Luce Scheda a base di microscopia a fluorescenza di vita o fissate e colorate
28 aprile 2017
Imaging della morfogenesi di embrioni insetto con luce microscopio a fluorescenza foglio basata è diventato stato dell'arte. Questo protocollo descrive e confronta tre tecniche di montaggio appropriate per gli embrioni Tribolium castaneum, presenta due linee transgeniche misura romanzo ben adatto per l'imaging in tempo reale, discute controlli di qualità essenziali e indichi limitazioni dell'esperimento corrente.
L'obiettivo generale di questo protocollo è osservare in modo non invasivo lo sviluppo degli embrioni di Tribolium castaneum per periodi di tempo molto lunghi. La microscopia a foglio luminoso basata sulla fluorescenza consente di rispondere a domande relative alla morfogenesi nell'organismo modello insetto emergente Tribolium castaneum, analizzando i modelli di migrazione e proliferazione cellulare dal blastoderma iniziale fino all'inizio del movimento muscolare. Il principale vantaggio di questo metodo è che fattori critici come il fotobiancamento e la fototossicità sono mantenuti al minimo, anche quando gli embrioni vengono osservati per diversi giorni.
Per montare un embrione nella camera del campione utilizzando una colonna di agarosio, riempire prima una siringa da un millimetro con acqua distillata e utilizzare un piccolo tubo di gomma per collegare la siringa a una capillare di vetro. Riempire la capillare per metà con acqua distillata, quindi utilizzare un pennello per trasferire un embrione sul lato interno dell'apertura della capillare di vetro e inserire lentamente la capillare nell'agarosio liquido, aspirando alcuni microlitri di agarosio insieme all'embrione all'interno della capillare. Quando l'embrione è in posizione, dovrebbero esserci alcuni microlitri di agarosio sia sopra che sotto l'embrione.
Una volta che l'agarosio si è solidificato, accorciare il capillare a una lunghezza di circa cinque millimetri. Il frammento rimanente deve essere completamente riempito di agarosio e l'embrione deve trovarsi all'interno del secondo quartile. Inserire quindi il cilindro di acciaio con il perno nella camera del campione e fissare il frammento di capillare sulla sommità del perno, in modo che la colonna di agarosio sporga di alcuni millimetri dalla regione del frammento capillare che contiene l'embrione.
Per montare l'embrione nella camera del campione utilizzando un Emisfero di Agarosio, aspirare prima 200 microlitri di agarosio liquido in una siringa da un millimetro e utilizzare la siringa per riempire il tubo metallico della camera del campione con agarosio dall'alto del tubo fino a quando non si forma un emisfero all'apertura inferiore. Una volta che l'agarosio si è solidificato, prendere un embrione con la punta di un pennello e posizionarlo in modo che l'estremità anteriore risulti accessibile. Immergere l'Emisfero di Agarosio in agarosio liquido per ricoprirlo con un sottile strato e posizionare l'embrione con l'estremità anteriore rivolta verso l'alto sul polo dell'Emisfero di Agarosio.
Ruotare il tubo di acciaio e utilizzare il pennello per correggere la posizione dell'embrione se necessario. Idealmente, meno della metà della superficie dell'embrione dovrebbe essere ricoperta di agarosio e i fianchi dovrebbero essere il più ripidi possibile. Un eccesso di agarosio sulla superficie dell'embrione provoca una costrizione meccanica e una ridotta scambio di gas e ioni, il che ha un effetto drammatico sulla percentuale di sopravvivenza dell'embrione.
Quindi inserire lentamente il tubo di acciaio nella camera del campione. Per montare l'embrione nella camera del campione utilizzando un portacampioni a ragnatela, selezionare prima un embrione con il pennello e mettere da parte il pennello. Successivamente, coprire il foro scanalato del portacampioni a ragnatela con cinque-otto microlitri di agarosio liquido, quindi rimuovere la maggior parte dell'agarosio fino a quando rimane solo un sottile strato di agarosio.
Posizionare l'embrione sul film di agarosio e regolare attentamente la sua posizione, spostando l'embrione al centro dell'asse x del foro scanalato e allineando il suo asse antero-posteriore allungato con l'asse allungato del foro scanalato. Assicurarsi di posizionare l'embrione sul film di agarosio entro 10-15 secondi dall'applicazione, mentre l'agarosio è ancora liquido; in caso contrario, non si attaccherà correttamente. Inserire quindi lentamente il supporto Cobweb nella camera del campione, posizionando il supporto in modo che non interferisca con la luce di eccitazione e di emissione.
Per i saggi di imaging in tempo reale, configurare innanzitutto il time-lapse, quindi in modalità luce trasmessa posizionare l'embrione lungo gli assi X e Y al centro del campo visivo senza esporre l'embrione al laser. Ruotare l'embrione di 360 gradi a passi di 90 gradi per esaminare i tessuti alla ricerca di eventuali danni verificatisi durante il processo di montaggio. In modalità fluorescenza, definire lo Z-Stack per ogni direzione aggiungendo un margine spaziale di 25-50 micrometri davanti e dietro l'embrione e definire l'intervallo tra gli Z.
Per l'acquisizione a lungo termine, assicurarsi che la camera del campione sia riempita con una quantità sufficiente di buffer per l'acquisizione e coprire l'apertura della camera del campione. Quindi avviare il processo di acquisizione, monitorando la corretta acquisizione in tutte le direzioni e in tutti i canali per tutti gli embrioni. Al termine del periodo di acquisizione, rimuovere il portacampione dalla camera del campione e trasferire l'embrione su un vetrino.
Se è stata utilizzata una colonna di agarosio, usare una lama affilata per estrarre gli embrioni dall'agarosio circostante. Se è stato utilizzato un emisfero di agarosio, trasferire l'emisfero con il lato piatto sul vetrino. Per il metodo con supporto a ragnatela, utilizzare un pennello per staccare delicatamente l'embrione dal film di agarosio.
Quindi incubare il vetrino con l'embrione in una piccola capsula di vetro, in un'atmosfera ad umidità satura, in condizioni standard, fino alla schiusa delle larve. Per elaborare i dati dell'embrione osservato, aprire i file di interesse nel software di analisi dell'immagine appropriato e ruotare gli Z-Stack per allineare l'asse antero-posteriore dell'embrione con l'asse Y, se necessario. Ritagliare gli Z-Stack lungo gli assi X e Y in modo che rimanga solo un fondo minimo, quindi calcolare la proiezione massima in Z per ciascuno Z-Stack.
Quindi, a seconda della linea transgenica e delle modalità di acquisizione, effettuare le opportune regolazioni dinamiche dell'intensità delle serie temporali per correggere eventuali fenomeni di fotobleaching o fluttuazioni di espressione. Utilizzando una linea transgenica che esprime una proteina di fusione tra l'istone 2B e M-Emerald sotto il controllo del promotore di alpha-tubulin1, sono state registrate 66 ore di sviluppo embrionale a temperatura ambiente, dal ritrarsi della germ band fino alla chiusura dorsale. Questa linea con inserzione in un enhancer può essere utilizzata per visualizzare aggregati neuronali negli ap pendici cefalici e la dinamica della migrazione delle cirrose durante la chiusura dorsale.
Immagini di una linea transgenica simile, che porta lo stesso transgene ma in una posizione genomica differente, mostrano nei tagli ottici la transizione dalla gastrulazione all'allungamento del germoblasto, rivelando la disposizione interna delle cellule del germoblasto in formazione. Utilizzando la linea transgenica glia-blue, l'acquisizione di Z-stack in più direzioni mediante rotazione del campione permette di osservare la riorganizzazione delle cellule gliali lungo e intorno al cordone nervoso ventrale, nonché la loro dinamica proliferativa nel lato dorsale dei lobi cefalici nello stesso embrione. Piccoli coloranti fluorescenti possono inoltre essere utilizzati per l'etichettatura specifica di strutture intercellulari, al fine di evidenziare determinate caratteristiche embriologiche come il cirro gastrico, le cellule ventrali posteriori del cirro, oppure il tri-strato di tessuto formato da sierosa, amnios e germoblasto che si sviluppa durante la chiusura della finestra sierosa.
La colorazione con coloranti fluorescenti a doppio colore consente la visualizzazione aggiuntiva di due strutture intercellulari nello stesso embrione. Ad esempio, il citoscheletro di actina e l'involucro nucleare. Una volta terminata la registrazione, per il controllo di qualità dell'esperimento è importante recuperare gli embrioni e farli sviluppare in adulti sani e fertili.
Questa procedura può essere combinata con altre tecniche, come la Differenza di RNA Parentale, per analizzare i fenotipi silenziati.
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Panoramica
Questo protocollo descrive l'utilizzo della microscopia a foglio luminoso basata sulla fluorescenza per osservare la morfogenesi degli embrioni di Tribolium castaneum. Confronta tre tecniche di montaggio e presenta nuove linee transgeniche per l'imaging in tempo reale.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Embriologia
- Tecniche di Imaging
Sfondo
- Tribolium castaneum è un organismo modello insetto emergente.
- La microscopia a foglio luminoso minimizza il fotobiancamento e la fototossicità.
- Lo studio si concentra sulla migrazione e proliferazione cellulare durante lo sviluppo embrionale.
- L'osservazione non invasiva a lungo termine è fondamentale per la biologia dello sviluppo.
Scopo dello studio
- Osservare lo sviluppo degli embrioni di insetti per periodi prolungati.
- Indagare domande relative alla morfogenesi in T. castaneum.
- Migliorare le tecniche di imaging per un migliore controllo della qualità.
Metodi Utilizzati
- Microscopia a foglio luminoso basata sulla fluorescenza.
- Tre tecniche di montaggio per embrioni.
- Linee transgeniche su misura per un'immagine migliorata.
- Misure di controllo qualità per valutare l'efficacia dell'acquisizione di immagini.
Risultati principali
- Immagini a lungo termine riuscite di embrioni di T. castaneum.
- Il confronto tra tecniche di montaggio ha mostrato efficacia variabile.
- Linee transgeniche innovative hanno migliorato le capacità di imaging in vivo.
- Identificazione di limitazioni negli attuali approcci sperimentali.
Conclusioni
- La microscopia a foglio luminoso è efficace per lo studio dell'embriogenesi degli insetti.
- Le tecniche di montaggio influenzano in modo significativo la qualità dell'immagine.
- I futuri lavori dovrebbero affrontare le attuali limitazioni del protocollo.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La microscopia a foglio luminoso basata sulla fluorescenza consente un'osservazione a lungo termine e non invasiva dell'embriogenesi degli insetti, riducendo la fototossicità e il fotobiancamento, sostenendo così la riduzione del rischio meccanicistica negli studi di validazione del bersaglio. Questo approccio fornisce dati quantitativi e riproducibili di imaging che aumentano l'affidabilità predittiva nei modelli di biologia dello sviluppo rilevanti per la ricerca traslazionale. Il protocollo stabilisce tecniche standardizzate di montaggio e strumenti transgenici che migliorano la riproducibilità e la scalabilità dei saggi all'interno di flussi di lavoro R&S multifunzionali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la visualizzazione dei modelli di migrazione e proliferazione cellulare negli embrioni in via di sviluppo.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico fornendo immagini con elevato rapporto segnale-rumore per periodi prolungati, al fine di chiarire il ruolo funzionale dei bersagli.
- Valore predittivo: Facilita la selezione del portafoglio progettuale generando dati fenotipici affidabili da sistemi pertinenti alla malattia per l'identificazione dei composti promettenti.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi mediante condizioni standardizzate di montaggio e acquisizione delle immagini degli embrioni.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità del saggio attraverso tecniche definite di montaggio e misure di controllo qualità per saggi di imaging in vivo.
- Scalabilità: Evidenzia la prontezza per lo screening e il riutilizzo della piattaforma grazie alla compatibilità con diversi coloranti fluorescenti e linee transgeniche per l'etichettatura di strutture intracellulari.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Analizza la rilevanza per le malattie e l'allineamento traslazionale dei biomarcatori attraverso l'osservazione della riorganizzazione delle cellule gliali e della dinamica dei cluster neuronali negli embrioni.
- Valore operativo: Descrive la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica, consentendo l'acquisizione di immagini a lungo termine di processi dello sviluppo essenziali per la morfogenesi.
- Avanzamento ponderato rispetto al rischio: Affronta le decisioni di avanzamento ponderate rispetto al rischio fornendo dati quantitativi sulle fasi dello sviluppo embrionale per una riduzione del rischio di tipo meccanicistico.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo supporta il percorso della scoperta, dal test delle ipotesi nella fase iniziale fino alla validazione preclinica, consentendo un'analisi quantitativa e riproducibile mediante imaging dei processi di sviluppo in un sistema rilevante per la malattia.
- Biologia della scoperta: Spiega come il metodo supporti la verifica delle ipotesi, la chiarificazione dei percorsi biologici e la riduzione del rischio biologico attraverso la visualizzazione dei modelli di migrazione e proliferazione cellulare.
- Screening: Descrive la prontezza del saggio, la riproducibilità e le uscite quantitative mediante tecniche standardizzate di montaggio e acquisizione di stack Z per l'immagine in time-lapse.
- Analisi: Evidenzia le misurazioni, i risultati e le uscite statistiche, come le proiezioni Z-maximum e le regolazioni dinamiche dell'intensità, che aiutano i gruppi a confrontare le condizioni nel tempo e nelle diverse direzioni.
- Ricerca traslazionale: Collega il metodo alla continuità preclinica attraverso l'osservazione della dinamica della proliferazione gliale e della formazione di cluster neuronali rilevanti per i percorsi dello sviluppo neurologico.
- Riutilizzo aziendale: Presenta il metodo come una capacità riutilizzabile piuttosto che una tecnica monouso, grazie a procedure operative standardizzate e set di dati scaricabili per l'adozione a livello comunitario.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva, validazione degli obiettivi, riduzione dell'ambiguità meccanicistica nei processi di sviluppo.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità dei flussi di lavoro di imaging attraverso diverse tecniche di montaggio ed etichette fluorescenti.
- Valore strategico: Decisioni più efficaci di avvio/cessazione, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fasi avanzate grazie a valutazioni fenotipiche precoci in modelli di embrione.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per il rischio, basate su dati quantitativi di imaging ottenuti da saggi di imaging vitale a lungo termine.
Considerazioni sull'implementazione
- Competenze scientifiche richieste in biologia dello sviluppo, microscopia e gestione di linee transgeniche.
- Necessità di strumentazione e infrastrutture analitiche, inclusi microscopio a foglio luminoso, buffer per imaging e software di analisi per l'elaborazione di Z-stack.
- Requisiti di standardizzazione tra gruppi di lavoro per le tecniche di montaggio, la manipolazione di embrioni e i protocolli di controllo qualità.
- Considerazioni sull'adattamento tra diversi sistemi modello, inclusa l'applicabilità ad altre specie di insetti oltre a Tribolium castaneum.
- Limitazioni pratiche supportate dalla letteratura, incluse le difficoltà nella stabilità del montaggio degli embrioni e negli scambi gassosi/ionici quando la copertura di agarosio è eccessiva.
