di vetro trasparente con nastro adesivo. </li><li> Posizionare delicatamente la lastra di vetro trasparente con la maschera allegata all&#39;allineatore e allineare la maschera con il wafer di silicio. Esporre il siWafer wafer al UV per modellare la struttura di docking cellulare. </li><li> Rimuovere con cautela la lastra di vetro e togliere il wafer di silicio esposto. Cuocere la cialda di silicio su una piastra per 4 minuti a 95 ° C. </li><li> Trasferire il wafer di silicio ad un cappuccio e collocarlo in una padella contenente lo sviluppatore SU-8. Scuotere delicatamente questo per 30 s. </li><li> Pulire la cialda di silicio usando lo sviluppatore SU-8 fresco seguito da alcool isopropilico (IPA) all&#39;interno della cappa aspirante. Asciugare il wafer di silicio con il gas di azoto all&#39;interno del cappuccio; Il primo strato è pronto. </li></ol></li><li> Fabbricare il secondo strato sul primo strato. <ol><li> Utilizzare nastro adesivo per coprire i segni di allineamento sul primo strato. Posizionare con cautela il wafer di silicio con il primo strato sul mandrino a vuoto del filatore e applicare il vuoto per immobilizzare il wafer di silicio. </li><li> Versare 3 mL di fotoresistore SU-8 2025 sul wafer di silicio. Spin la fetta di silicio a 500 rpm per 5 s. Poi ruotare a 2000 giri / min per 30S per ottenere un finale di 60 μm di spessore del fotoresist sul wafer di silicio. </li><li> Rimuovere con cautela il wafer di silicio dal filatore e trasferirlo in una piastra di cottura; Cuocere a 65 ° C per 2 min. </li><li> Rimuovere delicatamente il nastro adesivo per esporre i contrassegni di allineamento sul primo strato. Mettere il wafer di silicio su una piastra di cottura e cuocere a 95 ° C per 6 minuti. </li><li> Posizionare con cautela il wafer di silicio su un allineatore di maschera e impostare il tempo di esposizione UV a 18 s. </li><li> Attaccare con cautela la maschera trasparente del secondo strato su una lastra di vetro trasparente con nastro adesivo. </li><li> Posizionare con cura la lastra di vetro con la maschera allegata all&#39;allineatore e allineare la maschera e il primo strato sul wafer di silicio dai contrassegni di allineamento utilizzando il microscopio di ispezione dell&#39;allineatore. </li><li> Esporre il wafer di silicio rivestito con fotoresist a UV per modellare i canali di caricamento e canale di gradiente. </li><li> Rimuovere con cautela la lastra di vetro e togliere il silicio wafer. Cuocere il wafer di silicio su una piastra a 65 ° C per 2 minuti e trasferire il wafer di silicio ad un&#39;altra piastra calda di 95 ° C e cuocere per 6 minuti. </li><li> Trasferire il wafer di silicio alla cappa e metterlo in una padella contenente lo sviluppatore SU-8. Scuotere delicatamente questo per 6 min. </li><li> Pulire la fetta di silicio usando lo sviluppatore SU-8 fresco seguito da IPA all&#39;interno della cappa. </li><li> Asciugare il wafer di silicio usando gas di azoto all&#39;interno della cappa di fumo. Posizionare il wafer di silicio su una piastra di cottura e cuocere a forno il muffa a 150 ° C per 30 minuti; Il secondo livello è pronto. </li></ol></li><li> Modifica della superficie della muffa. NOTA: Una fase di modifica della superficie di silanizzazione viene applicata allo stampo SU-8 per facilitare lo rilascio di polidimetilsilossano (PDMS) dallo stampo in soft litografia. <ol><li> Prendere 10 μl di soluzione di tridecafluoro-1,1,2,2-tetraidroctil (trichlorosilano) in una punta di micropipetta. Mettere la punta della micropipetta in un tubo di plastica da 15 ml aLo allentare il tappo del tubo. </li><li> Posizionare il tubo e il wafer di silicio modellato SU-8 all&#39;interno di un essiccatore e applicare il vuoto per 1 h; Lo stampo per maschere è pronto per la fabbricazione del dispositivo PDMS. </li></ol></li><li> Fabbricare il dispositivo PDMS. <ol><li> Preparare la soluzione PDMS mescolando 40 g di base PDMS e 4 g di agente di tintura in un bicchiere di plastica. Posizionare lo stampo masterizzato SU-8 in un piatto di Petri e versare accuratamente 44 g di soluzione PDMS sulla muffa. </li><li> Posizionare il piatto di Petri in un essiccatore e applicare il vuoto per degas la soluzione PDMS per 20 minuti. Quindi posizionare il piatto di Petri in un forno e curare il PDMS a 80 ° C per 2 ore. </li><li> Dopo la cottura, togliere il piatto di Petri e metterlo su una panca pulita. Tagliare con cura e scollegare la lastra PDMS dallo stampo SU-8. </li><li> Estrarre la porta di carico della cella usando un puncher di diametro di 3 mm. Estrarre i serbatoi di raccolta chimica e la presa di scarico utilizzando un punzone di diametro di 6 mm. </li><li> Rimuovere la polvere sullaSuperficie della lastra PDMS con nastro adesivo. Posizionare la lastra PDMS e una lastra di vetro pulita nella macchina al plasma. Applicare il vuoto per 3 minuti. </li><li> Accendere la potenza del plasma e impostare il livello su HIGH. Regolare delicatamente la valvola d&#39;aria e plasmatreat la lastra PDMS e la lastra di vetro per 3 min. </li><li> Spegnere il plasma e rilasciare il vuoto. Estrarre attentamente la lastra PDMS e il vetrino in vetro utilizzando le pinzette. </li><li> Posizionare immediatamente la lastra PDMS (con strutture di canale a faccia in giù) in cima alla vetrata; Premere delicatamente la lastra PDMS per legare al vetro. Riempire subito il canale microfluidico con acqua deionizzata; La fabbricazione e l&#39;assemblaggio del dispositivo microfluidico sono completati. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione del saggio di migrazione microfluidica cellulare <ol><li> Preparazione del dispositivo microfluidico. <ol><li> Preparare una soluzione di fibronectina da 50 μg / mL diluendo 50 μL di soluzione di fibronectina di riserva (1 mg / ml) a 95081; L Dulbecco&#39;s fosfato-tamponato salina (DPBS) all&#39;interno di un armadio di biosicurezza. </li><li> Preparare il mezzo di migrazione mescolando 9 ml di media Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) e 1 ml di RPMI-1640 con 4% di albumina bovina del siero (BSA). </li><li> Rimuovere l&#39;acqua deionizzata dal dispositivo. </li><li> Aggiungere 100 μL di soluzione fibronectina al dispositivo dalla presa. Attendere 3 min per assicurare che tutti i canali siano riempiti di soluzione fibronectina. Mettere il dispositivo microfluidico in un piatto di Petri coperto per 1 h a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere la soluzione fibronectina dal dispositivo. Aggiungere 100 μL di media di migrazione dalla presa. Attendere 3 min per assicurarsi che tutti i canali siano pieni di supporto di migrazione. </li><li> Incubare il dispositivo per altri 1 h a temperatura ambiente; Il dispositivo è quindi pronto per l&#39;esperimento di chemotaxis. </li></ol></li><li> Preparazione della soluzione di chemoattractant per l&#39;esperimento di chemotaxis. <ol><li> Preparare la soluzione fMLP da 100 nM in t1 ml di media di migrazione. Mescolare 5 μL di FITC-Dextran (10 kDa, 1 mM) con la soluzione fMLP in un tubo da 1,5 ml. NOTA: FITC-Dextran viene utilizzato per la misurazione del gradiente. In alternativa, utilizzare Rhodamine come indicatore di gradiente. La soluzione chemoattractant di fMLP è quindi pronta per l&#39;esperimento di chemotaxis. </li></ol></li><li> Preparazione del campione di sputum. NOTA: La chimotassi neutrofila indotta da un gradiente di campioni di sputum provenienti da pazienti affetti da BPCO è stata testata come un&#39;applicazione diagnostica clinica di questo metodo completo su chip. <ol><li> Ottenere un protocollo di etica umana per raccogliere campioni di espettorato dai pazienti con BPCO. NOTA: Abbiamo ottenuto le approvazioni per raccogliere campioni presso il Seven Oaks General Hospital di Winnipeg (approvato dall&#39;Università di Manitoba). </li><li> Ottieni i moduli informativi di consenso scritti da tutti i soggetti. </li><li> Raccogli i campioni spontanei dello spiedo dei pazienti con BPCO. Posizionare 500 μl di campione di sputo in un tubo da 1,5 ml. </li><li> Aggiungere 500 μL di 0,1% diTiotreitolo nel tubo da 1,5 ml e mescolare delicatamente. Mettere il tubo in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 15 minuti. </li><li> Centrifugare il campione a 753 xg per 10 minuti e quindi raccogliere il surnatante. Centrifugare il supernatante a 865 xg per 5 minuti e quindi raccogliere il supernatante finale. Conservare il supernatante raccolto all&#39;interno di un congelatore da -80 ° C prima dell&#39;uso. </li><li> Quando è pronto per l&#39;esperimento di chimotassi, scongelare la soluzione di espettorato; Trasferire il campione di migrazione di 900 μL in un tubo da 1,5 ml e mescolare con 100 μl di sputtino all&#39;interno di un armadio di biosicurezza; La soluzione per l&#39;espettorato è quindi pronta per l&#39;esperimento della chimotassi. </li></ol></li><li> Raccolta di campioni di sangue. <ol><li> Ottenere un protocollo etico umano per raccogliere campioni di sangue da donatori sani. Ottieni i moduli informativi di consenso scritti da tutti i donatori di sangue. NOTA: qui i campioni sono stati ottenuti presso l&#39;Ospedale Generale Victoria di Winnipeg (approvato dal Joint Board-Ethics Board all&#39;Università di Manitoba). </li><li> Raccogliere il campione di sangue per venipuncture e mettere il campione in un tubo rivestito con EDTA. Tenere il tubo in un armadio di biosicurezza prima dell&#39;esperimento. </li></ol></li></ol> 3. Operazione di analisi chimotassi su chip completa <ol><li> Isolamento delle celle su chip ( figura 1B ). <ol><li> Mettere 10 μL di sangue intero in un tubo da 1,5 ml all&#39;interno di un armadio di biosicurezza. NOTA: i dettagli della raccolta dei campioni di sangue sono riportati nella sezione 2.4. </li><li> Aggiungere 2 μL di anticorpi (Ab) e 2 μL di particelle magnetiche (MP) dal kit di isolamento dei neutrofili (vedere tabella dei materiali) nel tubo da 1,5 ml e mescolare delicatamente; Questo etichetta le cellule nel sangue tranne i neutrofili. </li><li> Incubare la miscela sangue-Ab-MP per 5 min a temperatura ambiente. NOTA: Questo taglierà magneticamente le cellule contrassegnate con anticorpi nel sangue. </li><li> Collegare due piccoli dischi magnetici ai due lati del caricamento della cella pOrt del dispositivo. Aspirare il supporto da tutte le porte del dispositivo. </li><li> Lentamente pipettare 2 μL di sangue-Ab-MP miscela nel dispositivo microfluidico dalla porta di carico della cella. NOTA: le celle con etichetta magnetica sono intrappolate alle pareti laterali della porta di caricamento delle celle mentre i neutrofili entreranno nel dispositivo e saranno intrappolati nella struttura di ancoraggio delle celle. </li><li> Attendere qualche minuto fino a quando i neutrofili abbastanza sono intrappolati nell&#39;area di ancoraggio della cella. </li></ol></li><li> Analisi chimotaxis ( Figura 1C ). <ol><li> Posizionare il dispositivo microfluidico sulla fase a microscopio a temperatura controllata a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 100 μL di soluzione di chemoattractant (fMLP o soluzione di espettorato) e 100 μL di mezzi di migrazione ai loro serbatoi d&#39;ingresso designati utilizzando due pipettatori; Questo genera un gradiente chemoattrattante nel canale di gradiente mediante miscela chimica continua a flusso laminare assistita da un pressurStruttura di equilibratura. NOTA: i dettagli della raccolta dello sputo da pazienti con BPCO sono riportati nella sezione 2.3. <ol><li> Per l&#39;esperimento di controllo medio, aggiungere solo il mezzo di migrazione a entrambi i serbatoi d&#39;ingresso. </li></ol></li><li> Acquisire l&#39;immagine di fluorescenza di FITC-Dextran nel canale di gradiente. </li><li> Importare l&#39;immagine al software ImageJ utilizzando il comando &quot;File | Apri&quot;. </li><li> Misurare il profilo di intensità della fluorescenza attraverso il canale di gradiente utilizzando il comando &quot;Analizza | Profilo di trama&quot;. </li><li> Esportare i dati di misurazione in un foglio di calcolo per ulteriori tracciamenti. </li><li> Incubare il dispositivo sul microscopio a temperatura controllata o in un incubatore di coltura convenzionale per 15 minuti. </li><li> Immagine il canale di gradiente utilizzando un obiettivo 10x per registrare le posizioni finali delle celle per l&#39;analisi dei dati. </li><li> Se necessario, registrare la migrazione della cella nel dispositivo tramite la microscopia a tempo intervallato. </li></ol></li></ol> 4. Migrazione cellulare DAnalisi dei dati ( figura 1C ) <ol><li> Analizzare il test di chemotaxis calcolando la distanza di migrazione cellulare dalla struttura di docking come descritto di seguito. Vedere la Figura 1C . </li><li> Importa l&#39;immagine nel software NIH ImageJ (versione 1.45). </li><li> Seleziona il centro di ogni cella che si è spostata nel canale di gradiente. </li><li> Misura le coordinate delle celle selezionate per le posizioni finali. Misurare la coordinata di un punto sul bordo della struttura di ancoraggio come posizione di riferimento iniziale. </li><li> Esportare i dati di coordinate misurati in un software di fogli di calcolo ( es. Excel). Calcolare la distanza di migrazione delle cellule come la differenza tra la posizione finale di una cellula e la posizione di riferimento iniziale lungo la direzione del gradiente. </li><li> Calibrare la distanza di un micrometro. Calcolare la media e la deviazione della distanza di migrazione di tutte le cellule come misura della chemotaxis. </li><li> Confronta la migDistanza in presenza di un gradiente chemoattrattante all&#39;esperimento di controllo medio usando la t- test di Student. </li><li> Se vengono registrate le immagini di migrazione della cella, la migrazione delle cellule e la chemiotassi possono essere ulteriormente analizzate mediante l&#39;analisi di tracciamento delle cellule 15 . NOTA: I materiali necessari per la costruzione e l&#39;esecuzione del test di chimotaxis su chip sono dettagliati nella tabella dei materiali. </li></ol>

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<li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+assay+for+precise+measurements+of+mouse%2C+rat%2C+and+human+neutrophil+chemotaxis+in+whole-blood+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukocyte+Biol%22%5BJournal%5D)">Microfluidic assay for precise measurements of mouse, rat, and human neutrophil chemotaxis in whole-blood droplets.</a> J Leukocyte Biol. 100 (1), 241-247 (2016).</li>
<li>Sackmann, E. K. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+asthma+from+a+drop+of+blood+using+neutrophil+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterizing asthma from a drop of blood using neutrophil chemotaxis.</a> P Natl Acad Sci. 111 (16), 5813-5818 (2014).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.worldscientific.com/doi/abs/10.1142/S2339547816500035">An all-on-chip method for testing neutrophil chemotaxis induced by fMLP and COPD patient's sputum.</a> Technology. 04 (02), 104-109 (2016).</li>
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Non ci sono conflitti di interesse da divulgare.

In questo articolo, è stato descritto un protocollo dettagliato per isolare direttamente neutrofili dal sangue intero seguito dal test di chemotaxis, tutti su un singolo chip microfluidico. Questo metodo offre funzionalità utili nel suo facile utilizzo, selezione negativa di neutrofili ad alta purezza, test rapido di chimotaxis da campione a risultato, reagenti ridotti e consumo di campioni e analisi accurate di dati di migrazione delle cellule. Come una stima approssimativa, almeno il 25% dei neutrofili dal campione di...

Chemotaxis, un processo di migrazione diretta delle cellule a gradiente di concentrazione chimica solubile, è criticamente coinvolto in molti processi biologici, tra cui la risposta immunitaria 1 , 2 , 3 , lo sviluppo del tessuto 4 e la metastasi del cancro 5 . Neutrofili sono il più ricco sottocategoria delle cellule del sangue bianco e svolgono un ruolo cruciale nel permettere le funzioni di difesa innata dell&#39;organismo del corpo, nonché nel mediare le risposte immunitarie adattative 6 , 7 . Neutrofili sono dotati di macchine chemotattiche altamente regolamentate che consentono a queste cellule immunitarie motile di rispondere sia a chemoattractants derivanti da patogeni ( ad es. FMLP) che ai chemoattractants derivanti da host ( ad esempio, interleukin-8) throughchemotaxis 8 . La migrazione di neutrofili e la chemiotassi mediano vari problemi fisiologiciE malattie come infiammazione e tumori 1 , 9 . Pertanto, la valutazione accurata della chemotaxide dei neutrofili fornisce una lettura funzionale importante per lo studio della biologia dei neutrofili e delle malattie associate. Rispetto ai campioni di chimotaxis tradizionali ( es. Test di transwell 10 ), i dispositivi microfluidici mostrano grande promessa per la valutazione quantitativa della migrazione cellulare e della chemiotassi a causa della generazione chimica precisa e della miniaturizzazione dei gradienti 11 , 12 e 13 . Negli ultimi due decenni o giù di lì, sono stati sviluppati diversi dispositivi microfluidici per studiare la chemotaxia di diversi tipi di cellule biologiche, in particolare neutrofili 11 . Uno sforzo significativo è stato dedicato a caratterizzare la migrazione di neutrofili in un complesso spatiotemporalmente complesso<html> Gradienti micali configurati nei dispositivi microfluidici 14 , 15 . Sono state sviluppate anche strategie interessanti per studiare decisioni direzionali da parte dei neutrofili usando i dispositivi microfluidici 16. All&#39;interno della ricerca biologica, le applicazioni dei dispositivi microfluidici sono state estese per testare campioni clinici per la valutazione delle malattie 17 , 18 e 19 . Tuttavia, l&#39;uso di molti dispositivi microfluidici è limitato a laboratori di ricerca specializzati e richiede un lungo isolamento dei neutrofili da un ampio volume di campioni di sangue. Pertanto, vi è stato un trend crescente di sviluppo di dispositivi microfluidici integrati per l&#39;analisi rapida della chimotassi neutrofila direttamente da una goccia di sangue intero 20 , 21 , 22 ,Ef &quot;&gt; 23 , 24 . Verso questa direzione, è stato sviluppato un metodo integrale che integra la depurazione neutrofila negativa magnetica e il successivo dosaggio della chemotaxis su un unico dispositivo microfluidico 25 . Questo metodo a tutto vantaggio del chip ha le seguenti caratteristiche: 1) in contrasto con le strategie precedenti su chip che isolano neutrofili dal sangue mediante bloccaggio delle cellule adesione o filtri basati sulla dimensione cellulare 20 , 22 , questo nuovo metodo consente elevati La purezza, la separazione magnetica su chip dei neutrofili da piccoli volumi di sangue intero, nonché la misurazione della chemotaxia sulla stimolazione del chemoattractant; 2) la struttura di ancoraggio delle cellule aiuta a allineare le posizioni iniziali dei neutrofili vicino al canale di gradiente chimico e consente un&#39;analisi semplice di chemiotassi senza tracciamento di singole celle; 3) l&#39;integrazione dell&#39;isolamento neutrofilo e del chemotL&#39;analisi dell&#39;asse su un unico dispositivo microfluidico consente un&#39;analisi rapida del chimotassi da campione a risultato in 25 minuti quando non vi è interruzione tra i passaggi sperimentali. Questo documento fornisce un protocollo dettagliato per la costruzione, l&#39;operazione e il metodo di analisi dei dati di questo test di chimotassi su tutti i chip. La carta dimostra l&#39;efficace utilizzo del metodo sviluppato per l&#39;esecuzione della chemotaxide dei neutrofili mediante la sperimentazione di un esperto chemoattractant ricombinante e campioni chemotattici complessi dai pazienti, seguito da una discussione sulle strategie di risoluzione dei problemi, le limitazioni e le direzioni future.

<table><tbody><tr><td>Fabbricazione del dispositivo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allineatore per maschere</td><td>ABM</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Spinner</td><td>Solitec</td><td>5000</td><td></td></tr><tr><td>Piastra riscaldante</td><td>VWR</td><td>11301-022</td><td></td></tr><tr><td>Pulitore al plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Essiccatore sottovuoto</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-594-15A</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia digitale</td><td>Ohaus</td><td>CS200</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2000 diluente</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2000</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025 fotoresist</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2025</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 sviluppatore</td><td>Microchem</td><td>SU-8 sviluppatore</td><td></td></tr><tr><td>Si wafer</td><td>Silicon, Inc</td><td>LG2065</td><td></td></tr><tr><td>Alcool isopropilico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416-4</td><td></td></tr><tr><td>(tridecafluoro-1,1,2,2-tetraidroottil) triclorosilano</td><td>Gelest</td><td>78560-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsilossano (PDMS)</td><td>Adesivi Ellsworth</td><td>2065622</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875714</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>Tampone da taglio</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Personalizzato</td></tr><tr><td>Perforatori</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Su misura</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Source</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Isolamento cellulare su chip e test di chemiotassi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025502</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002802</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SH3057402</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>VWR</td><td>CACB356008</td><td></td></tr><tr><td>fMLP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3506-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Dischi magnetici</td><td>Indigo Instruments</td><td>44202-1</td><td>5 mm di diametro, 1 mm di spessore</td></tr><tr><td>FITC-destrano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD10S</td><td></td></tr><tr><td>rodamina</td><td> Sigma-Aldrich</td><td>R4127-5G</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa soluzione colorante</td><td>Rowley Biochemical Inc.</td><td>G-472-1-8OZ</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit</td><td>STEMCELL Technologies Inc</td><td>19666</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti-U microscopio a fluorescenza invertita</td> Camera ambientale per microscopio <td>Nikon</td><td>Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>.</td>Fotocamera CCD <td>InVivo</td><td>Scientific N/A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>DS-Fi1</td><td></td></tr></tbody></table>

un metodo integrato per l&#39;analisi della chimotassi rapida dei neutrofili direttamente da una goccia di sangue

An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood

La migrazione di neutrofili e la chemiotassi sono fondamentali per il sistema immunitario del nostro corpo. I dispositivi microfluidici sono sempre più utilizzati per indagare la migrazione dei neutrofili e la chemiotassi a causa dei loro vantaggi nella visualizzazione in tempo reale, controllo preciso della generazione di gradiente di concentrazione chimica e riduzione del reagente e del consumo di campioni. Recentemente, i ricercatori microfluidici hanno intrapreso uno sforzo crescente verso lo sviluppo di sistemi di analisi chimotassi microfluidici integrati e facili da usare, direttamente dal sangue intero. In questa direzione, è stato sviluppato il primo metodo integrale per integrare la purificazione neutra magnetica dei neutrofili e il test di chemotaxis da campioni di piccole quantità di sangue. Questo nuovo metodo consente una rapida prova chimotassi neutrofila del campione per risultato in 25 min. In questo documento, forniamo metodi dettagliati per la costruzione, l&#39;operazione e l&#39;analisi dei dati per questo test di chimotaxis a chip completo con una discussione sulle strategie di risoluzione dei problemi, limiLe direzioni future. Sono mostrati i risultati rappresentativi del test di neutotossido neutrofile che hanno dimostrato un esperto di chemoattractant, N -Formil-Met-Leu-Phe (fMLP) e l&#39;espettorato di un paziente con malattia polmonare ostruttiva cronica (COPD) utilizzando questo metodo su tutti i chip. Questo metodo è applicabile a molte ricerche correlate alla migrazione cellulare e alle applicazioni cliniche.

Neutrofili sono selezionati negativamente da una goccia di sangue intero direttamente nel dispositivo microfluidico. La purezza dei neutrofili isolati è stata verificata con la colorazione Giemsa su chip e i risultati mostrarono i nuclei tipici a forma di anello e a forma di lobo di neutrofili ( Figura 2A ) 25 . Ciò indica un efficace isolamento neutrofilo a chip in alta purezza da un piccolo volume di sangue intero. Inoltre, la strut...

Questo articolo fornisce il metodo dettagliato per eseguire un rapido dosaggio della chemotaxis neutrofile integrando l&#39;isolamento neutrofilo a circuito integrato dal sangue intero e il test di chemotaxis su un singolo chip microfluidico.

Un metodo integrato per l&#39;analisi della chimotassi rapida dei neutrofili direttamente da una goccia di sangue

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil ...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare un metodo per separare i neutrofili da una goccia di sangue intero e quindi eseguire un successivo test di chemiotassi utilizzando un singolo dispositivo microfluidico. Questo metodo fornisce il nostro codice per eseguire un test di chemiotassi dei neutrofili utilizzando un piccolo volume di sangue intero. E può essere facilmente applicato dai ricercatori per rispondere a domande biologiche relative alla migrazione delle cellule immunitarie.Il vantaggio principale di questa tecnica è l'integrazione e il nostro test di chemiotassi su un singolo dispositivo microfluidico. Ciò consente l'assemblaggio e l'analisi in 25 minuti. Per iniziare, prepara il master maldus descritto nel protocollo di testo allegato.Quindi silanizzare la superficie dello stampo SU8 per facilitare il rilascio del PDMS dallo stampo. Quindi, mescolare 40 grammi di base PDMS e quattro grammi di agente di trasporto in un becher di plastica. Posizionare lo stampo master SU8 preparato in una capsula di Petri e versare con cura la soluzione PDMS miscelata sullo stampo.Mettere la capsula di Petri in un essiccatore e applicare un vuoto per degassare la soluzione PDMS

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo protocollo descrive lo sviluppo di un dispositivo a microfluidi per indagare chemiotassi batterica in gradienti di concentrazione stabile di chemoeffectors.

Un dispositivo a microfluidi per quantificare chemiotassi batterica in gradienti di concentrazione stabile

Questo video mostra il test della chemiotassi dei neutrofili utilizzando un metodo all-on-chip. Il metodo consente l'isolamento diretto dei neutrofili dall'intero sangue mediante selezione immunomagnetica negativa seguita da un test di chemiotassi su un chip microfluidico.

Un metodo basato su chip microfluidico per l'analisi rapida della chemiotassi dei neutrofili utilizzando sangue intero

In questo articolo vi presentiamo un chip microfluidica per l'analisi singola cellula. Esso consente la quantificazione delle proteine ​​intracellulari, enzimi, cofattori, e secondi messaggeri per mezzo di saggi fluorescenti o immunologici.

Un chip microfluidica per la Versatile analisi chimica di singole cellule

Dettagli Questo protocollo un saggio progettato per misurare la chemiotassi dei neutrofili umani da una gocciolina di sangue intero con robusto riproducibilità. Questo approccio elude la necessità di una separazione dei neutrofili e richiede solo pochi minuti di dosaggio tempo di preparazione. Il chip microfluidica consente la misura ripetuta di chemiotassi dei neutrofili nel tempo nei neonati o piccoli mammiferi, dove il volume del campione è limitata.

Piattaforma microfluidica per la misurazione dei neutrofili Chemiotassi dal Lordo Sangue intero

È riportato un metodo di quantificazione neutrofili. Questo metodo crea un ambiente di flusso dinamico simile a quello riscontrato in un vaso sanguigno. Permette la ricerca di neutrofili adesione a entrambi le molecole purificate di adesione (ligando) o substrato di cellule endoteliali (HUVEC) in un contesto simile all'ambiente in vivo con lo stress puro.

Umano camera di flusso neutrofili saggio

analisi chemiotattica visivi sono essenziali per una migliore comprensione di come le cellule eucariotiche controllare la migrazione delle cellule direzionale chemoattractant-mediata. Qui, descriviamo i metodi dettagliati per: 1) in tempo reale, il monitoraggio ad alta risoluzione di molteplici analisi chemiotattica, e 2) visualizzando contemporaneamente il gradiente chemiotattico e le dinamiche spazio-temporali di eventi in cellule HL60 neutrofili simile segnalazione.

Imaging G protein-coupled recettore-mediata chemiotassi ed i suoi eventi di segnalazione nelle cellule HL60 neutrofili-like

Protocolli per la valutazione quantitativa della chemiotassi dei linfociti e la migrazione sono strumenti importanti per la ricerca in immunologia. Qui, un protocollo in vitro è descritto che permette in tempo reale, multiplexed valutazione della migrazione cellulare, così come un complementare in vivo tecnica abilitazione rilevamento di cellule native alla milza.

Quantificazione del linfocita murino traffico In Vivo e chemiotassi del monocito umano In Vitro

Questo protocollo genera microarray di bioparticelle che forniscono brulio di neutrofoni controllati spazialmente. Fornisce un facile accesso ai mediatori che i neutrofili rilasciano durante la migrazione e consente l'analisi quantitativa dell'imaging.

Microarray di bioparticelle per l'analisi chemiotattica e molecolare dello sciame neutrofilo umano in vitro

Qui, presentiamo un protocollo di test di chemiotassi migliorato. L'obiettivo di questo protocollo è quello di ridurre i passaggi e i costi dei metodi tradizionali di chemiotassi batterica e di servire come risorsa preziosa per la comprensione delle interazioni pianta-microbo.

Un test di chemiotassi migliorato per la rapida identificazione dei chemioattrattivi rizobatterici negli essudati radicali

Questo protocollo presenta una serie di saggi funzionali dei neutrofili da utilizzare come metodo di screening per coprire le funzioni di diverse vie di segnalazione. Il protocollo include una valutazione iniziale e semplice della vitalità cellulare, della purezza, della produzione di specie reattive dell'ossigeno, della migrazione in tempo reale, della fagocitosi e di un suggerimento preliminare di trappole extracellulari per neutrofili.

Una serie di tecniche di screening per una rapida panoramica della funzione dei neutrofili

Presentiamo un metodo automatizzato ad alto rendimento per quantificare le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) utilizzando il sistema di analisi delle cellule vive, accoppiato con un approccio a doppio colorante dipendente dalla permeabilità della membrana.

Tecnica real-time ad alto rendimento per quantificare la formazione di trappole extracellulari di neutrofili nei neutrofili umani

Impara un metodo rapido per isolare i neutrofili da una goccia di sangue intero e analizzarne la chimotassi con un unico dispositivo microfluidico. Questa tecnica consente risultati in soli 25 minuti, semplificando lo studio della migrazione cellulare.

Un metodo integrato per l'analisi della chimotassi rapida dei neutrofili direttamente da una goccia di sangue

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