Sfruttamento del fenotipo della popolazione laterale innescato dal DNA per rilevare e purificare le cellule staminali del cancro da campioni biologici

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di rilevare popolazioni di cellule staminali tumorali putative in campioni biologici in base alla capacità di estrusione del colorante delle cellule della popolazione laterale. Questo metodo affronta una questione chiave nella ricerca sulle cellule staminali tumorali relativa a mezzi affidabili per la rilevazione e la purificazione delle cellule staminali tumorali da campioni biologici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che distribuisce marcatori funzionali e quindi fornisce una migliore risoluzione.

Inoltre, l'espressione di questi trasportatori di farmaci ABC è altamente conservata tra le cellule staminali tumorali e quindi possiamo utilizzare questa tecnica per molte entità tumorali diverse. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla scoperta di terapie antitumorali con cellule staminali perché facilita l'analisi a valle come la profilazione dell'espressione genica e la convalida del bersaglio in cellule tumorali altamente purificate. Quindi questo metodo può fornire informazioni sulle caratteristiche delle cellule staminali tumorali.

Possiamo anche utilizzare questo metodo per caratterizzare come sistemi comprendenti popolazioni che esprimono il trasportatore di farmaci ABC come il midollo osseo. A dimostrare la procedura sarà Elisabeth Hoflehner, un tecnico del mio laboratorio. Per iniziare, coltivare la linea cellulare tumorale umana desiderata a 37 gradi Celsius in 10-30 millilitri di terreno RPMI 1640 integrato con il 10% di FBS, due millimetri di L-glutammina e antibiotici.

Quando le cellule raggiungono circa il 70-90% di confluenza, rimuovere il terreno e aggiungere due millilitri di tripsina-EDTA allo 0,05% per staccare le cellule dalla superficie del piatto di coltura. Quindi, lavare le cellule con 10 millilitri di terreno di coltura, trasferire la sospensione in una provetta pulita da 15 millilitri e farla girare a 250 volte G a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Una volta pellettate le cellule, scartare il surnatante e risospendere il pellet in un millilitro di terreno di coltura.

Mescolare una piccola aliquota della sospensione cellulare con la soluzione di blu di tripano e contare le cellule utilizzando un emocitometro. Per preparare i campioni di prova, sospendere le cellule in un terreno di coltura fresco per ottenere una sospensione cellulare da una volta dieci a sei cellule per millilitro. Dopo aver regolato la densità cellulare, trasferire tre millilitri di campione in una provetta a fondo tondo da 15 millilitri etichettata come test.

Quindi, aggiungere 10 micromolari di colorante viola al campione e agitare delicatamente la sospensione. Successivamente, preparare i controlli di inibizione trasferendo 500 microlitri del colorante contenente la sospensione cellulare in due provette per citometria a flusso etichettate come controllo. Aggiungere 50 micromolari di Verapamil al primo.

E 20 micromolari di Fumitremorgin C al secondo tubo. E mescolare le soluzioni pipettando delicatamente. Coprire tutte le provette con i tappi e incubarle a 37 gradi Celsius al buio per 90 minuti.

Agitare delicatamente i campioni ogni 15 minuti. Una volta completata la colorazione, lavare i controlli di inibizione in tre o quattro millilitri di PBS ghiacciato. E preparare aliquote del campione di prova per la successiva corazza con anticorpi.

Lavare anche queste aliquote e filtrare tutti i campioni attraverso filtri tagliati da 70 micron per rimuovere potenziali aggregati cellulari. E poi centrifugare le sospensioni a 250 volte G a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Dopo aver risospeso il pellet risultante in 100 microlitri di PBS, mantenere le celle sul ghiaccio al riparo dalla luce.

Successivamente, aggiungere un pannello appropriato di anticorpi coniugati al flurocromo alle cellule prestate con colorante viola. Agitare le sospensioni e incubarle a quattro gradi Celsius al buio per 20-30 minuti. Dopo l'incubazione, lavare le cellule in tre o quattro millilitri di PBS ghiacciato, filtrare il campione se lo si desidera.

E poi centrifugare a 250 volte G a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scartare il surnatante e risospendere le cellule pellettate in 100 microlitri di PBS. Infine, aggiungere il 7-AAD alle cellule prestate con colorante viola.

E incubare i campioni per 5-10 minuti al buio. Per analizzare le cellule utilizzando il citometro a flusso, eseguire il gate di una popolazione cellulare appropriata su un grafico a punti FSC SSC. Quindi, utilizzando diversi segnali FSC, escludere dalla popolazione selezionata tutti gli aggregati cellulari.

Escludere le cellule che rivelano una colorazione positiva di 7-AAD per ottenere la popolazione di cellule vitali. Per creare un grafico a punti per l'emissione di coloranti blu e rossi, visualizzare il canale fluorescente blu sull'asse y e il canale fluorescente rosso sull'asse x. Commutare entrambi i canali in modalità lineare e regolare la tensione del rivelatore di conseguenza in modo che la popolazione laterale si trovi nella parte inferiore sinistra del grafico.

Quindi, porta la popolazione laterale. E fermare l'acquisizione. Quindi, caricare i controlli di inibizione e acquisire i dati.

Infine, creare un grafico a punti che mostri la fioritura rossa del colorante viola sull'asse x e un canale di fioritura appropriato sull'asse y tracciato in modalità logaritmica. Caricare il campione, quindi regolare di conseguenza le tensioni del rivelatore e identificare la fazione delle celle di popolazione laterali che esprimono la superficie indagata. Quindi, registra i dati.

Di seguito sono presentati i risultati rappresentativi dell'analisi della popolazione laterale effettuata su cellule di carcinoma ovarico umano. La popolazione laterale distinta dall'analisi dell'emissione blu e rosso-viola è stata identificata nel quadrante inferiore sinistro del dot plot e ha costituito lo 0,70% dell'intera popolazione analizzata. L'uso successivo di inibitori dell'efflusso ha portato alla scomparsa del segnale di florescenza osservato per le cellule precedentemente identificate, confermando il loro fenotipo di popolazione laterale.

Infine, le cellule ovariche umane sono state caratterizzate anche in termini di espressione di ABCG2. La colorazione ABCG2 positiva è stata osservata nello 0,67% delle cellule corrispondenti alla popolazione laterale identificata. Una volta padroneggiata, questa procedura può essere eseguita in circa due o tre ore se eseguita correttamente.

Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare che il fenotipo della popolazione laterale dipende strettamente da un rapporto ottimale tra concentrazione di colorante e densità cellulare. L'idratazione di entrambe le variabili è quindi altamente raccomandata prima dell'esperimento. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la profilazione dell'espressione genica, al fine di caratterizzare ulteriormente le cellule della popolazione laterale e quindi identificare nuovi bersagli specifici per le cellule staminali tumorali per il futuro sviluppo di farmaci.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia delle cellule staminali per esplorare le caratteristiche delle cellule staminali tissutali e delle cellule staminali tumorali, sia nei topi che negli uomini. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione su come eseguire la popolazione laterale SA attivata dal colorante viola e su come rilevare le cellule staminali tumorali putative in campioni biologici nel tuo laboratorio. Non dimenticare che lavorare con campioni biologici può essere estremamente pericoloso e che quando si lavora con questa procedura è necessario prendere precauzioni come l'uso di DPI e cappe di sicurezza biologica.