Valutazione primaria Blast effetti In Vitro

L'obiettivo generale di questo metodo è generare onde d'urto rappresentative che possono verificarsi durante gli eventi di esplosione e valutare l'impatto di questo shock meccanico sulla vitalità delle cellule primarie in coltura. Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande chiave relative alla risposta dei singoli tipi di cellule a eventi ad alta energia come l'esposizione a un'onda d'urto. Il vantaggio principale di questo metodo è che ci consente di valutare risposte cellulari distinte a una singola onda d'urto rispetto alle risposte a livello di tessuto o di organo.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono all'identificazione dei meccanismi cellulari alterati a seguito di lesioni da esplosione primaria, che sono causate dall'esposizione a un'onda d'urto. Sebbene questo metodo sia stato dimostrato con un tipo di cellula specifico di interesse, qualsiasi cellula può essere coltivata e inserita all'interno della configurazione di test per valutare le risposte specifiche della cellula a un'onda d'urto. Per iniziare, coltiva la linea cellulare di interesse in coltura standard fino a raggiungere l'80% di confluenza.

Quindi, aspirare il terreno. Lavare le cellule due volte con PBS e aggiungere due millilitri di tripsina-EDTA. Incubarli in condizioni di coltura standard per cinque minuti.

Controllare brevemente che le cellule si siano dissociate correttamente dal pallone. E poi aggiungere quattro millilitri di terreno di coltura contenente FBS al pallone per neutralizzare la tripsina e trasferire le cellule in una provetta conica da 15 millilitri. Centrifugare le celle a 200 volte g per quattro minuti per pellettare le cellule.

Quindi, aspirare lentamente il surnatante facendo attenzione a non rimuovere il pellet. E risospendere il pellet in cinque millilitri di terreno. Metti tre piatti da 35 millilitri etichettati all'interno di un piatto da 90 millilitri.

Quindi, aggiungi due millilitri di terreno a ciascun piatto e seminali ciascuno con 70 mila cellule. Incubare le cellule durante la notte per consentire un adeguato attaccamento delle cellule prima di esporle all'onda d'urto. Prima di iniziare il montaggio del tubo antiurto, indossare i dispositivi di protezione individuale adeguati, inclusi stivali da lavoro con punta in acciaio e un camice da laboratorio.

Inizia inserendo due barre di allineamento attraverso i fori dei bulloni che si trovano sul piano orizzontale della flangia di uscita. Quindi, posizionare un foglio di guarnizione in gomma nitrilica sull'estremità delle barre di allineamento in modo che si trovi tra la flangia di uscita e il rig di coltura di organi ex vivo. Fissare il rig EVOC alla flangia di uscita del tubo dell'ammortizzatore facendo scorrere il dispositivo sulle barre di allineamento.

Assicurarsi che sia orientato correttamente in modo che la sezione che contiene la piastra di Petri si trovi alla sua base. Quindi, inserire quattro bulloni e rondelle M24 nei fori rimanenti e serrare saldamente i dadi e i bulloni in sequenza in modo diagonalmente simmetrico, controllando visivamente che il rig EVOC e il tubo dell'ammortizzatore siano allineati correttamente. Quindi, collegare un trasduttore di pressione al rig EVOC e collegarlo alla sorgente di corrente utilizzando un cavo del sensore.

Inoltre, utilizzare un cavo BNC per collegare la sorgente di corrente all'oscilloscopio. Assicurarsi che tutte le valvole di sfiato e i controlli di flusso sul tubo dell'ammortizzatore siano chiusi. Quindi, aprire l'aria compressa esterna incorporata e ruotare manualmente il regolatore di pressione in senso orario per caricare il solenoide a 2,5 bar.

Aprire la bombola dell'aria compressa, quindi ruotare lentamente il regolatore di pressione in senso orario per aumentare la pressione a circa 15 bar. Quindi, preparare i diaframmi tagliando un foglio di plastica spesso 0,125 millilitri in quadrati di 10 centimetri per 10 centimetri. Crea maniglie con del nastro adesivo e fissale alla parte superiore e inferiore del diaframma.

Usali per posizionare con cura il diaframma vicino alla piccola flangia anteriore vicino alla camera di culatta. Assicurarsi che il diaframma sia dritto e posizionato correttamente prima di chiudere la culatta. E poi fissarlo in posizione utilizzando quattro bulloni e dadi M24.

All'interno della cappa sterile, preparare membrane adesive permeabili ai gas in modo che ciascuna sia abbastanza grande da coprire la parte superiore di una capsula di Petri da 35 millilitri. Quindi, trasferire nella cappa una piastra di Petri da 90 millilitri contenente tre campioni sperimentali. Aspirare il terreno da una delle piastre e coprirlo con due sezioni della membrana, assicurandosi che ci sia una tenuta ermetica tra la membrana e il bordo della capsula.

Trasferire il campione sul rig EVOC e fissarlo alla base dell'attrezzatura in modo che la parte superiore del piatto sia allineata con la base interna del tubo d'urto. A questo punto, indossa cuffie antirumore, occhiali protettivi, stivali di sicurezza e un camice da laboratorio. Pressurizzare il sistema di tubi dell'ammortizzatore ruotando la manopola di controllo del flusso sul regolatore in senso orario.

Nella parte inferiore del pannello di controllo, selezionare l'ingresso della doppia culatta per un'onda d'urto di breve durata o l'ingresso del tubo di trasmissione per una maggiore durata dell'onda. Quindi, accendere la fonte di alimentazione CC e l'oscilloscopio per richiedere i dati della forma d'onda. Quindi, accendi le luci di sicurezza utilizzando l'interruttore sulla parete di fronte al pannello di controllo per avvisare gli altri ricercatori di non entrare nella stanza quando il tubo d'urto è in carica.

Sulla scatola di controllo del solenoide, premere l'interruttore per chiudere il solenoide. Quindi, sul pannello di controllo, aprire lentamente il controllo del flusso ruotando la manopola in senso antiorario per aumentare gradualmente la pressione all'interno della camera di compressione. Quando viene raggiunta la pressione di scoppio del diaframma, il diaframma si rompe e si sente un botto.

Una volta udito questo rumore, chiudere rapidamente la manopola di controllo del flusso. Quindi, aprire il solenoide spegnendo l'interruttore sulla scatola di controllo del solenoide e spegnere la luce di sicurezza. Trasferire il campione di cellule nella cappa sterile.

Lì, rimuovere la membrana adesiva permeabile ai gas e riempire il piatto con due millilitri di terreno di coltura fresco. Aggiungere 200 microlitri di reagente indicatore redox a ciascun piatto sperimentale subito dopo averli riempiti con due millilitri di terreno di crescita fresco. Quindi, trasferire il piatto in un'incubatrice standard per quattro ore.

Dopo l'incubazione, trasferire due aliquote da 100 microlitri da ciascuna piastra in un'appropriata piastra da 96 pozzetti. Leggere la piastra su un lettore di piastre a fluorescenza, quindi esportare e salvare i dati. Per l'imaging fluorescente di cellule vive e morte, le cellule devono essere inizialmente piastrate su un vetrino di vetro all'interno delle piastre di coltura da 35 millilitri.

Dopo il trattamento con onde d'urto, aspirare il terreno e lavare le cellule due volte in un millilitro di PBS. Quindi, trasferire 100 microlitri di reagente vivo morto dal kit di imaging a ciascun campione. E incubare le cellule e il reagente a temperatura ambiente, proteggerlo dalla luce per 15 minuti.

Dopo l'incubazione, rimuovere il reagente e lavare le cellule una volta utilizzando un millilitro di PBS. Utilizzando una pinza a punta fine, rimuovere con cautela il vetrino coprioggetto dal piatto da 35 millilitri e posizionarlo a faccia in giù su un vetrino per microscopia. Acquisisci immagini per ogni campione utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di una lente obiettivo 5X con un'apertura numerica di 0,25.

Quindi, utilizza il software di analisi delle immagini per contare manualmente o automaticamente il numero di cellule verdi vive e di cellule morte rosse da ciascuna immagine. Utilizzando il metodo qui descritto, le cellule cresciute in un monostrato sono state esposte alle onde d'urto generate con un tubo d'urto. I sensori nel tubo d'urto visualizzano i profili di pressione osservati in diverse posizioni lungo il tubo.

Utilizzando un test di indicazione redox, è stato riscontrato che l'applicazione di un'onda d'urto di 127 kilopascal è stata in grado di ridurre significativamente la vitalità delle cellule della papilla dermica rispetto ai controlli dopo 24 ore in coltura. L'applicazione di un'onda d'urto di 72 kilopascal o meno non ha ridotto la vitalità. A sostegno di queste osservazioni, un test di morte vive ha anche dimostrato una riduzione della vitalità cellulare in quelli esposti all'onda d'urto di 127 kilopascal rispetto al controllo.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in modo rapido e variabile a una velocità di 60 campioni all'ora. Il tubo d'urto può essere utilizzato per generare onde d'urto per esplorare una serie di lesioni primarie da esplosione. Questi possono variare dal polmone blastico fino all'ossificazione eterotopica, che è la formazione inappropriata di osso all'interno dei tessuti molli del corpo.

Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare i rischi connessi quando si lavora con gas compressi e onde d'urto ad alta energia e seguire sempre le corrette linee guida di sicurezza. Piccole modifiche in un tubo d'urto possono permetterci di alterare l'onda d'urto. Possiamo quindi valutare la risposta cellulare a diversi profili di pressione e intensità, che rappresentano diversi scenari di esplosione.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire il sequenziamento di nuova generazione per rispondere a ulteriori domande di ricerca, come ad esempio: in che modo l'esposizione a un'onda d'urto altera la nostra iscrizione naturale all'interno delle cellule?