Name: In Ovo Electroporation nel Brainstem Auditory del pollo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Scopri l'elettroporazione in ovo nel tronco encefalico uditivo del pollo per controllare l'espressione genica. Questo metodo innovativo aiuta a studiare lo sviluppo dei neuroni uditivi e i fenomeni fisiopatologici associati.

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Ringraziamo i dottori. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria e la signora Ximena Optiz-Araya per l&#39;assistenza iniziale con il set-up del protocollo e per la fornitura di plasmidi. Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione NIH / NIDCD DC013841 (JTS).

Tutte le procedure sono state approvate dai comitati di istruzione e tutela degli animali istituzionali dell&#39;Università Northwestern e sono stati eseguiti in conformità alle istruzioni nazionali di istruzione per la cura e l&#39;uso degli animali da laboratorio. 1. Gestione dell&#39;uovo <ol><li> Acquistate uova fecondate da un venditore locale. Conservare le uova a 13 ° C in frigorifero per non più di 5 giorni prima dell&#39;incubazione. La vitalità dell&#39;embrione diminuisce significativamente dopo una settimana. </li><li> Girare ogni uovo con il 70% di etanolo prima di impostare nell&#39;incubatrice. </li><li> Impostare 1-2 dozzine di uova sui loro lati in un incubatore con la temperatura impostata a 38 ° C a ~ 50% di umidità. Ciò garantisce rispettivamente il posizionamento appropriato dell&#39;embrione per l&#39;elettroporazione e la resistenza ottimale. NOTA: Dopo 48-52 h di incubazione, le uova saranno a Hamburger-Hamilton (HH) stadio ~ 12-13 e pronte per l&#39;elettroporazione. </li></ol> 2. Preparazione <ol><li> Plasmide Mixing <ol><li> Aggiungere 1 μl di 0,1% verde veloce (0,1% in 18 MΩ deionizzati e distillati H 2 O [ddH 2 O]) per ogni 7 μL di miscela DNA. </li><li> Per la co-elettroporazione di plasmidi multipli, mescolare i plasmidi in un rapporto 1: 1. La concentrazione finale del DNA dovrebbe essere di 5-8 μg / μL. </li></ol></li><li> Riempire la pipetta di iniezione <ol><li> Tirare pipette su un estrattore a micropipetti. Riempire la pipetta con 1-2 μL di plasmidi utilizzando un ago 28G a siringa. </li><li> Piegare la punta della pipetta a 10 - 20 μm utilizzando le pinze. Utilizzare un microscopio per aiutare a determinare la dimensione della punta pipetta rotta. Fissare la pipetta sul supporto della pipetta del picospritzer. </li></ol></li></ol> 3. Windowing NOTA: La procedura di finitura è stata pubblicata prima del 13 . Per ulteriori informazioni visive, vedere il riferimento 13. <ol><li> Pulire tutti gli strumenti e l&#39;area di lavoro con il 70%etanolo. </li><li> Prendere il numero desiderato di uova impostate dall&#39;incubatrice (tra 6-10), lasciare a temperatura ambiente e nuovamente sostituire le uova con il 70% di etanolo. Le uova rimangono vitali per almeno 2 ore dopo la rimozione dell&#39;incubatrice. </li><li> Posizionare l&#39;uovo in cima ad un illuminatore luminoso per identificare il posizionamento degli embrioni. Cerchi il centro della zona oscura ( cioè , embrione) con una matita. </li><li> Usando un ago da 19G, pungere un buco nella fine punta dell&#39;uovo. </li><li> Punta un altro foro vicino al cerchio disegnato sul lato appuntito dell&#39;uovo. Rimuovere un piccolo pezzo del guscio d&#39;uovo esterno (circa 16 mm 2 ) con l&#39;ago 19G e quindi rimuovere un piccolo pezzo di guscio d&#39;uovo interno (circa 8 mm 2 ) con le pinze. </li><li> Con una siringa da 3 ml dotata di ago da 19G, prelevare 1,5-2,5 ml di albumina dall&#39;uovo attraverso il foro a punta. Assicurarsi di inclinare l&#39;ago a 45 °. </li><li> Coprire il foro a punta aperta con un piccolo pezzo di nastro (1 cm x 1 cm). Coprire il cerchio disegnato aD il secondo foro con nastro (2,5 cm x 4 cm). </li><li> Con forbici curve (bordo di taglio = 2,5 cm), tagliare una finestra all&#39;interno del cerchio. Forbici devono essere parallele al guscio d&#39;uovo e il diametro della finestra dovrebbe essere inferiore a 2 cm. </li></ol> 4. Iniezione del plasmide <ol><li> Accendere il picospritzer. Impostare la pressione a 18 psi e la durata a 5 μs. Accendere il serbatoio dell&#39;aria e la lampada per il microscopio di dissezione. </li><li> Preparare una soluzione di 30 ml di una diluizione 1:10 di inchiostro indiano acquistato in negozio mescolato in soluzione salina fosfata tamponata sterile (PBS). Conservare a 4 ° C. L&#39;iniezione dell&#39;inchiostro indiano è un passo importante per ottenere una migliore visualizzazione dell&#39;embrione di pollo. <ol><li> Riempire una siringa da 1 ml con la soluzione di inchiostro indiana diluita. Fissare un ago 27G ed espellere tutte le bolle presenti nella siringa. </li><li> Inserisci l&#39;ago appena sotto la membrana di tuorlo ~ 2 - 3 mm dall&#39;embrione e inietta ~ 0,2 ml di inchiostro indiano delicatamente sotto l&#39;embrione. FareNon iniettare più di 0,5 ml dell&#39;inchiostro indiano in quanto potrebbe diminuire la sopravvivenza dell&#39;embrione. </li></ol></li><li> Posizionare l&#39;uovo finestra su un supporto di uova sotto il microscopio di dissezione. Utilizzate l&#39;ingrandimento più elevato per ottenere una migliore visualizzazione del sito di iniezione del plasmide. </li><li> Usando le pinze, rimuovere la membrana nell&#39;area di iniezione. Le regioni di interesse cerebrale uditivo di interesse (NM, NL) derivano dai Rhombomers 5 e 6 (R5 / R6). R5 / R6 si trovano adiacenti agli otocisti (una struttura embrionale in vertebrati che si sviluppa nell&#39;orecchio interno) che servono da punto di riferimento per le iniezioni di plasmidi R5 / R6. </li><li> Abbassare la pipetta riempita di DNA nel tubo neurale sovrastante la regione R5 / R6 e tra gli otociti usando il micromanipolatore. Uno schema di posizionamento ideale è mostrato in Figura 1A . </li><li> Applicare la pressione dell&#39;aria (18 psi, 5 μs di durata) dal picospritzer per espellere il DNA nel tubo neurale. </li></ol> 5. Elettroporazione <ol><li> Accendere tStimolatore corrente / tensione. </li><li> Riempire una siringa da 3 ml con PBS e fissare il filtro della siringa. Aggiungere 1-2 gocce di PBS sull&#39;embrione. </li><li> Abbassare l&#39;elettrodo bipolare sull&#39;embrione utilizzando il micromanipolatore con l&#39;elettrodo negativo sopra il sito di iniezione (mediale) e l&#39;elettrodo positivo lateralmente all&#39;R5 / R6 ( Figura 1A ). Evitare il contatto diretto con l&#39;embrione. Usare elettrodi bipolari in cui il materiale dell&#39;elettrodo è iridio di platino. Regolare la distanza tra le punte a 0,5 mm con le pinze. </li><li> Usando uno stimolatore di corrente / tensione, impulsi 20 volte a 50 V per 1 ms a intervalli di 1 s. </li><li> Dopo l&#39;elettroporazione, aggiungere una goccia di PBS sopra l&#39;area esposta. Rimuovere delicatamente l&#39;elettrodo e pulirlo con un tessuto di laboratorio e il 70% di etanolo. Chiudere la finestra che espone l&#39;embrione con nastro. </li><li> Etichetta guscio d&#39;uovo con il tipo di plasmide iniettato e la data di apertura. </li><li> Riporre le uova in incubatore con il lato rivolto verso l&#39;alto. Incubare a 38 ° C con 50% Di umidità fino a raggiungere la fase di sviluppo desiderata. </li><li> Se un vettore tet-on è elettroporato per il controllo temporale dell&#39;espressione genica, applicare Doxycycline (Dox) ogni 24 h per indurre l&#39;espressione del gene (vedere Sezione 6). </li></ol> 6. Sistema Tet-on per il controllo temporale dell&#39;espressione di geni <ol><li> Utilizzare i seguenti plasmidi: PCAGGS-T2TP: un plasmide esprimente di transposasi. PT2K-CAGGS-rtTA-M2: un plasmide che esprime in modo stabile la proteina legante Dox. PT2K-BI-TRE-EGFP: un plasmide che contiene un promotore bidirezionale di tet-on (TRE) -dirivante espressione del reporter di EGFP e di un secondo gene di interesse. NOTA: i tre plasmidi di cui sopra devono essere co-elettroporati in un rapporto 1: 1: 1. </li><li> Preparazione della soluzione di base: <ol><li> Sciogliere Dox in PBS sterile per produrre una soluzione di stock di 1 mg / ml. Conservare a -20 ° C. </li></ol></li><li> Applicazione Dox: <ol><li> Per indurre l&#39;espressioneN del gene di interesse durante alcune fasi di sviluppo, applicare Dox ogni 24 h. </li><li> Quando si applica Dox, prelevare l&#39;uovo, aprire la finestra, pipettare 50 μL Dox sulla membrana chorioallointoica, chiudere la finestra e mettere l&#39;uovo in incubatore. </li></ol></li></ol> 7. Preparazione dell&#39;area di dissection per le fette del Brainstem NOTA: Le seguenti sezioni (7 - 9) e le procedure sono state pubblicate prima del 14 . Consultare questi riferimenti per ulteriori informazioni visive. <ol><li> Preparare una soluzione agar (40 mg / mL agarosio, ossia 4% in ddH2O). Versare la soluzione agarica in un piatto di Petri e lasciarlo solidificare a temperatura ambiente. Conservare la piastra agar coperta in frigorifero per un uso futuro durante la tranciatura del tessuto cerebrale. </li><li> Fluido spinale cerebrale artificiale (ACSF) con 95% O 2 e 5% CO 2 (pH 7,2-7,4 e osmolarità: 295-310 mOsm / L).</li><li> Pulire l&#39;area di lavoro e vibratome con il 70% EtOH e sciacquare la lama con acqua distillata. </li><li> Mettere un rilievo di assorbimento del liquido pulito sull&#39;area di lavoro con strumenti appropriati di dissezione. </li><li> Prendete il piatto agar fuori dal frigorifero, tagliate un piccolo cubo di agar (10 mm x 10 mm x 8 mm). Incollare il blocco agar allo stadio di una camera di taglio vibratome utilizzando superglue commercialmente disponibili. </li></ol> 8. Isolamento del Brainstem auditory del pollo <ol><li> Apri l&#39;uovo al sito della finestra con tappa. Puntare il sacchetto di membrana con un bisturi e togliere la testa dell&#39;embrione di pollo. </li><li> Decapitate il pollo con forbici affilate. </li><li> Posizionare la punta della lama del rasoio leggermente posteriore agli occhi. Incise attraverso il cranio alla linea mediana rostral-caudale. Applicare una leggera pressione a seconda dell&#39;età dell&#39;embrione. Gli embrioni più anziani richiedono maggiore pressione. </li><li> Spingere delicatamente la pelle e le piume per esporre il cranio e verificare la taglia della linea mediana. </li><li> Applicare sPressione del tronco, tagliare la porzione rostrale del cranio con una lama di rasoio. Immediatamente posizionare la lama posteriore agli occhi e tagliare tutto il cranio e il tessuto cerebrale. </li><li> Fare incisioni midline-to-lateral con forbici nella zona caudale del cranio, leggermente anteriori ai muscoli del collo su entrambi i lati della testa. Esponete il cervello e il cervelletto tirando via il cranio e il tessuto in eccesso. </li><li> Tagliare il tessuto attaccato al tronco cerebrale con forbici e rimuovere il tronco cerebrale, che si libera liberamente dal cranio. </li></ol> 9. Preparazione delle fette del Brainstem per l&#39;elettrofisiologia o l&#39;imaging in vivo <ol><li> Infilare il cervello attraverso la tecnica ottica. </li><li> Rimuovere il cervelletto tagliando peduncle con forbici, esponendo il pavimento del quarto ventricolo. </li><li> Usando le pinzette, rimuovete i tessuti membranosi e i vasi sanguigni dalla superficie cerebrale. </li><li> Per bloccare il sistema cerebrale, fare un taglio orizzontale all&#39;estremità più rostrale del pavimento dei quattroVentricolo, appena caudale alla corteccia. Fare tagli laterali perpendicolari attraverso l&#39;ottica tecta per isolare il sistema cerebrale. </li><li> Posizionare una piccola quantità di colla super sullo stadio vibrativo direttamente di fronte al blocco agar. </li><li> Sollevare il tronco cerebrale al midollo spinale usando le pinzette e posizionarlo sulla colla super con il lato rostralo verso il basso e il lato dorsale verso la lama vibratome. Rimuovere la colla in eccesso con un tessuto di laboratorio o carta filtrante. </li><li> Versare l&#39;ACSF ossigenato nella fase vibratome. Impostare la lama del vibratore ad un angolo di 20-22 °. Avviare il vibratore ad oscillazione massima-ampiezza. Spostare il palco verso la lama in modo che la parte superiore del tessuto sia parallela alla lama. </li><li> Spostare rapidamente la lama verso il tessuto cerebrale. Rallenta lentamente la lama prima del contatto della lama con il tessuto. </li><li> Togliere il tessuto con la velocità di avanzamento più lenta possibile. Una volta che la lama attraversa l&#39;intera sezione del tessuto coronale, rimuovere delicatamente la fetta usando una pipetta di trasferimento/ Li&gt; <li> Abbassare lo stadio 200-300 μm e tagliare di nuovo. Ripetere fino a quando non saranno visibili punti di riferimento anatomici dei nuclei uditivi, ad esempio la distinta regione nervosa dorsale / ventrale della NL e la posizione media di NM rispetto alla NL. </li><li> Conservare con attenzione le fette in ACFS. Ciò può essere fatto a temperatura ambiente (22 ° C) o vicino a condizioni fisiologiche (~ 41 ° C) usando un bagno d&#39;acqua caldo. Notare l&#39;ordine di affettatura. La prima fetta corrisponde alla regione più caudale del tessuto e l&#39;ultima fetta corrisponde alla regione più rostrale. Questo rappresenta approssimativamente l&#39;organizzazione tonotopica del sistema cerebrale uditivo, da regioni di codifica a bassa frequenza ad alta frequenza. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

L&#39; elettroporazione in ovo è un metodo per esprimere o abbattere i geni di interesse per analizzare la funzione genica in vivo 8 , 9 . Nell&#39;embrione di pollo, è un metodo innovativo per esprimere geni codificati da plasmide in diverse regioni del sistema cerebrale uditivo 8 . Per garantire un&#39;espressione ottimale, sono necessari diversi passaggi critici. In primo luogo, solo iniettare gli embrioni le...

La codifica neurale veloce del suono è essenziale per le normali funzioni uditive. Queste includono abilità di localizzazione sonora 1 , discorso in discriminazione di rumore 2 e comprensione di altri segnali di comunicazione rilevati dal comportamento 3 . I neuroni analoghi situati nel sistema cerebrale uditivo sia degli aviani che dei mammiferi sono altamente specializzati per la codifica neuronale veloce 4 . Questi includono il nucleo di pollo magnocellularis (NM), il nucleo laminaris (NL) ei loro analoghi dei mammiferi, il nucleo cocleare anteroventrale (AVCN) e l&#39;olio superiore mediale (MSO) rispettivamente 5 . Tuttavia, i meccanismi di sviluppo che regolano la codifica neuronale veloce sono poco compresi nel sistema cerebrale uditivo. Pertanto è vantaggioso studiare geni specifici responsabili della codifica veloce veloce al fine di comprendere meglio la loro espressione, regolazione e funzionalità in auLo sviluppo dei dati. L&#39;embrione di pollo in fase di sviluppo è uno strumento di ricerca efficace e consolidato per studiare le questioni biologiche fondamentali dello sviluppo del sistema uditivo 6 , 7 . Recenti progressi molecolari hanno affrontato queste questioni biologiche nell&#39;embrione di pollo in fase di sviluppo esprimendo o abbattendo geni di interesse per analizzare la funzione genica in vivo 8 , 9 . Indagare sul ruolo di regolamentazione di geni specifici è un progresso significativo nella comprensione delle patologie associate a deficit auditari. Qui presentiamo l&#39;elettroporazione in ovo di geni codificati da plasmide nel tronco uditivo del pollo dove si verifica una veloce codifica neurale del suono 10 . Targetando regioni neuroni uditive uditive associate ai rombomeri 5 e 6 11 , 12 (R5 /R6), mostriamo il controllo spaziale della transfezione plasmida in NM e NL. Inoltre, mostriamo la regolazione temporale dell&#39;espressione adottando un sistema vettoriale tet-on. Si tratta di una procedura indotta da droga che esprime i geni di interesse in presenza di doxiciclina (Dox) 8 .

<table><tbody><tr><td>Uova di gallina livornese bianca fecondate</td><td>Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Hannifin</td><td>052-0500-900</td><td>Picospritzer III, stimolatore di corrente/tensione a canale singolo o doppio</td></tr><tr><td>Grass</td><td>Technologies</td><td>SD9</td><td>SD9</td></tr><tr><td>Aghi per siringa Microfil</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G67-5</td><td>calibro 28, lunghezza 67 mm, (confezione da 5)</td></tr><tr><td>Portaelettrodo</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1280</td><td>MP Serie: Pressione non elettrica Applicazioni</td></tr><tr><td>Microelettrodo stimolante</td><td>FHC</td><td>PBSA1075</td><td>PBSA1075</td></tr><tr><td>Serbatoio/regolatore d'aria</td><td>NU Servizi</td><td></td> di laboratorio <td>Asciugatura all'aria 300 CF</td></tr><tr><td>Verde veloce</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7258-25G</td><td>F7258-25G</td></tr><tr><td>Nastro di plastica trasparente</td><td>Scotch</td><td>191</td><td></td></tr><tr><td>Doxiciclina iclilato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Frigorifero per uova</td><td>Vissani Frigorifero</td><td></td> per vino <td>13,3 - 16,1 gradi; C (56-61&deg; F)</td></tr><tr><td>Incubatrice</td><td>Hova-Bator</td><td></td><td>38 gradi C (100 &deg; F), ~50% di umidità</td></tr><tr><td>Oscilloscopio di dissezione</td><td>Zeiss</td><td>4.35E+15</td><td>SteREO Discovery, microscopio V8, 50.4X</td></tr><tr><td>Sorgente di luce fredda</td><td>Zeiss</td><td>4.36E+15</td><td>CL6000</td></tr><tr><td>Micromanipolatori</td><td>LED Narishige Giappone</td><td>Modello: MM-3</td><td>2 Micromanipolatori</td></tr><tr><td>Tubi capillari</td><td>Strumento Sutter</td><td>BF150-86-10</td><td>Borosilicato a pareti spesse (dimensioni)</td></tr><tr><td>Siringhe</td><td></td><td></td><td>da 1 mL, aghi da 3 mL</td></tr><tr><td>BD</td><td>Precision Glide&nbsp;</td><td></td><td>27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2</td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Stoelting</td><td></td><td>No. 5 Super Fine Dumont</td></tr><tr><td>Porta uova</td><td>Su misura</td><td></td><td>Anche la base in argilla funziona altrettanto bene</td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette</td><td>Strumento Sutter Modello</td><td></td><td>P-97</td></tr><tr><td>Filtro per siringa</td><td>Ultra Cruz</td><td>sc-358811</td><td>PVDF 0,22 &mu; m</td></tr></tbody></table>

in ovo electroporation nel brainstem auditory del pollo

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

L&#39;elettroporazione è un metodo che introduce geni di interesse in organismi biologicamente rilevanti come l&#39;embrione di pollo. È da tempo stabilito che l&#39;embrione di pollo è un modello di ricerca efficace per studiare le funzioni biologiche di base dello sviluppo del sistema uditivo. Più di recente, l&#39;embrione di pollo è diventato particolarmente prezioso nello studio dell&#39;espressione genica, della regolazione e della funzione associata all&#39;udito. L&#39; elettroporazione in ovo può essere impiegata per individuare le regioni del sistema cerebrale uditivo responsabili di funzioni uditive altamente specializzate. Queste regioni includono il nucleo di pollo magnocellularis (NM) e nucleo laminaris (NL). Neuroni NM e NL derivano da precursori distinti di rombomeri 5 e 6 (R5 / R6). Qui, presentiamo l&#39;elettroporazione in ovo in geni codificati da plasmidi per studiare proprietà correlate al gene in queste regioni. Mostriamo un metodo per il controllo spaziale e temporale dell&#39;espressione genica che favorisce il guadagno o la perdita di fenotipo funzionalees. Targetando regioni di progenitor neurali uditive associate a R5 / R6, mostriamo la transfezione plasmida in NM e NL. La regolazione temporale dell&#39;espressione genica può essere ottenuta adottando un sistema vettoriale tet-on. Si tratta di una procedura indotta da droga che esprime i geni di interesse in presenza di doxiciclina (Dox). La tecnica di elettroporazione in ovo , insieme con i test funzionali biochimici, farmacologici e in vivo , fornisce un approccio innovativo per lo studio dello sviluppo del neurone uditivo e dei fenomeni patofisiologici associati.

Qui mostriamo che l&#39;elettroporazione in ovo consente l&#39;espressione genica in un sistema biologico normalmente sviluppato. I geni codificati con plasmide vengono iniettati focalamente nel tubo neurale sovrastante R5 / R6. Un esempio schematico delle posizioni dell&#39;elettrodo e delle pipette relative a importanti marcatori anatomici è mostrato nella figura 1A . La posizione corretta dell&#39;iniezione del plasmide è confermata 24 h dopo l&#39;elettropor...

I neuroni uditivi uditivi degli aviani e dei mammiferi sono specializzati per la codifica neuronale veloce, un processo fondamentale per le normali funzioni uditive. Questi neuroni nascono da precursori distinti dell&#39;indietro embrionale. Presentiamo tecniche che utilizzano elettroporazione per esprimere i geni nell&#39;hindbrain degli embrioni di pollo per studiare la funzione genica durante lo sviluppo uditivo.

In Ovo Electroporation nel Brainstem Auditory del pollo

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

L'obiettivo generale di questa procedura è controllare spazialmente e temporalmente l'espressione genica nel tronco encefalico uditivo del pollo. L'utilizzo dell'elettroporazione in ovo fornisce un approccio innovativo per studiare lo sviluppo dei neuroni uditivi e i fenomeni patofisiologici associati. Questa procedura può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo dello sviluppo neuronale uditivo, ad esempio in che modo il controllo dell'espressione genica promuove un guadagno o una perdita di fenotipo necessari per uno sviluppo normale del tronco encefalico uditivo.La procedura sarà dimostrata dal dottor Ting Lu, ricercatore postdottorato del mio laboratorio. Per iniziare, preparare le soluzioni di plasmide aggiungendo un microlitro di soluzione Fast Green per ogni sette microlitri di miscela di DNA. Successivamente, mescolare le soluzioni di DNA in rapporto uno a uno per l'elettroporazione simultanea di più plasmidi.Una volta preparata la soluzione del plasmide, preparare le pipette con un estrattore per micropipette. Successivamente, utilizzare un ago da siringa da 28 gauge per riempire la pipetta con uno o due microlitri della soluzione del plasmide. Utilizzando pinzette, rompere la punta della pipetta fino a raggiungere una dimensione compresa tra 10 e 20 micron e determinare la dimensione della punta rotta al microscopio, quindi collegare la pipetta a un picospritzer tramite un supporto per pipetta.Prima della procedura, conservare le uova acquistate da un fornitore locale per non più di cinque giorni in frigorifero a 13 gradi Celsius. Per iniziare, disinfettare l'uovo con etanolo al 70%, quindi, per ottenere un corretto posizionamento dell'embrione, incubare l'uovo di lato a 38 gradi Celsius e un'umidità di circa il 50% per garantire una viabilità ottimale. Dopo 48-52 ore di incubazione, quando l'uovo raggiunge lo stadio Hamburger-Hamilton compreso tra 12 e 13, disinfettare l'area di lavoro e tutti gli strumenti con etanolo al 70%.Quindi rimuovere l'uovo dall'incubatrice, lasciarlo a temperatura ambiente e pulirlo con etanolo al 70% per la seconda volta. Utilizzando un illuminatore, identificare la posizione dell'embrione, visibile come un'area scura, e con una matita segnare il centro tracciando un cerchio intorno ad esso. Praticare un foro all'estremità arrotondata dell'uovo con un ago da 19 gauge, quindi realizzare un secondo foro vicino al cerchio disegnato all'estremità appuntita dell'uovo.Utilizzare un ago da 19 gauge per rimuovere una piccola porzione del guscio esterno dell'uovo e, con una pinzetta, rimuovere una piccola parte della membrana interna del guscio. Successivamente, inserire un ago da 19 gauge collegato a una siringa da tre millilitri attraverso il foro all'estremità arrotondata dell'uovo ed estrarre da 1,5 a 2,5 millilitri di albume. Coprire il foro all'estremità arrotondata dell'uovo con un pezzo di nastro adesivo di un centimetro per un centimetro e quindi coprire il cerchio tracciato e il secondo foro con un pezzo di nastro adesivo di 2,5 centimetri per quattro centimetri.Utilizzando forbici curve con un bordo tagliente di 2,5 centimetri e mantenendole parallele al guscio dell'uovo, escindere una finestra all'interno del cerchio segnato. Per iniettare il plasmide, accendere il picospritzer e regolare lo strumento in modo da applicare una pressione di 18 PSI per cinque microsecondi, quindi accendere la bombola dell'aria e la lampada per il microscopio stereoscopico. Successivamente, preparare 30 millilitri di una soluzione madre di inchiostro di India acquistato in commercio in PBS sterile.Aspirare la soluzione di inchiostro di India in una siringa da un millilitro, quindi applicare un ago da 27 gauge ed eliminare eventuali bolle d'aria presenti nella siringa. Per visualizzare l'embrione, inserire l'ago appena al di sotto della membrana del tuorlo, a circa due-tre millimetri dall'embrione, e iniettare circa 0,2 millilitri di inchiostro di India. Successivamente, trasferire l'uovo con finestra in un portauovo posizionato sotto il microscopio stereoscopico e passare all'ingrandimento più alto per ottenere la migliore visione del sito di iniezione del plasmide.Rimuovere con una pinzetta la membrana che ricopre l'area di iniezione. Individuare gli otoisti e utilizzarli come punti di riferimento per identificare i rombomeri cinque e sei, situati nelle vicinanze, dai quali originano il nucleo magnocellulare e il nucleo laminare. Utilizzando un micromanipolatore, posizionare la pipetta contenente il DNA nel tubo neurale sovrastante la regione R5-R6, situata tra gli otoisti.Eiettare il DNA nel tubo neurale utilizzando il picospritzer. Per iniziare l'elettroporazione, accendere lo stimolatore di tensione, quindi applicare un filtro per siringa da 0,22 micron a una siringa da tre millilitri precedentemente riempita con PBS ed aggiungere una o due gocce di PBS filtrato sull'embrione. Successivamente, avvicinare un elettrodo bipolare all'embrione mediante il micromanipolatore e posizionare l'elettrodo negativo sopra il sito di iniezione, mantenendo l'elettrodo positivo laterale rispetto ai segmenti R5-R6.Con lo stimolatore elettrico, applicare 20 impulsi di 50 volt per un millisecondo a intervalli di un secondo. Si osserveranno bolle vicino alla punta dell'elettrodo. Dopo l'elettroporazione, aggiungere una goccia di PBS sulla zona esposta, rimuovere delicatamente l'elettrodo e pulirlo con un fazzoletto da laboratorio e alcol al 70%, quindi coprire la finestra sopra l'embrione con del nastro adesivo.Infine, annotare il tipo di plasmide iniettato e la data di schiusa sul guscio dell'uovo, quindi posizionare l'uovo nell'incubatrice con il lato della finestra rivolto verso l'alto. Incubare le uova a 38 gradi Celsius con un'umidità del 50%, fino al raggiungimento dello stadio di sviluppo desiderato. Ventiquattro ore dopo l'elettroporazione, rimuovere l'uovo dall'incubatrice, aprire la finestra e, utilizzando un microscopio stereoscopico, verificare la corretta localizzazione dell'iniezione del plasmide bersaglio.Se sono stati utilizzati vettori tet-on, pipettare 50 microlitri di doxiciclina nella membrana corioallantoidea, chiudere la finestra e riposizionare l'uovo nell'incubatrice. Qui vengono presentate fotografie di una sezione del tronco encefalico preparata da un pollo al giorno embrionale 12, scattate in condizioni di illuminazione a contrasto di interferenza differenziale e di illuminazione fluorescente. All'interno della sezione del tronco encefalico è possibile riconoscere il nucleo magnocellulare e il nucleo laminare.Sotto illuminazione fluorescente, entrambe le strutture mostrano l'espressione della proteina fluorescente gialla, confermando un'espressione spaziale efficiente dei geni elettroporati. L'espressione del gene elettroporato può essere osservata anche in una sezione del tronco encefalico comprendente il nucleo magnocellulare, ottenuta da un pollo all'ottavo giorno embrionale. Quando ingrandita 80 volte, le tipiche corpi cellulari adendritici sono visibili sotto illuminazione a contrasto di interferenza differenziale.Corpi cellulari adendritici rivelano l'espressione della proteina fluorescente gialla, dimostrando ulteriormente che l'elettroporazione in ovo può indurre l'espressione genica in specifiche regioni del tronco encefalico uditivo per studi sullo sviluppo dei neuroni uditivi. Una volta padroneggiata e se eseguita correttamente, questa tecnica può essere completata in due o tre ore per circa 12 uova vitali. Dopo questa procedura, altri metodi come saggi funzionali biochimici, farmacologici e in vitro-in vivo possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande su come i fenotipi dell'espressione genica regolano lo sviluppo normale del tronco encefalico uditivo.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come controllare spazialmente e temporalmente l'espressione genica nel tronco encefalico uditivo del pollo. L'elettroporazione in ovo permette il controllo genetico delle specializzazioni anatomiche e fisiologiche, e di periodi temporali ben definiti nello sviluppo del tronco encefalico uditivo.

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Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

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Il tronco cerebrale uditivo pollo è costituita da nuclei responsabile per l'elaborazione del suono binaurale. Una preparazione singola fetta coronale mantiene l'intero circuito mentre l'approccio colto fornisce una preparazione unica di studiare lo sviluppo della struttura neuronale e della funzione uditiva a livello molecolare, cellulare e di rete.

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L'organo uditivo media l'udito. Qui presentiamo un metodo di micro-elettroporazione in ovo modificato ottimizzato per lo studio della proliferazione e della differenziazione delle cellule progenitrici uditive nell'organo uditivo del pollo in via di sviluppo.

Gene Transfer nel pollo Auditory Organ<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-elettroporazione

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Abbiamo usato tecniche standard di risposta uditiva del tronco cerebrale (ABR) e le abbiamo applicate ai polli da cova, un modello aviario precoce per la funzione uditiva. Il protocollo delinea in dettaglio le tecniche di preparazione degli animali e di acquisizione ABR, con passaggi che potrebbero tradursi in altri modelli aviari o roditori.

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Il pulcino è un organismo modello economico, accessibile e ampiamente disponibile per una varietà di studi. Qui, una serie di protocolli è dettagliata per comprendere i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo e della rigenerazione dell'orecchio interno aviario.

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Utilizzando l'elettroporazione in ovo , abbiamo ideato un metodo per trasfettare selettivamente l'orecchio interno uditivo e il nucleo cocleare negli embrioni di pollo per ottenere un knockdown specifico del gruppo cellulare della proteina di ritardo mentale X fragile durante periodi discreti di assemblaggio del circuito.

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Scopri l'elettroporazione in ovo nel tronco encefalico uditivo del pollo per controllare l'espressione genica. Questo metodo innovativo aiuta a studiare lo sviluppo dei neuroni uditivi e i fenomeni fisiopatologici associati.

In Ovo Electroporation nel Brainstem Auditory del pollo

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