Attuatore a base di cellule muscolari cardiache e bioroboto auto-stabilizzante - parte 2

L'obiettivo generale di questo studio è quello di popolare dispositivi microfabbricati con cellule del muscolo cardiaco e di caratterizzare le proprietà biochimiche e biomeccaniche delle cellule su questi dispositivi, nonché le loro prestazioni nel tempo. La questione qui descritta può essere facilmente modificata per altri esperimenti che richiedono l'aggiunta di celle ad alta densità su dispositivi microfabbricati. Il vantaggio principale del bioattuatore sviluppato in questo video è che può essere facilmente adottato per quantificare le forze di contrazione cellulare di qualsiasi altro tipo di cellula.

Può anche essere utilizzato per studiare i cambiamenti nelle caratteristiche biomeccaniche delle cellule staminali durante la differenziazione. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di semina cellulare sono difficili da apprendere con descrizioni da testi. Devono essere eseguiti correttamente per garantire l'attacco delle cellule confluenti sui bracci a sbalzo, essenziale per il corretto funzionamento biologico.

A dimostrare la procedura sarà Neerajha Nagarajan del mio laboratorio. Con il biorobot, inizia nel pallone T25. Usa un magnete per tenerlo in posizione sul fondo del pallone.

Il magnete non è necessario per gli attuatori biologici in quanto non si muoveranno a causa del peso della perla di vetro nella base. Arrotolare un piccolo foglio di plastica quadrato da utilizzare come imbuto e posizionare l'imbuto sterile sopra gli attuatori nei biorobot. Regolare il diametro all'estremità più larga per adattarlo al dispositivo e l'altezza in modo che aderisca perfettamente quando la parte superiore del pallone è serrata.

Utilizzare un pallone separato per testare e regolare l'adattamento dell'imbuto. L'aderenza perfetta dell'imbuto garantirà che non vi siano perdite delle celle, come menzionato, nel resto del supporto. Questo è essenziale per fornire una copertura confluente del braccio a sbalzo.

Con l'imbuto in posizione, risospendere i cardiomiociti in DMEM completo a una densità di 16 milioni di cellule per millilitro e far cadere lentamente 400 microlitri di sospensione sui dispositivi attraverso ciascun imbuto. Quindi, spostare lentamente i palloni nell'incubatrice senza disturbare i dispositivi o gli imbuti all'interno. Lasciare che le celle si attacchino per 24 ore a 37 gradi Celsius.

Trascorso il periodo di incubazione, rimuovere lentamente l'imbuto. Lavare delicatamente i campioni con PBS e riempire ogni pallone con 10 millilitri di DMEM fresco completo. Quindi, rimuovi il magnete dal biorobot in modo che galleggi e riposiziona le fiasche nell'incubatrice.

Monta una telecamera dotata di un obiettivo zoom nell'incubatore per visualizzare i dispositivi in coltura. Quindi, aggiungi una striscia luminosa a LED da utilizzare come fonte di luce. Quindi, collegare la fotocamera a un computer e aprire il programma di imaging.

Una volta nel programma, fai clic sull'immagine della fotocamera nella scheda File per aprire tutte le opzioni della fotocamera e scegliere la fotocamera collegata. Dall'elenco delle schede, scegli Live e metti a fuoco manualmente l'immagine regolando la ghiera dell'obiettivo. Quindi, seleziona il ritaglio della regione di interesse dal pannello superiore.

Quindi, disegna manualmente un rettangolo nel fotogramma video che racchiude il dispositivo attuatore biologico e i bracci a sbalzo per contrassegnare la regione di interesse. Nel caso dei biorobot, catturare l'intero schermo per registrare il movimento di nuoto del dispositivo. Quindi, seleziona Impostazioni fotocamera e imposta la frequenza dei fotogrammi regolando l'esposizione e il rapporto pixel dell'immagine dal vivo.

Impostate la frequenza dei fotogrammi su circa 30 fotogrammi al secondo. Infine, fai clic sul pulsante di registrazione per avviare la registrazione dei video. Aprire il software di programmazione facendo clic sull'icona.

Una volta caricato, fare clic su File, Apri e selezionare il file di script m per l'esecuzione dell'analisi delle immagini. Assicurarsi che le immagini TIF registrate e le relative versioni AVI si trovino nella stessa cartella del file m, quindi fare clic su Esegui per eseguire lo script. Premere Riproduci per avviare il programma vero e proprio.

Una volta in esecuzione, fai clic sul pulsante Apri e individua il file TIF o AVI che verrà analizzato. Quindi, fai clic sul pulsante della base. Seleziona il punto in cui il cantilever si attacca alla base in alto e premi Invio.

Questo posizionerà un pennarello quadrato sull'immagine per ogni fotogramma per indicare la posizione della base a sbalzo. Quindi, fare clic sul pulsante della scala e quindi fare clic manualmente su un bordo della perla di vetro. Portare il puntatore del mouse sul lato opposto della perla di vetro e premere Invio.

In questo modo verrà tracciata una linea che misura il diametro della perla di vetro e si correlerà il diametro ai pixel visualizzati. Fare clic sul pulsante Analizza. Quindi, fare clic lungo il cantilever a breve distanza dal primo indicatore quadrato che rappresenta la base del cantilever.

Continuate a fare clic lungo il cantilever, compresa la punta, e premete Invio al termine. Questo posizionerà una X su ogni punto cliccato sul cantilever. Infine, verificare se il cerchio sovrapposto traccia correttamente il profilo a sbalzo.

Se corretto, fai clic sul pulsante del fotogramma successivo. In questo modo si passerà al fotogramma successivo nel file TIF. Ripeti questo processo per tutti i fotogrammi.

Una volta che tutti i fotogrammi sono stati elaborati, fare clic sul pulsante Esporta. Inizia aprendo il software di analisi delle immagini e caricando il file video del biorobot che nuota. Quindi, apri il software del foglio di calcolo.

Nel video del biorobot caricato, individua un riferimento dimensionale come la perla di vetro. Usa lo strumento Dritto per tracciare una linea attraverso la perla di vetro. Quindi fare clic su Analizza e selezionare Imposta scala.

Impostare il campo Distanza nota su 3.000 micrometri e fare clic su OK. Scegli un punto su un dispositivo che non oscilli tra i fotogrammi per fungere da marcatore e registra le coordinate X e Y di questo punto sul foglio di calcolo. Torna alla finestra del software di analisi delle immagini e premi il tasto freccia destra per passare al fotogramma successivo. Posiziona nuovamente il puntatore del mouse e registra le nuove coordinate X e Y sul foglio di calcolo.

Ripeti questo processo per tutti i fotogrammi e utilizza i dati per analizzare il movimento del biorobot come descritto nel protocollo di testo allegato. Le sollecitazioni statiche e dinamiche dell'attuatore sono state estratte ogni giorno dalle sollecitazioni superficiali. Lo stress statico è lo stress contrattile che le cellule mostrano sulla superficie allo stato di riposo e lo stress dinamico è lo stress generato dalle cellule alla massima contrazione.

Man mano che le cellule maturavano in coltura, nel tempo è stato osservato un graduale aumento degli stress statici e dinamici. Hanno mostrato una forza massima di trazione cellulare di 50 millinewton per metro e una forza di contrazione massima di circa 165 millinewton per metro il sesto giorno. Parallelamente agli stress statici e dinamici, anche i marcatori per la maturazione, la crescita e la diffusione dei cardiomiociti e l'interconnettività cellulare aumentano fino al sesto giorno.

Sulla base dell'analisi video, qui viene mostrato il confronto tra la velocità media di nuoto, la frequenza di battito e la distanza percorsa per bracciata per tre biorobot con diversi profili di nuoto. Sebbene i biorobot verticali abbiano la frequenza di battito più piccola, hanno mostrato la più alta velocità di nuoto e la distanza percorsa. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come seminare cellule muscolari cardiache su dispositivi microfabbricati che potrebbero funzionare come attuatori biologici e biorobot.

Il processo di acquisizione delle immagini e la successiva analisi dei dati descritti in questo video dimostrano un modo conveniente per caratterizzare il comportamento delle celle e le prestazioni del dispositivo. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la durata della vita dei cardiomiociti è limitata e l'attività delle cellule raggiunge il picco il sesto giorno. Dopodiché, diminuisce nel tempo.