Luce Scheda a base di microscopia a fluorescenza di vita o fissate e colorate Tribolium castaneum embrioni

L'obiettivo generale di questo protocollo è osservare lo sviluppo degli embrioni di Tribolium castaneum in modo non invasivo per periodi di tempo molto lunghi. La microscopia a fluorescenza basata su foglio luminoso aiuta a rispondere alle domande relative alla morfogenesi nell'organismo modello di insetto emergente Tribolium castaneum, che affronta i modelli di migrazione e proliferazione cellulare dal blastoderma precoce all'inizio del movimento muscolare. Il vantaggio principale di questo metodo è che i fattori critici come il fotosbiancamento e la fototossicità sono ridotti al minimo anche quando gli embrioni vengono osservati per diversi giorni.

Per montare un embrione nella camera del campione, utilizzando una colonna di agarosio, riempire prima una siringa da un millimetro con acqua distillata e utilizzare un piccolo tubo di gomma per collegare la siringa a un capillare di vetro. Riempi il capillare a metà con acqua distillata, quindi usa un pennello per trasferire un embrione sul lato interno dell'apertura del capillare di vetro e infila il capillare nell'agarosio liquido aspirando lentamente alcuni microlitri di agarosio insieme all'embrione nel capillare. Quando l'embrione è a posto, dovrebbero esserci alcuni microlitri di agarosio sia sopra che sotto l'embrione.

Quando l'agarosio si è solidificato accorciare il capillare ad una lunghezza di circa cinque millimetri. Il frammento rimanente deve essere completamente riempito di agarosio e l'embrione deve essere trovato all'interno del secondo quartile. Quindi inserire il cilindro d'acciaio con il perno nella camera del campione e attaccare il frammento capillare sopra il perno, la colonna di agarosio dovrebbe sporgere di alcuni millimetri dalla regione del frammento capillare che contiene l'embrione.

Per montare l'embrione nella camera del campione utilizzando un emisfero di agarosio, prelevare prima 200 microlitri di agarosio liquido in una siringa da un millimetro e utilizzare la siringa per riempire il tubo d'acciaio con la camera del campione con agarosio dalla parte superiore del tubo fino a quando non si forma un emisfero all'apertura inferiore. Quando l'agarosio si è solidificato, prelevare un embrione con la punta di un pennello e riorganizzare l'embrione in modo che l'estremità anteriore diventi accessibile. Immergere l'emisfero di agarosio in agarosio liquido per coprire l'emisfero con una pellicola sottile e posizionare l'embrione con l'estremità anteriore in posizione verticale sul polo dell'emisfero di agarosio.

Girare il tubo d'acciaio e utilizzare la spazzola per correggere la posizione dell'embrione, se necessario. Idealmente, meno della metà della superficie dell'embrione dovrebbe essere ricoperta di agarosio e i fianchi dovrebbero essere il più ripidi possibile. Troppo agarosio sulla superficie dell'embrione porta a una costrizione meccanica e a una riduzione dello scambio di gas e ioni, che ha un effetto drammatico sul tasso di sopravvivenza dell'embrione.

Quindi inserire lentamente il tubo d'acciaio nella camera del campione. Per montare l'embrione nella camera del campione utilizzando un supporto per ragnatele, selezionare prima un embrione con il pennello e mettere da parte il pennello. Quindi, coprire il foro scanalato del supporto della ragnatela con cinque-otto microlitri di agarosio liquido, quindi rimuovere la maggior parte dell'agarosio fino a quando non rimane solo una sottile pellicola di agarosio.

Posiziona l'embrione sulla pellicola di agarosio e regola la sua posizione spostando attentamente l'embrione al centro dell'asse x del foro scanalato e allineando il suo asse anteriore posteriore allungato con l'asse allungato del foro asolato. Assicurati di posizionare l'embrione sulla pellicola di agarosio entro 10-15 secondi dalla sua applicazione, cioè mentre l'agarosio è ancora liquido, altrimenti non si attaccherà correttamente. Quindi inserire lentamente il supporto Cobweb nella camera del campione posizionando il supporto in modo che non interferisca con l'eccitazione e l'emissione della luce.

Per i saggi di imaging dal vivo, configurare prima il time-lapse, quindi nella modalità di trasmissione della luce posizionare l'embrione lungo gli assi X e Y al centro del campo visivo senza esporre l'embrione al laser. Ruota l'embrione di 360 gradi in incrementi di 90 gradi per esaminare il tessuto alla ricerca di eventuali danni che potrebbero essersi verificati durante il processo di montaggio. Nella modalità di florescenza, definire lo Z-Stack per ogni direzione, aggiungendo un tampone spaziale da 25 a 50 micrometri davanti e dietro l'embrione e definire la spaziatura Z.

Per l'imaging a lungo termine, assicurarsi che la camera del campione sia riempita con una quantità sufficiente di tampone di imaging e coprire l'apertura della camera del campione. Quindi inizia il processo di imaging, monitorando la corretta acquisizione lungo tutte le direzioni in tutti i canali per tutti gli embrioni. Al termine del periodo di imaging, rimuovere il portacampione dalla camera del campione e trasferire l'embrione su un vetrino.

Se è stata utilizzata una colonna di agarosio, utilizzare una lama affilata per estrarre gli embrioni dall'agarosio circostante. Se è stato utilizzato un emisfero di agarosio, trasferire l'emisfero con un lato piatto sul vetrino dell'oggetto. Per il metodo del supporto della ragnatela, utilizzare un pennello per smontare delicatamente l'embrione dalla pellicola di agarosio.

Quindi incubare l'oggetto caricato con embrioni in un piccolo piatto di vetro in un'atmosfera di umidità satura in condizioni standard fino alla schiusa delle larve. Per elaborare i dati dell'embrione osservato, aprire i file di interesse nell'apposito software di analisi dell'imaging e ruotare gli Z-Stack per allineare l'asse anteriore posteriore dell'embrione con l'asse Y, se necessario. Ritaglia gli Z-Stack lungo gli assi X e Y in modo che rimanga solo uno sfondo minimo, quindi calcola la Proiezione Z Massima per ogni Z-Stack.

Quindi, a seconda della linea transgenica e delle modalità di imaging, effettuare le opportune regolazioni dinamiche dell'intensità dei time-stack per correggere eventuali fluttuazioni di fotosbiancamento o flora per espressione, se necessario. Utilizzando una linea transgenica che esprime una proteina di fusione Istone 2B M-Emerald sotto il controllo dell'alfa-tubublina un promotore, sono state registrate 66 ore di sviluppo embrionale a temperatura ambiente, dalla retrazione della banda germinale alla chiusura dorsale. Questa trappola potenziatrice può essere utilizzata per visualizzare i cluster neuronali all'interno delle appendici della testa e le dinamiche della migrazione della cirrosa durante la chiusura dorsale.

Imaging di una linea transgenica simile che porta lo stesso trans-gene ma in una posizione genomica diversa, le sezioni ottiche della transizione dalla gastrulazione all'allungamento della banda germinale mostrano la disposizione cellulare interna della banda germinale emergente. Utilizzando la linea transgenica glia-blu, l'acquisizione di Z-Stacks lungo più direzioni tramite la rotazione del campione consente l'osservazione della riorganizzazione delle cellule gliali lungo e intorno al cordone nervoso ventrale, nonché delle loro dinamiche di proliferazione del lato dorsale dei lobi della testa nello stesso embrione. Piccoli coloranti fluorescenti possono anche essere utilizzati per l'etichettatura specifica di strutture intercellulari per evidenziare alcune caratteristiche embrionali come l'acro della cirrosi, le cellule della cirrosi ventrale posteriore o il tristrato di tessuto della banda germinale dell'amnio della sierosa che emerge durante la chiusura della finestra della sierosa.

La colorazione fluorescente a doppio colore consente l'ulteriore visualizzazione di due strutture intercellulari nello stesso embrione. Ad esempio il citoscheletro di actina e l'involucro nucleare. Una volta terminata la registrazione, è importante per il controllo di qualità dell'esperimento recuperare gli embrioni e farli crescere in adulti sani e fertili.

Questa procedura può essere combinata con altre tecniche come la differenza dell'RNA parentale per analizzare i fenotipi abbattuti.