Una multi-foro esageratamente Elimina gelati Imperfezioni muscoli sono direttamente immerso in azoto liquido

L'obiettivo generale di questa procedura è congelare i tessuti muscolari, immergendoli direttamente nell'azoto liquido ed eliminando gli artefatti da congelamento. Maozhang He, uno studente del mio laboratorio, dimostrerà questa procedura con Yizhong Huang. Per iniziare, etichettare l'identità del campione su ogni fiala criogenica.

Quindi, organizza la seguente attrezzatura: una bombola di azoto liquido, occhiali di sicurezza o una visiera, guanti da congelatore, pinze da 10 centimetri e pinzette da 25 centimetri. Inoltre, organizza un dispositivo di raffreddamento in polistirolo, una pellicola di plastica, un bisturi e coperture per rilegatura in PVC A4. Per preparare i campioni muscolari, iniziare riempiendo il refrigeratore con azoto liquido.

Entro cinque minuti dall'ottenimento di un campione, posizionare delicatamente il campione su un pezzo di copertura di rilegatura in PVC A4 e osservare la direzione delle fibre muscolari. Quindi, usa un bisturi per praticare due incisioni parallele attraverso il campione nella direzione delle fibre muscolari, a circa 3 centimetri di lunghezza e 0,6 centimetri di distanza. Taglia il muscolo inciso in un rettangolo di circa 0,6 centimetri di larghezza, 0,6 centimetri di altezza, 1,5 centimetri di lunghezza.

Quindi, utilizzando una pinza da dieci centimetri, posizionare delicatamente il campione su un pezzo di pellicola di plastica con l'asse longitudinale del muscolo inciso parallelo al bordo lungo della pellicola. Posizionare il tessuto muscolare nella parte centrale inferiore di una fiala criogenica etichettata, proprio tra i fori di ingresso, e chiudere bene la fiala. Per congelare il campione di tessuto, utilizzare una pinzetta da 25 centimetri per immergere rapidamente l'intera fiala criogenica in azoto liquido, nel raffreddatore di polistirolo pre-raffreddato, aspettando che l'azoto liquido non bolle più.

L'azoto liquido deve essere sufficiente per immergere l'intero crioviale e la fiala criogenica deve essere completamente al di sotto del livello del liquido. Trasferire i campioni muscolari in un serbatoio di stoccaggio dell'azoto liquido o in un congelatore a 80 gradi Celsius per la conservazione a lungo termine. È importante evitare il contatto accidentale tra i muscoli congelati e i contenitori o gli strumenti a temperatura ambiente.

Per preparare i vetrini, pre-raffreddare un criostato a una temperatura compresa tra 20 gradi Celsius e 22 gradi Celsius. Rimuovere e gettare la vecchia lama in microtono e pulire il portacoltello e la piastra antirollio nel criostato. Quindi, installare una nuova lama microtone nel criostato e impostare lo spessore di taglio su otto micrometri.

Rimuovere la fiala criogenica con il campione di muscolo dal serbatoio di stoccaggio dell'azoto liquido o dal congelatore a 80 gradi Celsius e posizionarla nell'azoto liquido o sul ghiaccio secco. Quindi, trasferire il campione nel criostato e attendere 30 minuti affinché il campione si equilibri con la temperatura del criostato. Dopo aver utilizzato l'OCT per incorporare il campione, montare il campione nel supporto del campione.

Quindi, tagliare sezioni di otto micrometri. Montare le sezioni verso il centro di una micro slitta a temperatura ambiente. Posizionare immediatamente il vetrino in una scatola del vetrino.

Quindi, metti la scatola di diapositive in un congelatore a 80 gradi Celsius. Non lasciare asciugare il vetrino a temperatura ambiente. Come si vede qui, i cristalli di ghiaccio si sono formati quando un campione di muscolo longissimus dorsi di maiale è stato posto direttamente in un congelatore a 80 gradi Celsius e ha causato un ben noto effetto del formaggio svizzero sulla criosezione muscolare.

I cristalli di ghiaccio si formavano anche quando il tessuto muscolare veniva immerso direttamente nell'azoto liquido. Utilizzando un altro metodo, molti cristalli di ghiaccio aghiformi si sono formati nel compartimento citoplasmatico delle miofibre quando il tessuto è stato immerso nel mezzo di montaggio OCT con l'orientamento corretto e quindi rapidamente congelato in un impasto di isopentano. Il congelamento del tessuto nel crioviale multiforo consente di ottenere un'eccellente integrità del campione, con un compartimento citoplasmatico chiaramente visibile e la stretta apposizione delle miofibre al tessuto circostante.

Utilizzando questo metodo, l'attività dell'ATPasi è stata analizzata nelle fibre muscolari a contrazione rapida e lenta. Quando vengono dati tempi equivalenti, le fibre a contrazione rapida appaiono chiare, con due gradi, e le fibre a contrazione lenta appaiono nere. In un metodo di congelamento standard mostrato qui, il tessuto muscolare è stato immerso in un impasto di isopentano senza contatto diretto con il mezzo di montaggio dell'OCT, tuttavia uno stato di liquame liquido solido di isopentano è difficile da mantenere per più di un'ora e l'isopentano non è sempre disponibile.