Un metodo integrato per l'analisi della chimotassi rapida dei neutrofili direttamente da una goccia di sangue
23 giugno 2017
Questo articolo fornisce il metodo dettagliato per eseguire un rapido dosaggio della chemotaxis neutrofile integrando l'isolamento neutrofilo a circuito integrato dal sangue intero e il test di chemotaxis su un singolo chip microfluidico.
L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare un metodo per separare i neutrofili da una goccia di sangue intero e quindi eseguire un successivo test di chemiotassi utilizzando un singolo dispositivo microfluidico. Questo metodo fornisce il nostro codice per eseguire un test di chemiotassi dei neutrofili utilizzando un piccolo volume di sangue intero. E può essere facilmente applicato dai ricercatori per rispondere a domande biologiche relative alla migrazione delle cellule immunitarie.
Il vantaggio principale di questa tecnica è l'integrazione e il nostro test di chemiotassi su un singolo dispositivo microfluidico. Ciò consente l'assemblaggio e l'analisi in 25 minuti. Per iniziare, prepara il master maldus descritto nel protocollo di testo allegato.
Quindi silanizzare la superficie dello stampo SU8 per facilitare il rilascio del PDMS dallo stampo. Quindi, mescolare 40 grammi di base PDMS e quattro grammi di agente di trasporto in un becher di plastica. Posizionare lo stampo master SU8 preparato in una capsula di Petri e versare con cura la soluzione PDMS miscelata sullo stampo.
Mettere la capsula di Petri in un essiccatore e applicare un vuoto per degassare la soluzione PDMS per 20 minuti. Quindi, metti la capsula di Petri in un forno e polimerizza il PDMS a 80 gradi Celsius per due ore. Dopo la cottura, tagliare e staccare con cura la lastra PDMS dallo stampo SU8.
Tagliare la soletta PDMS per separarla in singoli dispositivi. Tagliare il dispositivo PDMS per creare due pareti attorno alla porta di caricamento delle celle per contenere i magneti. Quindi, perforare la porta di caricamento delle celle utilizzando un perforatore di tre millimetri di diametro.
Quindi, passare a un punzone da sei millimetri e rimuovere i serbatoi di ingresso della sostanza chimica nell'uscita dei rifiuti. Utilizzando un pezzo di nastro adesivo, rimuovere la polvere sulla superficie della lastra PDMS. Posizionare la lastra pulita in un vetrino pulito nella macchina al plasma.
Applicare l'aspirapolvere per tre minuti. E poi accendi l'alimentazione al plasma e imposta il livello su alto. Regolare delicatamente la valvola dell'aria e trattare al plasma il PDMS e il vetrino per tre minuti.
Al termine, spegnere l'alimentazione al plasma e rilasciare l'aspirapolvere. Estrarre con cautela la lastra PDMS nel vetrino utilizzando una pinzetta, posizionare immediatamente la lastra PDMS sopra il vetrino, con le strutture dei canali rivolte verso il basso, premere delicatamente la lastra PDMS per legarla al vetro e quindi riempire immediatamente il canale microfluidico con acqua deionizzata. I PDMS sono stati generalmente premuti sul substrato di vetro per evitare che il pozzetto entri nel canale barriera.
Rimuovere l'acqua deionizzata dal dispositivo e aggiungere 100 microlitri di soluzione di Fribronectina dalla presa. Attendere tre minuti per assicurarsi che tutti i canali siano riempiti con una soluzione di fibronectina. Quindi, incubare il dispositivo in una capsula di Petri coperta per un'ora a temperatura ambiente.
Quindi, rimuovere la soluzione di fibronectina dal dispositivo e aggiungere 100 microlitri di terreno di migrazione dalla presa. Ancora una volta, attendere tre minuti per assicurarsi che tutti i canali siano riempiti con il mezzo di migrazione. Incubare il dispositivo per un'altra ora a temperatura ambiente prima di utilizzare il dispositivo nell'esperimento di chemiotassi.
Metti dieci microlitri di sangue intero in una provetta da 1,5 millilitri. Quindi, aggiungi due microlitri del cocktail di anticorpi. E due microlitri di particelle magnetiche da un kit di isolamento dei neutrofili e mescolare delicatamente il tubo per marcare magneticamente le cellule marcate con anticorpi.
Incubare la miscela dell'etichetta per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, collegare due piccoli dischi magnetici ai due lati della porta di caricamento della cella del dispositivo. Aspirare il fluido da tutte le porte del dispositivo.
Quindi, pipettare lentamente due microlitri della miscela di sangue marcata nel dispositivo microfluidico dalla porta di caricamento delle cellule. Posizionare il dispositivo microfluidico sul tavolino del microscopio a temperatura controllata a 37 gradi Celsius. Attendere qualche minuto fino a quando un numero sufficiente di neutrofili non è intrappolato nell'area di aggancio delle cellule.
Quindi, aggiungere 100 microlitri della soluzione chemioattrattiva e 100 microlitri di terreno di migrazione ai serbatoi di ingresso designati utilizzando due pipettatori. Ciò genererà un gradiente chemioattrattivo mediante miscelazione chimica a flusso laminare continuo. Il chemioattrattivo può essere costituito da proteine ricombinanti come la FMLP o da un campione clinico come il surnatante dell'espettorato di pazienti con BPCO.
Una volta che il flusso si è stabilizzato, acquisire immagini a fluorescenza del gradiente di destrano FitZ nel canale. Quindi, incubare il dispositivo sul tavolino del microscopio a temperatura controllata o in un incubatore per colture cellulari convenzionale per 15 minuti. Dopo l'incubazione, è possibile visualizzare il canale del gradiente utilizzando un obiettivo dieci volte per registrare le posizioni finali della cellula per l'analisi dei dati.
I neutrofili vengono selezionati negativamente da una goccia di sangue intero direttamente nel dispositivo microfluidico utilizzando la marcatura degli anticorpi con particelle magnetiche e una coppia di magneti. Al fine di confermare la purezza dei neutrofili isolati su chip, è stata eseguita la colorazione Giemsa. I risultati mostrano i tipici nuclei a forma di anello e a forma di lobo dei neutrofili.
Dopo il caricamento delle celle, la struttura di aggancio allinea efficacemente le celle accanto al canale del gradiente prima di applicare un gradiente chimico. Se esposto a un gradiente chimico per 15 minuti, si verifica la chemiotassi. E può essere misurato utilizzando l'imaging.
Questi risultati mostrano che dopo 15 minuti, poche cellule sono strisciate attraverso il canale barriera nel campione controllato al terreno. Al contrario, molti neutrofili si sono spostati rapidamente attraverso il canale barriera e sono migrati verso un gradiente FMLP a 100 nanomolari. Una volta che questo può spedire la chemiotassi direttamente dal nostro in 25 minuti.
Questo offre uno strumento utile ai ricercatori per studiare i meccanismi della migrazione dell'intera cellula. E uno strumento per applicazioni cliniche.
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Panoramica
In questo articolo viene illustrato un metodo per isolare i neutrofili dal sangue intero ed eseguire un saggio di chemotassi utilizzando un singolo dispositivo microfluidico. L'integrazione di questi processi consente un'analisi rapida in soli 25 minuti, rendendola accessibile ai ricercatori che studiano la migrazione delle cellule immunitarie.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Immunologia
- Microfluidica
- Biologia cellulare
Sfondo
- I neutrofili svolgono un ruolo fondamentale nella risposta immunitaria.
- Comprendere la migrazione dei neutrofili è importante per lo studio di varie malattie.
- I metodi tradizionali per l'isolamento dei neutrofili e i saggi di chemotassi possono richiedere molto tempo.
- Questo metodo mira a semplificare il processo utilizzando la tecnologia microfluidica.
Scopo dello studio
- Fornire un metodo rapido per l'isolamento dei neutrofili e il test della chemotassi.
- Facilitare la ricerca sul comportamento delle cellule immunitarie in risposta a stimoli.
- Dimostrare la fattibilità dell'utilizzo di un singolo dispositivo per entrambi i processi.
Metodi Utilizzati
- Isolamento di neutrofili dal sangue intero mediante un chip microfluidico.
- Esecuzione di un saggio di chemotassi sullo stesso dispositivo microfluidico.
- Analisi della migrazione dei neutrofili in risposta a segnali chemotattici.
- Utilizzo di un piccolo volume di sangue per il saggio.
Risultati principali
- Il metodo isola con successo i neutrofili ed esegue saggi di chemotassi.
- I risultati possono essere ottenuti entro 25 minuti.
- La tecnica è riproducibile ed efficiente per applicazioni di ricerca.
- L'integrazione dei processi migliora il flusso di lavoro complessivo per i ricercatori.
Conclusioni
- Questo metodo fornisce un approccio rapido ed efficiente per lo studio della migrazione dei neutrofili.
- Può essere facilmente adottato da ricercatori del settore.
- L'uso di un singolo dispositivo microfluidico semplifica l'allestimento sperimentale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo interamente su chip consente un'analisi rapida della chemotassi dei neutrofili direttamente dal sangue intero, affrontando un collo di bottiglia fondamentale nella ricerca immunologica e sull'infiammazione. Integrando l'isolamento cellulare e il saggio funzionale in un singolo dispositivo microfluidico entro 25 minuti, permette lo screening ad alto rendimento di composti immunomodulatori e di campioni derivati da pazienti. L'approccio migliora l'affidabilità predittiva nella validazione di bersagli per malattie mediate dai neutrofili come la BPCO, la sepsi e i disturbi autoimmuni.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'interrogazione funzionale delle vie di migrazione dei neutrofili in risposta a chemiotattici come fMLP o stimoli clinici.
- Valore operativo: Utilizza volumi minimi di campione (10 µL di sangue intero), compatibili con il prelievo in fase preclinica e nelle prime fasi cliniche.
- Valore predittivo: Fornisce letture quantitative dell'efficienza chemiotattica per ridurre il rischio associato a bersagli coinvolti nel traffico dei leucociti e nell'infiammazione.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prontezza del saggio: Genera gradienti stabili e laminari di chemiotrattanti per test riproducibili di risposta alla dose di composti.
- Scalabilità: La progettazione integrata riduce il tempo di manipolazione manuale e il consumo di reagenti, favorendo l'adattamento a piattaforme automatizzate di imaging.
- Standardizzazione dell'output: L'imaging basato sulla fluorescenza della migrazione dei neutrofili consente endpoint oggettivi e quantificabili per la selezione dei risultati positivi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Dimostrata utilità con il supernatante dell'espettorato di pazienti con BPCO, collegando l'output del saggio a condizioni fisiopatologiche.
- Continuità traslazionale: Consente lo screening di terapie utilizzando fluidi chemiotattici derivati da pazienti per valutare l'interazione con il bersaglio nell'infiammazione.
- De-risking meccanicistico: Chiarisce se i composti candidati modulano la direzionalità, la velocità o l'accumulo dei neutrofili in gradienti concentrazionali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso iniziale della scoperta, consentendo una rapida transizione dall'ipotesi sul bersaglio alla validazione funzionale in saggi di migrazione delle cellule immunitarie.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui percorsi di chemiotassi mediati da GPCR (ad esempio, FPR1) utilizzando stimoli definiti o derivati da pazienti.
- Screening: Fornisce metriche quantitative basate sull'immagine della migrazione, adatte allo screening di librerie di composti in programmi mirati all'infiammazione.
- Analisi: Fornisce dati con risoluzione a singola cellula su velocità di migrazione, direzionalità e accumulo per un profilo meccanicistico.
- Ricerca traslazionale: Consente l'uso di campioni clinici (ad esempio, espettorato, plasma) per valutare l'attività chemiotattica in contesti rilevanti per la malattia.
- Riutilizzo aziendale: La progettazione del chip microfluidico permette il riutilizzo su diversi bersagli immunologici con minima riconfigurazione.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nei percorsi mediati dai neutrofili attraverso il tracciamento diretto e in tempo reale della migrazione.
- Valore operativo: Elimina la necessità di purificazione cellulare in post-trattamento, riducendo la perdita di campione, la variabilità e il tempo di manipolazione manuale.
- Valore strategico: Accelera le decisioni di avanzamento o interruzione nei programmi di infiammazione fornendo dati funzionali entro un'unica giornata lavorativa.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei bersagli aggiustata in base al rischio, basata sulla validazione funzionale in neutrofili umani primari.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella fabbricazione di dispositivi microfluidici, nel bonding al plasma e nella microscopia a fluorescenza.
- Richiede l'accesso a microscopi con controllo della temperatura e a reagenti compatibili con la chemiotassi (ad esempio, fibronectina, mezzo di migrazione).
- Necessita della standardizzazione delle procedure di generazione del gradiente e di acquisizione delle immagini tra diversi utenti e sedi.
- L'adattamento ad altri tipi di cellule immunitarie potrebbe richiedere un'ottimizzazione dell'etichettatura magnetica e della chimica superficiale dei canali.
- I limiti pratici includono la sensibilità alla qualità del campione ematico e il rischio di formazione di coaguli nei microcanali se il campione non viene processato tempestivamente.
