In Vitro Crescita dei follicoli preantrali Mouse sotto condizioni di microgravità simulata
17 dicembre 2017
Una tecnica molto promettente per generare tessuto costruisce senza utilizzo di matrice consiste di cellule di coltura in condizioni di microgravità simulata. Utilizzando un sistema rotativo cultura, abbiamo esaminato il follicolo ovarico crescita e la maturazione degli ovociti in termini di sopravvivenza del follicolo, morfologia, crescita e funzione degli ovociti sotto la condizione di microgravità simulata.
Crescita in vitro di follicoli preantrali di topo in condizioni di microgravità simulata. L'intera procedura può essere suddivisa in quattro parti. Parte uno: isolare meccanicamente i follicoli dalle ovaie utilizzando aghi sotto un stereomicroscopio.
Seconda parte, incapsulare un singolo follicolo pipettandolo al centro di ogni perla di alginato. Terza parte, trasferire le perle di alginato contenenti i singoli follicoli nella goccia di mezzo di coltura nel sistema di coltura rotante che genera la microgravità simulata. Quarta parte, prelevare le perle di alginato ed estrarre i follicoli dalle perle di alginato incubando nel mezzo integrato con alginate liasi per 30 minuti a 37 gradi Celsius.
Isolamento e incapsulamento dei follicoli. Raccogliere le ovaie nel mezzo di manipolazione e quindi posizionare le ovaie in una piastra con pozzetti centrati. Sotto un microscopio stereoscopico, i follicoli vengono isolati dalle ovaie utilizzando due aghi.
Attenzione a non danneggiare la vasomembrana. Preparare una piastra con gocce di mezzo e coprirla con olio. Trasferire i follicoli nella piastra preparata.
Lavare i follicoli nel nuovo mezzo e quindi trasferirli nelle gocce di mezzo. Una singola goccia di mezzo contiene un follicolo. Preparare una piastra per coltura centrata aggiungendo la soluzione di incapsulamento nel cerchio esterno.
Preparare un flaconcino con una soluzione di alginato allo zero virgola otto percento. Aggiungere zero virgola cinque microlitri di soluzione di alginato al centro della piastra. Aggiungere gocce di soluzione di alginato nella soluzione di incapsulamento nel cerchio esterno della piastra.
Trasferire il follicolo nella soluzione di alginato al centro della piastra. Sciacquare i follicoli con la soluzione di alginato. Trasferire i follicoli al centro di ciascun microperla di alginato attraverso la superficie morbida della soluzione.
Ogni perla di alginato contiene un singolo follicolo. Lavare le perle di alginato con la soluzione di incapsulamento per solidificare le perle. Trasferire le perle di alginato in una nuova piastra con il mezzo di manipolazione.
Coltura in vitro di follicoli incapsulati sotto trattamento di microgravità simulata. Per il gruppo di controllo, aggiungere 150 millilitri di mezzo di coltura in una nuova piastra e ricoprirli con olio. Trasferire tre perle di alginato nella goccia di mezzo.
Incubare la piastra in un incubatore a biossido di carbonio per la coltura. Per il trattamento in microgravità simulata, preparare una piastra di olio, rimuovere il tappo del porto e aggiungere l'olio nel recipiente attraverso il porto aperto, fino a quando il recipiente è quasi pieno. Aggiungere un mezzo di coltura da 50 millilitri nell'olio.
Trasferire tre perle di alginato nella goccia di mezzo. Sostituire il tappo del porto aperto. Le bolle d'aria nel contenitore devono essere rimosse.
Rimuovere il tappo del porto per siringa. Posizionare due siringhe contenenti olio sul porto per siringa. Muovere le bolle d'aria al di sotto del porto per siringa.
Estrai le bolle nella siringa e inietta lo stesso volume di olio dall'altra siringa. Assicurati che non ci siano bolle d'aria nel contenitore. Chiudi le valvole, rimuovi le siringhe e sostituisci il tappo del portasiringa.
Abbiamo già preparato quattro contenitori con perle di alginato. Ora è il momento di fissare i contenitori alla base rotante. Regolare la velocità di rotazione finché la goccia di mezzo non raggiunge uno stato di equilibrio.
Trasferire sia i vasi che la base in un incubatore a biossido di carbonio per la coltura. Cambio del mezzo di coltura. Rimuovere il tappo del porto aperto, raccogliere le perle di alginato e l'olio in una nuova piastra.
Trovare e trasferire le perle di alginato in una piastra con il mezzo di manipolazione. Ristabilire il sistema di coltura in vasi come in precedenza. Recupero dei follicoli.
Rimuovere il tappo del porto aperto, raccogliere le perle di alginato e l'olio in una nuova piastra. Raccogliere le perle di alginato e i follicoli decapsulati dalle perle di alginato mediante incubazione in mezzo di manipolazione, integrato con alginato liasi per 30 minuti a 37 gradi centigradi. Risultati. Il saggio di vitalità cellulare ha mostrato che i follicoli singoli coltivati in condizioni di gravità normale presentano un numero maggiore di cellule vive e un numero minore di cellule morte rispetto ai follicoli coltivati in condizioni di microgravità simulata.
La dimensione del follicolo è aumentata significativamente in entrambe le condizioni di gravità. Conclusione. Il nostro metodo fornisce un modello per studiare i meccanismi coinvolti nei processi di sviluppo in vitro dell'ovocita e delle cellule della granulosa in condizioni di microgravità simulata.
Panoramica
Questo studio descrive un protocollo per la coltura di follicoli preantrali di topo in condizioni di microgravità simulata, utilizzando un sistema di coltura rotante. L'approccio prevede l'isolamento e l'incapsulamento dei follicoli in perle di alginato, la loro coltura in condizioni normali e di microgravità simulata, e la valutazione della sopravvivenza, della crescita follicolare e dell'ultrastruttura degli oociti. I risultati evidenziano l'impatto della microgravità sulla vitalità follicolare e sullo sviluppo degli oociti, fornendo un modello per ulteriori studi sulla folliculogenesi in vitro in condizioni di gravità alterata.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia riproduttiva
- Biologia dello sviluppo
- Ingegneria tissutale
Sfondo
- Gli ambienti a microgravità possono influenzare lo sviluppo cellulare e tissutale.
- La coltura in vitro dei follicoli è uno strumento prezioso per lo studio dello sviluppo dell'ovocita e delle cellule della granulosa.
- I sistemi di microgravità simulata permettono di indagare il ruolo della gravità nella follicologenesi.
- L'incapsulamento in alginato favorisce la coltura tridimensionale dei follicoli.
Scopo dello studio
- Stabilire un protocollo per la coltura di follicoli preantrali di topo in condizioni di microgravità simulata.
- Confrontare la sopravvivenza e lo sviluppo dei follicoli tra condizioni di gravità normale e di microgravità simulata.
- Valutare gli effetti della microgravità sullo sviluppo dell'ovocita e delle cellule della granulosa.
Metodi Utilizzati
- Isolamento meccanico di follicoli preantrali da ovaie di topo di 14 giorni utilizzando aghi sotto un microscopio stereoscopico.
- Incapsulamento di follicoli singoli in perle di alginato allo 0,8%.
- Coltura di follicoli incapsulati in un sistema a vaso rotante per simulare la microgravità, con colture di controllo parallele a gravità normale.
- Recupero e deincapsulamento dei follicoli mediante alginato liasi.
- Valutazione della sopravvivenza follicolare, misurazione dei diametri del follicolo e dell'ovocita e analisi ultrastrutturale degli ovociti.
Risultati principali
- I follicoli coltivati in condizioni di gravità normale hanno mostrato una maggiore vitalità cellulare rispetto a quelli esposti a microgravità simulata.
- La dimensione dei follicoli è aumentata significativamente in entrambe le condizioni di gravità.
- La microgravità simulata ha portato a una riduzione della sopravvivenza follicolare e a una downregolazione dell'espressione dell'antigene nucleare delle cellule in proliferazione (PCNA) e del fattore di crescita e differenziazione 9 (GDF9).
- Gli oociti del gruppo esposto alla microgravità hanno mostrato anomalie ultrastrutturali.
Conclusioni
- Il metodo descritto consente lo studio dello sviluppo follicolare e dell'ovocita in vitro in condizioni di microgravità simulata.
- La microgravità simulata influisce negativamente sulla sopravvivenza dei follicoli e sulla qualità degli ovociti.
- È necessaria un'ulteriore ottimizzazione del sistema di coltura per modellare in modo più accurato la follicologenesi in vitro in condizioni di gravità alterata.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La coltura di follicoli preantrali di topo in condizioni di microgravità simulata fornisce un sistema controllato per analizzare l'impatto meccanicistico delle forze fisiche alterate sulla follicologenesi precoce. Questo modello consente una valutazione quantitativa della sopravvivenza follicolare, della crescita dell'ovocita e dei marcatori molecolari, sostenendo una maggiore affidabilità predittiva negli studi di biologia dello sviluppo. L'approccio fornisce indicazioni per decisioni basate sulla valutazione del rischio nella ricerca traslazionale nei settori dell'ingegneria riproduttiva e tissutale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette una riduzione del rischio meccanicistica dello sviluppo dei follicoli e degli ovociti in condizioni di gravità alterata.
- Consente la validazione funzionale di marcatori molecolari come PCNA e GDF9 nella maturazione delle cellule della granulosa e degli ovociti.
- Fornisce una piattaforma quantitativa per la verifica di ipotesi in biologia della riproduzione e ingegneria tissutale.
Sviluppo di screening e saggi
- Stabilisce un sistema di coltura 3D riproducibile per la valutazione della viabilità dei follicoli e delle metriche di crescita.
- Facilita la standardizzazione di letture quantitative, inclusi i diametri del follicolo e dell'ovocita.
- Permette un'analisi comparativa della sopravvivenza e dell'espressione molecolare in condizioni fisiche variabili.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Offre un modello per lo studio dei meccanismi rilevanti per la malattia che influenzano la qualità dell'ovocita e la sopravvivenza dei follicoli.
- Permette di allineare i risultati ottenuti in vitro con lo sviluppo di biomarcatori traslazionali nella salute riproduttiva.
- Fornisce indicazioni per strategie precliniche finalizzate all'ottimizzazione dei sistemi di coltura tissutale in ambienti non standard.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo studi meccanicistici in stadi precoci e lo sviluppo di saggi quantitativi in biologia della riproduzione e ingegneria tissutale.
- Biologia della scoperta: Supporta l'indagine basata su ipotesi sull'effetto della gravità sulla follicologenesi e sulla maturazione dell'ovocita.
- Screening: Fornisce output standardizzati e quantitativi sulla vitalità e sulla crescita in condizioni controllate.
- Analisi: Offre endpoint misurabili come tassi di sopravvivenza, espressione di marcatori molecolari e analisi ultrastrutturale.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati ottenuti in vitro a modelli preclinici per la medicina riproduttiva e rigenerativa.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per studi meccanicistici su diversi tipi di tessuti e cellule.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Migliora la fiducia predittiva nei modelli di biologia dello sviluppo e della riproduzione.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione e la riproducibilità nei flussi di lavoro di colture 3D e di valutazione quantitativa.
- Valore strategico: Guida le decisioni di avanzamento o interruzione di programmi di ingegneria tissutale e di salute riproduttiva.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sulla gestione del rischio di iniziative di ricerca meccanicistica e traslazionale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'isolamento dei follicoli, nell'incapsulamento e nelle tecniche di coltura 3D.
- Richiede l'accesso a sistemi di coltura rotanti specializzati e a infrastrutture analitiche per la valutazione quantitativa.
- Necessita di una standardizzazione intersettoriale dei saggi di vitalità e dell'analisi dei marcatori molecolari.
- Potrebbe richiedere adattamenti per diversi tipi di tessuto o specie, a seconda dell'obiettivo della ricerca.
- L'ottimizzazione dei parametri di simulazione della microgravità è fondamentale per l'affidabilità e la riproducibilità del modello.
