In Vitro Crescita dei follicoli preantrali Mouse sotto condizioni di microgravità simulata
17 dicembre 2017
Una tecnica molto promettente per generare tessuto costruisce senza utilizzo di matrice consiste di cellule di coltura in condizioni di microgravità simulata. Utilizzando un sistema rotativo cultura, abbiamo esaminato il follicolo ovarico crescita e la maturazione degli ovociti in termini di sopravvivenza del follicolo, morfologia, crescita e funzione degli ovociti sotto la condizione di microgravità simulata.
Crescita in vitro di follicoli preantrali di topo sotto la microgravità simulata. L'intera procedura può essere suddivisa in quattro parti. Prima parte, isolare meccanicamente i follicoli dalle ovaie utilizzando aghi al microscopio stereomicroscopio.
Seconda parte, incapsulare il singolo follicolo pipettandolo al centro di ciascuna perlina di alginato. Terza parte, trasferire le perle di alginato contenenti i singoli follicoli nella gocciolina del terreno di coltura nel sistema di coltura rotante che genera la microgravità simulata. Parte quarta, raccogliere le perle di alginato e decapsulare i follicoli dalle perle di alginato incubando in un terreno integrato con alginato liasi per 30 minuti a 37 gradi centigradi.
Isolamento e incapsulamento dei follicoli. Raccogliere le ovaie nel mezzo di manipolazione e quindi posizionare ulteriormente le ovaie in una piastra a pozzetti centrata. Al microscopio, i follicoli vengono isolati dalle ovaie da due aghi.
Fare attenzione a non danneggiare la vasomembrana. Preparate un piatto con goccioline di terreno e copritelo con l'olio. Trasferire i follicoli nel piatto preparato.
Lavare i follicoli nel nuovo terreno e poi trasferirli nelle goccioline del terreno. Una goccia di terreno contiene un singolo follicolo. Preparare un piatto di coltura centrato, aggiungere la soluzione di incapsulamento nel cerchio esterno.
Preparare una fiala della soluzione di alginato virgola zero otto percento. Aggiungere zero virgola cinque microlitri di soluzione di alginato al centro del piatto. Aggiungere goccioline della soluzione di alginato nella soluzione di incapsulamento nel cerchio esterno del piatto.
Trasferisci il follicolo nella soluzione di alginato al centro del piatto. Sciacquare i follicoli con la soluzione di alginato. Trasferire i follicoli al centro di ciascuna perlina di alginato attraverso la superficie morbida della soluzione.
Ogni perlina di alginato contiene un singolo follicolo. Sciacquare le perle di alginato con la soluzione di incapsulamento per solidificare le perle. Trasferire le perle di alginato in un nuovo piatto con mezzo di manipolazione.
Coltura in vitro di follicoli incapsulati in trattamento simulato in microgravità. Per il gruppo di controllo, aggiungere 150 millilitri di terreno di coltura a un nuovo piatto e coprirlo con olio. Trasferire tre perle di alginato nella gocciolina media.
Incubare la capsula in un incubatore di biossido per la coltura. Per il trattamento simulato in microgravità, preparare un piatto di olio, rimuovere il tappo della porta, aggiungere l'olio nel recipiente attraverso la porta aperta, fino a quando il recipiente non è quasi pieno. Aggiungere un terreno di coltura da 50 millilitri nell'olio.
Trasferire tre perle di alginato nella gocciolina media. Riposizionare il tappo della porta aperto. Le bolle d'aria nel recipiente devono essere rimosse.
Rimuovere il tappo della porta della siringa. Posizionare due siringhe con olio sulla porta della siringa. Manovrare le bolle d'aria sotto la porta della siringa.
Tirare le bolle nella siringa e iniettare lo stesso volume di olio dall'altra siringa. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nel recipiente. Chiudere le valvole, rimuovere le siringhe e riposizionare il tappo della porta della siringa.
Abbiamo già preparato quattro recipienti con perline di alginato. Ora è il momento di fissare i recipienti nella base rotante. Regolare la velocità di rotazione fino a quando la gocciolina media non è in uno stato di equilibrio.
Trasferire sia i recipienti che la base in un incubatore di biossido per la coltura. Cambiamento del mezzo di coltura. Rimuovere il tappo della porta aperto, raccogliere le perle di alginato e l'olio in un nuovo piatto.
Trovare e trasferire le perle di alginato in un piatto con il mezzo di manipolazione. Ristabilire il sistema di coltura dei vasi come prima. Recupero dei follicoli.
Rimuovere il tappo della porta aperto, raccogliere le perle di alginato e l'olio in un nuovo piatto. Prelevare le perle di alginato e i follicoli decapsulati dalle perle di alginato incubando nel terreno di manipolazione, integrato con un'alginato liasi per 30 minuti a 37 gradi centigradi. Risultati. Il test di vitalità cellulare ha dimostrato che i singoli follicoli coltivati in condizioni di gravità normale hanno più cellule vive e meno cellule morte rispetto ai follicoli coltivati in condizioni di microgravità simulate.
La dimensione del follicolo è aumentata significativamente in entrambe le condizioni di gravità. Conclusione. Il nostro metodo fornisce un modello per studiare i meccanismi coinvolti nei processi di sviluppo in vitro di cellule ovocitarie e granulose in condizioni di microgravità simulata.
Panoramica
Questo studio descrive un protocollo per la coltura di follicoli preantrali di topo in condizioni di microgravità simulata, utilizzando un sistema di coltura rotante. L'approccio prevede l'isolamento e l'incapsulamento dei follicoli in perle di alginato, la loro coltura in condizioni normali e di microgravità simulata, e la valutazione della sopravvivenza, della crescita follicolare e dell'ultrastruttura degli oociti. I risultati evidenziano l'impatto della microgravità sulla vitalità follicolare e sullo sviluppo degli oociti, fornendo un modello per ulteriori studi sulla folliculogenesi in vitro in condizioni di gravità alterata.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia riproduttiva
- Biologia dello sviluppo
- Ingegneria tissutale
Sfondo
- Gli ambienti a microgravità possono influenzare lo sviluppo cellulare e tissutale.
- La coltura in vitro dei follicoli è uno strumento prezioso per lo studio dello sviluppo dell'ovocita e delle cellule della granulosa.
- I sistemi di microgravità simulata permettono di indagare il ruolo della gravità nella follicologenesi.
- L'incapsulamento in alginato favorisce la coltura tridimensionale dei follicoli.
Scopo dello studio
- Stabilire un protocollo per la coltura di follicoli preantrali di topo in condizioni di microgravità simulata.
- Confrontare la sopravvivenza e lo sviluppo dei follicoli tra condizioni di gravità normale e di microgravità simulata.
- Valutare gli effetti della microgravità sullo sviluppo dell'ovocita e delle cellule della granulosa.
Metodi Utilizzati
- Isolamento meccanico di follicoli preantrali da ovaie di topo di 14 giorni utilizzando aghi sotto un microscopio stereoscopico.
- Incapsulamento di follicoli singoli in perle di alginato allo 0,8%.
- Coltura di follicoli incapsulati in un sistema a vaso rotante per simulare la microgravità, con colture di controllo parallele a gravità normale.
- Recupero e deincapsulamento dei follicoli mediante alginato liasi.
- Valutazione della sopravvivenza follicolare, misurazione dei diametri del follicolo e dell'ovocita e analisi ultrastrutturale degli ovociti.
Risultati principali
- I follicoli coltivati in condizioni di gravità normale hanno mostrato una maggiore vitalità cellulare rispetto a quelli esposti a microgravità simulata.
- La dimensione dei follicoli è aumentata significativamente in entrambe le condizioni di gravità.
- La microgravità simulata ha portato a una riduzione della sopravvivenza follicolare e a una downregolazione dell'espressione dell'antigene nucleare delle cellule in proliferazione (PCNA) e del fattore di crescita e differenziazione 9 (GDF9).
- Gli oociti del gruppo esposto alla microgravità hanno mostrato anomalie ultrastrutturali.
Conclusioni
- Il metodo descritto consente lo studio dello sviluppo follicolare e dell'ovocita in vitro in condizioni di microgravità simulata.
- La microgravità simulata influisce negativamente sulla sopravvivenza dei follicoli e sulla qualità degli ovociti.
- È necessaria un'ulteriore ottimizzazione del sistema di coltura per modellare in modo più accurato la follicologenesi in vitro in condizioni di gravità alterata.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La coltura di follicoli preantrali di topo in condizioni di microgravità simulata fornisce un sistema controllato per analizzare l'impatto meccanicistico delle forze fisiche alterate sulla follicologenesi precoce. Questo modello consente una valutazione quantitativa della sopravvivenza follicolare, della crescita dell'ovocita e dei marcatori molecolari, sostenendo una maggiore affidabilità predittiva negli studi di biologia dello sviluppo. L'approccio fornisce indicazioni per decisioni basate sulla valutazione del rischio nella ricerca traslazionale nei settori dell'ingegneria riproduttiva e tissutale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette una riduzione del rischio meccanicistica dello sviluppo dei follicoli e degli ovociti in condizioni di gravità alterata.
- Consente la validazione funzionale di marcatori molecolari come PCNA e GDF9 nella maturazione delle cellule della granulosa e degli ovociti.
- Fornisce una piattaforma quantitativa per la verifica di ipotesi in biologia della riproduzione e ingegneria tissutale.
Sviluppo di screening e saggi
- Stabilisce un sistema di coltura 3D riproducibile per la valutazione della viabilità dei follicoli e delle metriche di crescita.
- Facilita la standardizzazione di letture quantitative, inclusi i diametri del follicolo e dell'ovocita.
- Permette un'analisi comparativa della sopravvivenza e dell'espressione molecolare in condizioni fisiche variabili.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Offre un modello per lo studio dei meccanismi rilevanti per la malattia che influenzano la qualità dell'ovocita e la sopravvivenza dei follicoli.
- Permette di allineare i risultati ottenuti in vitro con lo sviluppo di biomarcatori traslazionali nella salute riproduttiva.
- Fornisce indicazioni per strategie precliniche finalizzate all'ottimizzazione dei sistemi di coltura tissutale in ambienti non standard.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo studi meccanicistici in stadi precoci e lo sviluppo di saggi quantitativi in biologia della riproduzione e ingegneria tissutale.
- Biologia della scoperta: Supporta l'indagine basata su ipotesi sull'effetto della gravità sulla follicologenesi e sulla maturazione dell'ovocita.
- Screening: Fornisce output standardizzati e quantitativi sulla vitalità e sulla crescita in condizioni controllate.
- Analisi: Offre endpoint misurabili come tassi di sopravvivenza, espressione di marcatori molecolari e analisi ultrastrutturale.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati ottenuti in vitro a modelli preclinici per la medicina riproduttiva e rigenerativa.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per studi meccanicistici su diversi tipi di tessuti e cellule.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Migliora la fiducia predittiva nei modelli di biologia dello sviluppo e della riproduzione.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione e la riproducibilità nei flussi di lavoro di colture 3D e di valutazione quantitativa.
- Valore strategico: Guida le decisioni di avanzamento o interruzione di programmi di ingegneria tissutale e di salute riproduttiva.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sulla gestione del rischio di iniziative di ricerca meccanicistica e traslazionale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'isolamento dei follicoli, nell'incapsulamento e nelle tecniche di coltura 3D.
- Richiede l'accesso a sistemi di coltura rotanti specializzati e a infrastrutture analitiche per la valutazione quantitativa.
- Necessita di una standardizzazione intersettoriale dei saggi di vitalità e dell'analisi dei marcatori molecolari.
- Potrebbe richiedere adattamenti per diversi tipi di tessuto o specie, a seconda dell'obiettivo della ricerca.
- L'ottimizzazione dei parametri di simulazione della microgravità è fondamentale per l'affidabilità e la riproducibilità del modello.
