Tecnica laparoscopica per la raccolta di serie del fegato e linfonodi mesenterica in macachi

L'obiettivo generale di questa procedura laparoscopica minimamente invasiva è quello di migliorare la valutazione degli effetti della traslocazione microbica dal tratto gastrointestinale mediante la raccolta di linfonodi mesenterici e biopsie epatiche in più punti temporali, migliorando al contempo il benessere degli animali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dell'HIV sulle conseguenze immunologiche dell'infezione e della traslocazione microbica sui linfonodi mesenterici e sul fegato e sulla patologia di questi tessuti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di campionare in più punti temporali in uno studio con un impatto minimo sull'animale o sui parametri che vengono valutati.

Questo metodo può fornire campioni fondamentali per approfondire la nostra comprensione dell'HIV. Può essere applicato anche ad altri modelli in cui l'infiammazione gastrointestinale e la traslocazione microbica sono importanti. A fare la procedura saranno il Dr. Jeremy Smedley e la Dr.Cassie Moats, chirurghi veterinari presso il Washington National Primate Research Center.

Dopo aver preparato un macaco per l'intervento chirurgico come indicato nel protocollo di testo, coprirlo con un telo fenestrato sterile. Quindi, utilizzando un telo per fotocamera sterile, coprire strettamente la fotocamera digitale e collegarla alla torre. Collegare il cannocchiale rigido con la testa della telecamera.

Quindi collegare un cavo luminoso sterile al cannocchiale rigido e collegarlo alla fonte di luce. Infine, montare un tubo di insufflazione sterile sull'insufflatore. Per iniziare la laparoscopia, posizionare una lama di bisturi da 15 a circa uno o due centimetri a sinistra dell'ombelico e praticare un'incisione di circa 5 millimetri nella pelle che raggiunge i muscoli addominali.

Con la mano non dominante, sollevare la parete addominale sul lato cranico del taglio. Quindi, con l'altra mano, introdurre attraverso l'incisione la punta di un ago varo inclinata verso la testa dell'animale. Tenere l'ago varo per l'asta e spingerlo con decisione fino a quando non scatta attraverso la parete addominale e la resistenza contro l'ago diminuisce nella cavità addominale.

Quindi collegare il tubo dell'insufflatore di CO2 all'ago e aprire il rubinetto per rilasciare il gas nella cavità addominale. Crea un pneumoperitoneo raggiungendo la pressione fino a 10-12 millimetri di mercurio. Ora che l'addome è completamente insufflato, posiziona la lama del bisturi 15 sopra l'addome cranico sinistro, a circa due o quattro centimetri caudale fino all'ultima costola, e fai un'incisione cutanea di circa cinque-sette millimetri.

Quindi, inserire attraverso il taglio un gruppo di cannula trocar da cinque millimetri. Introdurre l'assemblaggio a una profondità di uno o due centimetri, dirigendolo a circa 45-60 gradi caudomedialmente. Quindi, con un movimento rotatorio, far scorrere la cannula in avanti raggiungendo una profondità compresa tra 1,5 e tre centimetri per avvitare la cannula nell'addome.

Successivamente, rimuovere il trocar. Scollegare il tubo dell'insufflatore dall'ago varo e successivamente chiudere il rubinetto. Collegare il tubo alla cannula e aprire il rubinetto per mantenere il pneumoperitoneo.

Una volta verificato che la pressione viene mantenuta con successo, rimuovere l'ago varo. Successivamente, attraverso la cannula, inserire il cannocchiale rigido nella cavità addominale. Sotto il controllo della telecamera, approfondire l'incisione cutanea rimanente dopo la rimozione dell'ago varo, tagliando i muscoli addominali e il peritoneo.

Infine, posiziona l'animale con le zampe sollevate a circa 15-30 gradi sopra la testa. Per prelevare una biopsia dal linfonodo mesenterico, introdurre una sonda solida nella cavità addominale attraverso l'incisione preparata. Posiziona la sonda tra l'omento e l'intestino e con un movimento delicato e ampio esponi l'intestino dall'omento per visualizzare il mesentere nascosto sotto.

Continuare a spostare la sonda dalla direzione caudale a quella cranica per allontanare l'omento dal campo operatorio. Quindi, utilizzando la sonda, spostare il colon discendente verso la parete addominale. Esaminare il mesentere con la sonda per localizzare i linfonodi mesenterici situati lungo il colon e i vasi mesenterici.

Una volta identificato il linfonodo, sostituire la sonda nella cavità addominale con una pinza a cricchetto Maryland e afferrare il mesentere adiacente al nodo. Tirare il mesentere verso l'incisione e rimuovere il cannocchiale dalla cannula. Quindi spegnere l'insufflatore e lasciare aperto il rubinetto della cannula per rilasciare il gas dall'addome, che faciliterà l'esteriorizzazione del mesentere.

Quindi tirare il mesentere attraverso l'incisione. Afferrare il mesentere esteriorizzato con una pinza per garantire l'accesso attraverso l'incisione. Palpare o osservare il mesentere per identificare il linfonodo che dovrebbe apparire come un nodulo più sodo o una zona più grigia.

Successivamente, utilizzando emostatici curvi, praticare un'apertura da tre a cinque millimetri nel mesentere adiacente al nodo e sezionare senza mezzi termini eventuali attacchi al tessuto. Se necessario, legare il sistema vascolare con una sutura monofilamento 4-0 non assorbibile e, utilizzando il bisturi, sezionare il linfonodo. Quindi, posizionare la biopsia in terreno RPMI 1640 su ghiaccio.

Infine, rilasciare il mesentere e insufflare nuovamente l'addome per consentire di riportare il tessuto nella cavità addominale. Riportare il tavolo in posizione orizzontale. Per prelevare una biopsia epatica, inserire una cannula filettata nella cavità addominale attraverso l'incisione utilizzata per la raccolta dei linfonodi.

Quindi, utilizzando la cannula, far scorrere il cannocchiale rigido diretto verso la cavità addominale cranica per visualizzare il fegato. Sotto il controllo della telecamera, introdurre una pinza per biopsia attraverso la cannula precedentemente utilizzata per insufflare la cavità addominale. Posizionare la pinza sotto il margine designato del lobo del fegato in modo che le mascelle siano rivolte verso il tessuto e aprire la pinza permettendo al margine di cadere nelle mascelle.

Dopo aver regolato la loro posizione, chiudere la pinza e mantenere la pressione per circa 20-30 secondi. Quindi rimuovere il campione tirando delicatamente la pinza attraverso la cannula. Posizionare la biopsia in mezzo RPMI sul ghiaccio.

Infine, assicurarsi che non si osservino emorragie nel sito della biopsia e chiudere le incisioni. Qui vengono presentate le rese cellulari ottenute da biopsie di linfonodi mesenterici ed epatiche raccolte da due mecachi femmine sane in due diversi punti temporali. Come previsto, le biopsie linfonodali hanno prodotto un numero significativamente più elevato di cellule isolate rispetto alle biopsie epatiche.

Indipendentemente dal tessuto di origine, oltre l'85% delle cellule isolate era vitale. Quindi i campioni di cellule isolate sono stati analizzati per le popolazioni di leucociti CD45+ e linfociti CD45+CD3+. I linfonodi mesenterici avevano una maggiore frequenza di leucociti CD45+ e linfociti CD3+ rispetto alle cellule derivate dal fegato.

La caratterizzazione dettagliata delle popolazioni isolate ha mostrato che i linfonodi mesenterici contenevano proporzioni significativamente più elevate di cellule CD3+T e cellule CD4+T, nonché un numero elevato di cellule CD8+T. Al contrario, il fegato era significativamente arricchito di leucociti CD14+. Entrambi gli organi hanno dimostrato abbondanze simili di cellule CD20+B.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 30-40 minuti. Gli animali in genere si riprendono dall'anestesia, sono attivi e mangiano entro un paio d'ore, e le incisioni sono così piccole che possono essere difficili da vedere sul lato della gabbia. Quando si tenta questa procedura, è importante mantenere gli animali in una condizione corporea che faciliti il successo.

Una parte significativa del grasso mesenterico può essere un ostacolo impegnativo in quanto oscura i nodi e aumenta la friggibilità e il sanguinamento. A seguito di questa procedura, possono essere eseguite altre metodiche come la flebotomia, la biopsia dei linfonodi periferici, l'endoscopia del tratto gastrointestinale superiore e inferiore e la biopsia rettale al fine di valutare le risposte immunitarie sistemiche e delle mucose, lo stato dei microbi e le barriere epiteliali, nonché le cariche virali. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori del nostro laboratorio per esplorare longitudinalmente le popolazioni microbiche nell'infiammazione nei tessuti dei macachi che in precedenza erano disponibili solo per necroscopia.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia per l'HIV, poiché la traslocazione microbica è una delle principali cause di infiammazione che guida la patogenesi dell'HIV. La valutazione di questo in modo seriale può fornire potenziali bersagli e consentire la valutazione degli interventi terapeutici. Non dimenticare che lavorare con qualsiasi macaco infetto da virus può essere estremamente pericoloso.

Dovrebbero essere disponibili precauzioni come un'adeguata formazione per i rischi biologici, incluso l'herpesvirus 1 del macaco, adeguati dispositivi di protezione individuale, kit per morsi e graffi e un adeguato follow-up medico.