Name: Analisi del rallentamento del gel agarosio proteina-tRNA per lanalisi del N 6 -reonilcarbamoyladenosine TcdA Funzione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Scopri l'assay di ritardo su gel di agarosio per studiare le interazioni proteina-RNA usando tRNA(UUU) e l'enzima TcdA. Questo metodo rapido permette di analizzare complessi proteina-tRNA con piccole quantità di campione.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

MCV è membro del programma CIB Intramural &quot;Macchine Molecolari per una migliore vita&quot; (MACBET). La ricerca che ha portato a questi risultati è stato finanziato dall&#39;ente spagnolo Instituto de Salud Carlos III (PI12 / 01667 a MCV), dal ministero spagnolo de Economía y Competitividad (CTQ2015-66206-C2-2-R e SAF2015-72961-EXP alla MCV ), Il governo regionale di Madrid (S2010 / BD-2316 a MCV) e la Commissione europea (Programma quadro 7 (FP7)) il progetto ComplexINC (contratto n. 279039 a MCV). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta di dati e nell&#39;analisi, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.

Attenzione: Prima dell&#39;uso consultare tutte le schede tecniche di sicurezza relative ai materiali (MSDS). Molte delle sostanze chimiche utilizzate in questo protocollo sono tossiche e corrosive. Utilizzare pratiche appropriate quando si esegue l&#39;estrazione di tRNA utilizzando fenolo, incluso l&#39;uso di un cappuccio e delle attrezzature di protezione individuale (occhiali di sicurezza, guanti, cappotto di laboratorio, pantaloni lunghi, scarpe chiuse, ecc .). Questo protocollo utilizza una macchia acida nucleica non tossica. L&#39;uso di macchie alternative può richiedere ulteriori precauzioni e smaltimento specializzato del colorante se tossico e / o cancerogeno ( es . Bromuro di etidio). 1. Preparazione del gel agarosico <ol><li> Pesare 2 g di agarosio e aggiungerlo ad una bottiglia di vetro per preparare un gel agarosico al 2% in peso. </li><li> Aggiungere 100 ml di tampone di tris-borato-etilendiammetraacetico (EDTA) (TBE) alla bottiglia contenente agarosio. Sciogliere per riscaldamento in un forno a microonde. A intervalli di 30 secondi, ruotare il contenuto da mescolareBene e ripetere questa fase fino a quando l&#39;agarosio è completamente sciolto. Lasciare raffreddare la soluzione agarosa a circa 50-60 ° C. </li><li> Nastri i bordi aperti di un vassoio di gel per creare uno stampo, posizionare un pettine appropriato per creare i pozzetti e lanciare l&#39;agarosio fuso in esso. Evitare la formazione di bolle e lasciarlo solidificare a temperatura ambiente. </li><li> Una volta solidificato, posizionare il vassoio gel in un&#39;unità di elettroforesi e riempirlo con tampone TBE fino a quando il gel è completamente coperto. </li></ol> 2. Preparazione del tRNA <ol><li> Express tRNA (UUU) in E. coli <ol><li> In mattinata, utilizzare un flacone di E. coli BL21 congelato (DE3) trasformato con il vettore di espressione pET23d-EcUUU 2 (porti il ​​gene che codifica E. coli tRNA (UUU)) per strisciare un Luria Broth (LB) Piastra integrata con 100 μg / mL di ampicillina. Invertire la piastra e posizionarla in un incubatore a 37 ° C fino a quando le colonie non appaiono (tardi afternoon). </li><li> Inoculare una ben coltivata singola colonia in 5 mL di LB e 100 μg / mL di ampicillina e si sviluppa per una notte a 220 giri / min a 37 ° C. </li><li> La mattina successiva, le cellule (6,500 xg per 10 minuti a 4 ° C), sostituire il mezzo con 5 ml di LB fresco e 100 μg / mL di ampicillina e risospendere. Utilizzare questa sospensione per inoculare 200 mL LB più 100 μg / mL ampicillina. Crescere per 5 ore a 220 giri / min a 37 ° C. </li><li> Quando la densità ottica della coltura a 590 nm (OD 590 ) ha raggiunto 0,6 - 0,8, aggiungere 1 mM IPTG alla coltura per innescare l&#39;espressione del gene tRNA (UUU). Incubare a 37 ° C per 3 ore. </li><li> Raccogliere le cellule centrifugando la coltura a 6.500 xg per 10 minuti a 4 ° C. </li></ol></li><li> Lisi e estrazione <ol><li> Resuspendere il pellet cellulare in 5 ml di tampone di lisi (0,3 M acetato di sodio, 10 mM EDTA). Da questo punto in poi, utilizzavano buffers autoclavati e mantenete tutti i campioni contenenti tRNA a 4 ° C per evitare tRNA degradazione. </li><li> Aggiungere 1 volume di fenolo acido (pH 4,3) al pellet di cellule risospese nel cofano. Mescolare per 1 min per inversione per lire le cellule e centrifugare a 10.000 xg (10 min, 4 ° C). </li><li> Raccogliere la fase acquosa superiore contenente il tRNA solubile (UUU) (e minori concentrazioni degli altri pool di tRNA) usando una pipetta facendo attenzione a non aspirare la fase organica (inferiore). Scartare lo strato inferiore e il pellet, costituito dalla fase organica e dai detriti cellulari, in un contenitore adeguato. </li><li> Precipitare il tRNA mescolando accuratamente la fase solubile (acquosa) con etanolo da 2,5 vol. Al 100% v / v per inversione per 1 h a 4 ° C. Centrifugare la miscela a 15.000 xg (30 min, 4 ° C). </li><li> Decanta il supernatante con attenzione e riposiziona il pellet ricco di tRNA in tampone di filtrazione gel da 4 mL (20 mM fosfato di sodio o fosfato di potassio, pH 7,4, 0,1 mM EDTA). Eseguire 5 μL del pool tRNA risospeso in un agarosio di 2% in peso. NOTA:Il tRNA di buona qualità appare come una singola banda (dimensione molecolare tra 50-100 bp). </li></ol></li><li> Purificazione di tRNA (UUU) <ol><li> Seguendo la pratica cromatografica standard 12 , caricare il tRNA (UUU) resuspendito su una colonna di filtrazione gel ad alta risoluzione (dimensioni: 16 x 600 mm, volume letto: 120 mL, intervallo di risoluzione: 1.000-70.000 Da) precedentemente equilibrato nel tampone di filtrazione gel (fase mobile). Impostare la portata a 1 mL / min per eluire i campioni. NOTA: Il picco di tRNA (UUU) eluisce approssimativamente a 75,5 ml. In genere, si può ottenere una resa di 0,5-1,0 mg / l tRNA di coltura. </li><li> Analizzare i campioni nei volumi rappresentativi di eluizione mediante elettroforesi di 5-10 μL di ciascun campione su un agarosio 2% in peso di agarosio. </li></ol></li></ol> 3. Preparazione del campione <ol><li> Esprimere e purificare TcdA secondo López-Estepa et al . 2 . NOTA: Fino a 250 μMTcdA può essere utilizzato per lo studio. </li><li> Pipettare la corrispondente quantità di TcdA come indicato nella tabella 1 in tubi centrifugati di 1,5 ml etichettati correttamente. Aggiungere 1,6 mM di tris (2-carbossietil) fosfina (TCEP) (concentrazione finale) e mescolare delicatamente usando una pipetta. Chiudere il coperchio e incubare la miscela a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Aggiungere 10 μM di trifosfato di adenosina (ATP) e 50 mM di MgCl2 (concentrazioni finali). Mescolare con una pipetta e incubare la miscela per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere il tRNA purificato (UUU) (sezione 2.3) secondo la tabella 1 , mescolare con una pipetta e incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Aggiungere salina tampone fosfato (PBS) fino a 100 μL di volume finale. Mescolare correttamente e aggiungere glicerolo ad una concentrazione finale del 10% v / v. </li><li> Vortice il campione e brevemente scomponi il contenuto del tubo (10.000 xg, 1 min, 4 ° C). </li></ol> 4. Sviluppo del gel e di elettroforesi<ol><li> Posizionare l&#39;unità di elettroforesi in un vassoio pieno di ghiaccio tritato per mantenere la camera a 4 ° C durante l&#39;esecuzione dell&#39;elettroforesi. </li><li> Attentamente, pipettare 5 μL di ogni campione nel pozzetto corrispondente. Aggiungere un indicatore appropriato del DNA. </li><li> Inserire gli elettrodi negli appositi alloggiamenti dell&#39;alimentatore. Accendere l&#39;alimentatore e impostare la tensione su 100 V e far funzionare il gel per 90 minuti. </li></ol> 5. La colorazione del gel per osservare l&#39;interazione tRNA-Protein <ol><li> Preparare la soluzione di colorazione mescolando 50 ml di TBE con 1x di una macchia adeguata del DNA. Evitare di esporre la soluzione di colorazione alla luce solare coprendo il contenitore di colorazione con foglio di alluminio. NOTA: le macchie di DNA vengono normalmente memorizzate come scorte concentrate di 10.000 o 20.000x. </li><li> Dopo 90 minuti di elettroforesi, rimuovere accuratamente il gel dal vassoio e metterlo in un contenitore con una soluzione di colorazione. Posizionarlo su un bilanciere a bassa velocità di rotazione a temperatura ambienteUre per 30 min. </li><li> Rimuovere il gel agarosio dal contenitore di colorazione, toccarlo con cura su un pezzo di tessuto di cellulosa o carta filtrante per rimuovere il liquido in eccesso e collocarlo direttamente su un transilluminatore. Accendere la luce UV per visualizzare le bande contenenti tRNA. Prendi una fotografia del gel. </li><li> Colorazione delle proteine ​​(opzionale). <ol><li> Eliminare in modo sicuro la soluzione di colorazione del DNA (secondo procedure di sicurezza) e sostituirla con 50 ml di soluzione Coomassie Brilliant Blue (CBB). Posizionare il vassoio su un bilanciere a temperatura ambiente e macchiare durante la notte (&gt; 12 h). Eliminare la soluzione di colorazione CBB e sostituirla con 50 mL di PBS per rimuovere la tintura in eccesso. Destain per 1 ora su un rocker. </li></ol></li><li> Visualizzare i complessi tRNA contenenti proteine ​​sotto un transilluminatore di luce e fotografare il gel da confrontare con l&#39;immagine del gel tRNA UV. </li></ol>

<ol><li>Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gel+retardation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The gel retardation assay.</a> Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).</li>
<li>López-Estepa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+and+small-angle+X-ray+analysis+of+CsdL%2FTcdA+reveal+a+new+tRNA+binding+motif+in+the+MoeB%2FE1+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily.</a> Plos One. 10 (4), e0118606(2015).</li>
<li>Miyauchi, K., Kimura, S., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cyclic+form+of+N6-threonylcarbamoyladenosine+as+a+widely+distributed+tRNA+hypermodification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A cyclic form of N6-threonylcarbamoyladenosine as a widely distributed tRNA hypermodification.</a> Nat Chem Biol. 9 (2), 105-111 (2013).</li>
<li>Bolstad, H. M., Botelho, D. J., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+protein-protein+interactions+within+the+Cysteine+Sulfinate+Desulfinase+Fe-S+cluster+biogenesis+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of protein-protein interactions within the Cysteine Sulfinate Desulfinase Fe-S cluster biogenesis system.</a> J Proteome Res. 9 (10), 5358-5369 (2010).</li>
<li>Loiseau, L., Ollagnier-de Choudens, S., Lascoux, D., Forest, E., Fontecave, M., Barras, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+heteromeric+CsdA-CsdE+cysteine+desulfurase%2C+assisting+Fe-S+cluster+biogenesis+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of the heteromeric CsdA-CsdE cysteine desulfurase, assisting Fe-S cluster biogenesis in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 280 (29), 26760-26769 (2005).</li>
<li>Fried, M. G., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibrium+studies+of+the+cyclic+AMP+receptor+protein-DNA+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Equilibrium studies of the cyclic AMP receptor protein-DNA interaction.</a> J Mol Biol. 172 (3), 241-262 (1984).</li>
<li>Garner, M. M., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gel+electrophoresis+method+for+quantifying+the+binding+of+proteins+to+specific+DNA+regions%3A+application+to+components+of+the+Escherichia+coli+lactose+operon+regulatory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system.</a> Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).</li>
<li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assays+for+RNA-protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014 (4), 435-440 (2014).</li>
<li>Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+protein-RNA+interactions+by+gel+mobility+shift%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift.</a> Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).</li>
<li>Yakhnin, A. V., Yakhnin, H., Babitzke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+mobility+shift+assays+to+detect+protein-RNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Gel mobility shift assays to detect protein-RNA interactions.</a> Methods Mol Biol. 905, 201-211 (2012).</li>
<li>Ream, J. A., Lewis, L. K., Lewis, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+agarose+gel+electrophoretic+mobility+shift+assay+for+quantitating+protein%3A+RNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rapid agarose gel electrophoretic mobility shift assay for quantitating protein: RNA interactions.</a> Anal Biochem. 511, 36-41 (2016).</li>
<li>Hagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel-filtration+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Gel-filtration chromatography.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 10, Unit 10.9 (2001).</li>
</ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Il saggio di retardazione del gel agarosico di proteina-tRNA descritto qui può essere modificato in diversi modi. In primo luogo, la percentuale di agarosio nel gel può essere ridotta per consentire la separazione e la visualizzazione di complessi proteina-tRNA significativamente più grandi di quelli analizzati qui (120 kDa). In secondo luogo, se la proteina bersaglio è termolabile, occorre prendere ulteriori precauzioni per garantire che la temperatura sia mantenuta al di sotto della massima temperatura accettabile spo...

<html> Il saggio di ritardo di gel 1 (noto anche come test di spostamento di mobilità elettroforetica, EMSA) è un metodo elettroforetico progettato per studiare e caratterizzare le interazioni proteiche-acido nucleico. Permette di analizzare le proteine-DNA e le interazioni proteine-RNA e in particolare le interazioni tra tRNA e proteine ​​leganti tRNA, utilizzando componenti purificati o miscele complesse di proteine ​​( ad es. , Lisati cellulari) o acidi nucleici ( ad esempio tRNA piscine). Abbiamo applicato saggi di retardazione del gel allo studio dell&#39;interazione tra tRNA purificato (UUU) e TcdA, una N 6 -reonilcarbamoyladenosina (t 6 A) deidratasi, che ciclizza la catena laterale di treonilcarbamoil attaccata ad A37 nel ciclo anticodonale (ASL) Di tRNA a ciclica t 6 (ct 6 A) 2 , 3 . TcdA è anche conosciuto come CsdL 3 ,F &quot;&gt; 4. Il gene tcdA / csdL forma un cluster con i geni 5 e 5 che codificano la cisteina desulfurasi e l&#39;acquirente dello zolfo del sistema cisina sulfinasi desulfinato (CSD) ed è richiesto per sostenere la funzione TcdA in vivo 3 . La ragione dietro i test di retardazione del gel è che, mentre le molecole di acido nucleico libere migrano rapidamente alla parte anteriore di acrilammide o gel agarosio in virtù della loro grande carica negativa, la mobilità elettroforetica dei complessi proteici degli stessi acidi nucleici è drasticamente ridotta. La riduzione della mobilità è visualizzata come un &quot;spostamento&quot; nei complessi proteici dell&#39;acido nucleico, che risolvono come bande discrete. Il complesso proteico acido nucleico caricato e maggiormente mostrato mostra un maggiore spostamento o riduzione della mobilità su un gel. Poiché la neutralizzazione del carico del complesso è un fenomeno universalePer i complessi di acido nucleico proteico, il saggio di retardazione del gel può essere applicato ad una vasta gamma di complessi e tipi di acido nucleico. Il metodo è semplice, poco costoso e può essere condotto in laboratori con attrezzature minime. Richiede solo piccole quantità di proteine ​​e tRNA. Questo è un vantaggio rispetto alle tecniche biofisiche alternative, che di solito consumano grandi quantità di campioni. Il saggio di retardazione del gel è stato ampiamente usato per lo studio dei fattori di trascrizione. Il saggio è stato utilizzato per analizzare la cinetica legante, la forza e la specificità dei fattori di trascrizione per molte sequenze di DNA diverse. Fu proprio in questo campo che l&#39;EMSA fu per la prima volta sviluppata 6 , 7 . I test di ritardo di gel con RNA 8 , 9 , 10 , 11 e molecole di tRNA sono stati utilizzati anche nella ricerca di ribosomiE di analizzare, come facciamo qui, gli enzimi che modificano i nucleosidi del tRNA post-trascrizionale. Molti parametri diversi influenzano il risultato di un test di ritardo di gel come la temperatura, la qualità della proteina e il campione tRNA e la forza del legame. La pianificazione e l&#39;esecuzione attenta dell&#39;esperimento è fondamentale per l&#39;interpretazione dei risultati delle specie libere di acido nucleico e proteine. Qui abbiamo usato il tRNA (UUU) codificante gene sintetico clonato in un vettore di espressione il cui promotore manca del sito di legame dei ribosomi Shine-Dalgarno, portando alla sintesi di grandi quantità del tRNA 2 . Questo protocollo dettagliato è inteso a fornire una guida chiara per eseguire esperimenti di ritardo del tRNA gel evitando errori comuni.

<table><tbody><tr><td>E. coli BL21(DE3)</td>Il lisogeno <td>Novagen</td><td>70235</td><td>DE3 contiene polimerasi T7 dopo induzione di IPTG.</td></tr><tr><td>pET23d</td><td>Novagen</td><td>69748-3</td><td>pET23d conferisce resistenza all'ampicillina; Promotore T7.</td></tr><tr>Si possono utilizzare anche <td>brodo LB, a basso contenuto di sale (brodo Lennox L), granulato</td><td>Melford</td><td>GL1703</td><td>Brodo LB convenzionale, ad alto contenuto di sale.</td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Sigma-Aldrich 10419313</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitatore per incubatrici (termostatato)</td><td>NBS</td><td>Excella E24&nbsp;</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi incubatore con agitatore con controllo della temperatura.</td></tr><tr><td>Isopropil-beta-D-tiogalattopiranoside (IPTG), >=99%</td><td>Acros Organics</td><td>BP1755</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio, anidro, >99%</td><td>Melford</td><td>B4017</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), sale disodico, >99%</td><td>Acros Organics</td><td>AC327205000</td><td>Dannoso se inalato.</td></tr><tr><td>Centrifuga (refrigerata)</td><td>Eppendorf</td><td>5430</td><td></td></tr><tr><td>Rotore centrifuga (refrigerata)</td><td>Eppendorf</td><td>5430/5430P</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Sorvall</td><td>RC5C</td><td></td></tr><tr><td>Rotore centrifuga</td><td>Sorvall</td><td>SLA-3000</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione fenolica, Saturata con tampone citrato 0,1 M, pH 4,3 &plusmn; 0,2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4682</td><td>Tossicità acuta (orale, cutanea, per inalazione), corrosivo</td></tr><tr><td>Etanolo assoluto per analisi, 100% v/v</td><td>Merck Millipore</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato bibasico diidrato, Na2HPO4, >=99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>Potassio diidrogeno fosfato, KH2PO4</td><td>Merck</td><td>48.730.250</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/60 Superdex 75&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28989333</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Melford</td><td>MB1200</td><td></td></tr><tr><td>Tris [Tris(idrossimetil)amminometano HCl]</td><td>Melford</td><td>T1513</td><td></td></tr><tr><td>Acido borico</td><td>Melford</td><td>B0503</td><td></td></tr><tr><td>Microonde</td><td>Haier</td><td>HDA-2070M</td><td></td></tr><tr><td>TCEP [Tris(2-carbossietil)fosfina cloridrato]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706</td><td>Corrosivo per i metalli e la pelle.</td></tr><tr><td>ATP [Adenosina 5&prime;-trifosfato sale disodico idrato], Grado I, >=99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio (MgCl2), anidro, >=98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl), >99%</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio (KCl), >99%</td><td>Melford</td><td>P0515</td><td></td></tr><tr><td>NZYDNA Ladder VI</td><td>NZYtech</td><td>MB8901</td><td></td></tr><tr><td>Alimentatore</td><td>Consort</td><td>EV261</td><td></td></tr><tr><td>Unità di elettroforesi</td><td>Real Laboratory</td><td>RELSMINI10</td><td></td></tr><tr><td>Real Safe Colorazione degli acidi nucleici</td><td>Real Laboratory</td><td>RBMSAFE</td><td>20.000X stock</td></tr><tr><td>UV Transilluminator (G:Box/EF)</td><td>Syngene</td><td>2216498</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0770</td><td></td></tr><tr><td>Rocker (Gyro-Rocker)</td><td>Stuart</td><td>SSL3</td><td></td></tr><tr><td>Mixer Vortex&nbsp;</td><td>Marchio Fisher</td><td>13214789</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi del rallentamento del gel agarosio proteina-trna per l&#39;analisi del<em&gt; n</em<sup&gt; 6</sup&gt; -reonilcarbamoyladenosine tcda funzione

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Esistono metodi per l&#39;espressione e la purificazione di tRNA (UUU) in Escherichia coli e l&#39;analisi mediante test di ritardo di gel del legame di tRNA (UUU) a TcdA, una N 6 -reonilcarbamoyladenosina (t 6 A) deidratasi che ciclizza il treonilcarbamoil La catena laterale attaccata ad A37 nel loop di gambo anticodon (ASL) di tRNA a ciclica t 6 A (ct 6 A). La transcrizione del gene sintetico che codifica il tRNA (UUU) è indotta in E. coli con 1 mM isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) e le cellule contenenti tRNA vengono raccolte 24 h postinduzione. La frazione RNA viene purificata usando il metodo di estrazione di fenolo acido. Il tRNA puro viene ottenuto mediante una cromatografia di filtrazione a gel che effettua la separazione efficiente delle molecole di tRNA di piccole dimensioni dai più grandi acidi nucleici intatti o frammentati. Per analizzare il legame TcdA a tRNA (UUU), TcdA viene mescolato con tRNA (UUU) e separato su un gel agarosico nativo a 4 ° C.Il tRNA libero (UUU) migra più velocemente, mentre i complessi TcdA-tRNA (UUU) subiscono un ritardo di mobilità che può essere osservato durante la colorazione del gel. Abbiamo dimostrato che TcdA è un enzima tRNA (UUU) -binding. Questo test di ritardo di gel può essere utilizzato per studiare mutanti TcdA e gli effetti degli additivi e di altre proteine ​​sul legame.

Grandi quantità di tRNA (UUU) possono essere ottenute esprimendo il gene tRNA in E. coli sotto il controllo di un forte promotore T7 inducibile. L&#39;espresso tRNA (UUU) si accumula nel citoplasma e si arricchisce sulla piscina di tRNA naturali abbondanti. Un procedimento di purificazione a due fasi costituito da una fase di cattura / estrazione e una fase di filtrazione / lucidatura gel è stata utilizzata per ottenere il tRNA di grado EMSA. La fase di cattura / estrazione util...

Viene presentato un protocollo per la produzione di tRNA (UUU) e l&#39;analisi di tRNA (UUU) in complesso con l&#39;enzima TcdA mediante saggi di retardazione del gel agarosio.

Analisi del rallentamento del gel agarosio proteina-tRNA per l&#39;analisi del<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -reonilcarbamoyladenosine TcdA Funzione

We demonstrate methods for the expression and purification of tRNA(UUU) in Escherichia coli and the analysis by gel retardation assays of the binding of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare un saggio di ritardo su gel per RNA progettato per la scoperta e la caratterizzazione di proteine leganti l'RNA. L'applicazione di questo saggio viene utilizzata per studiare l'interazione tra TcdA e l'RNA di trasferimento. Il metodo di ritardo su gel di agarosio può fornire risposte a domande fondamentali nel campo della biologia dell'RNA.Ad esempio, se una certa proteina interagisce con l'RNA, se l'interazione è specifica per sequenza e la forza di tale interazione. I principali vantaggi di questa tecnica sono l'utilizzo di piccole quantità di campioni proteici e di RNA e la produzione di risultati altamente informativi sulle interazioni proteina-RNA in tempi piuttosto brevi. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui complessi proteina-tRNA, può essere applicato anche a molti altri sistemi, come l'RNA ribosomiale, l'RNA messaggero e ogni altro tipo di molecola di RNA.Al mattino, recuperare una provetta di E coli BL21 DE3 congelata trasformata con il vettore di espressione pET-23D EC triple-U. Seminare su una piastra di luria broth a basso contenuto di sale o piastra LB integrata con 100 microgrammi per millilitro di

protein-trna-agarose-gel-retardation-assays-for-analysis-n6

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimica

Questo protocollo descrive la preparazione di un substrato sintetico per il...

Test in vitro Metilazione tRNA con l&#39;Entamoeba histolytica del DNA e Dnmt2 tRNA metiltransferasi (Ehmeth) Enzyme

Qui vi presentiamo un protocollo per analizzare le interazioni RNA / proteine. Il saggio spostamento mobilità elettroforetica (EMSA) si basa sulla migrazione differenziale di complessi RNA / proteine ​​e RNA libero durante elettroforesi su gel nativo. Utilizzando una sonda RNA radioattivo, RNA complessi / proteici possono essere visualizzati mediante autoradiografia.

Electrophoretic Maiusc Mobility Assay (EMSA) per lo studio delle interazioni RNA-proteina: La IRE / IRP Esempio

Questo protocollo descrive NAME, un test che permette la rapida identificazione di molecole in grado di inibire in vitro le attività chaperoniche della proteina nucleocapside HIV-1.

Nucleocapside Ricottura-Mediated elettroforesi (NAME) Assay permette la rapida identificazione del virus HIV-1 nucleocapside Inibitori

Presentiamo un piano strategico e un protocollo per identificare le varianti genetiche non codificanti che influenzano il legame del DNA con il fattore di trascrizione (TF). Viene fornito un protocollo sperimentale dettagliato per il saggio di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA) e il saggio di precipitazione di affinità del DNA (DAPA) del legame del DNA TF genotipo-dipendente.

Screening per Funzionale non codificante Varianti genetiche Utilizzando Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) e DNA-affinità precipitazioni Assay (DAPA)

Trascrittasi inversa umana del telomerase (TERT) sintetizza non solo DNA telomerico, ma anche RNA double-stranded attraverso attività RNA polimerasi RNA-dipendente. Qui, descriviamo un neocostituita dosaggio per rilevare attività RNA polimerasi RNA-dipendente di TERT endogeno.

Rilevamento semi-quantitativa dell'attività della RNA polimerasi RNA-dipendente della proteina di Human Telomerase Reverse Transcriptase

Qui, descriviamo un protocollo per la caratterizzazione biochimica dell'enzima modificante la RNA lievito, Mod5 e discutere come questo protocollo potrebbe essere applicato ad altri enzimi modificanti la RNA.

Un test In Vitro per rilevare attività di tRNA-Isopentenyl Transferase

Qui, viene descritto un saggio in vitro privo di anticorpi per l'analisi diretta dell'attività di metiltransferasi sull'RNA transscritto sintetico o in vitro.

Analisi anticorp-free per l'analisi dell'attività di RNA methyltransferase

Questo protocollo descrive un saggio nonradioattivo per misurare l'attività della chinasi delle chinasi polinucleotide (PNKs) su piccoli substrati di DNA e RNA.

Analisi nonradioattiva per misurare la fosforilazione polinucleoide dei substrati piccoli nucleotidi

Descriviamo l'ingegneria di una nuova T7 RNA polimerasi legata al DNA per regolare le reazioni di trascrizione in vitro. Discutiamo i passaggi per la sintesi e la caratterizzazione proteica, convalidiamo la regolazione trascrizionale proof-of-concept e discutiamo le sue applicazioni nel calcolo molecolare, nella diagnostica e nell'elaborazione delle informazioni molecolari.

RNA polimerasi legata al DNA per la trascrizione in vitro programmabile e il calcolo molecolare

L'interazione di un rimodellatore di cromatina ATP-dipendente con un ligando del DNA è descritta utilizzando la spettroscopia CD. I cambiamenti conformazionali indotti su un promotore genico analizzato dai picchi generati possono essere utilizzati per comprendere il meccanismo della regolazione trascrizionale.

Spettroscopia CD per studiare le interazioni DNA-proteina

Le bis-3-cloropepidine (B-CePs) sono sonde chimiche utili per identificare e caratterizzare le strutture G-quadruplex in modelli di DNA in vitro. Questo protocollo descrive in dettaglio la procedura per eseguire reazioni di sondaggio con B-CeP e per risolvere i prodotti di reazione mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide ad alta risoluzione.

In vitro Mappatura chimica delle strutture del DNA G-quadruplex mediante bis-3-cloroperidine

Scopri l'assay di ritardo su gel di agarosio per studiare le interazioni proteina-RNA usando tRNA(UUU) e l'enzima TcdA. Questo metodo rapido permette di analizzare complessi proteina-tRNA con piccole quantità di campione.

Analisi del rallentamento del gel agarosio proteina-tRNA per l'analisi del

Esplora altri video