Dissezione del Pancreas del Mouse per l'analisi istologica e Profiling metabolico

L'obiettivo principale di questo articolo video è fornire istruzioni visive dettagliate per l'esecuzione della dissezione del pancreas di un topo. Le istruzioni si riveleranno utili per i ricercatori che studiano modelli murini di malattie pancreatiche umane e che necessitano di prelevare il pancreas del topo mediante dissezione per analisi istologiche o profili metabolici. L'articolo video fornisce inoltre istruzioni dettagliate per effettuare un prelievo terminale di sangue mediante procedura di puntura cardiaca.

Viene mostrato un tavolo operatorio con le forniture necessarie. Queste includono un barattolo di vetro con coperchio, un tubo falcon da 15 mL, un paio di forbici chirurgiche, un contenitore a spruzzo di etanolo al 70%, due tavolette di polistirolo, due pinze, due siringhe da 1 mL con ago 21 gauge, due tubi falcon da 50 mL, un tubo da centrifuga, un criotubo, quattro pad chirurgici, dieci spilli, un dispenser di salviette sterilizzanti e un contenitore per materiale tagliente. Viene mostrato il tavolo post-operatorio con le forniture necessarie.

Questi includono una bilancia analitica, un Dewar da quattro litri di azoto liquido, un Dewar basso e a bocca larga, una rack galleggiante per microprovette, un paio di forbici chirurgiche, due pinze, cinque provette criogeniche e un dispenser di salviette sterili. Per eseguire l'eutanasia, il topo viene prima posizionato all'interno del barattolo di vetro contenente un tampone di garza imbevuto di alcune gocce di isoflurano, quindi viene chiuso con il coperchio fino a quando l'animale perde conoscenza, il che richiede tipicamente circa un minuto. Il topo viene quindi rimosso dal barattolo di vetro ed eseguito un test di pizzicamento al piede per assicurarsi che l'animale non possa provare alcun disagio.

Se il test della pressione sulla zampa fallisce, il topo viene restituito nel barattolo di vetro e il coperchio viene rimesso a posto fino a quando il test della pressione sulla zampa può essere eseguito con successo. Posizionare il topo in posizione supina e fissare gli arti del topo sulla tavoletta di schiuma chirurgica, quindi inumidire la faccia ventrale del topo con etanolo al 70%. Afferrare con la pinzetta il pelo vicino all'apertura uretrale e tirare leggermente verso l'alto.

Praticare un'incisione attraverso la cavità addominale, partendo dall'apertura uretrale, proseguendo lungo la linea mediana e terminando sul mento. In prossimità del punto iniziale dell'incisione, afferrare un lato della pelliccia e praticare un'altra incisione in direzione diagonale verso il basso, dirigendosi verso la zampa posteriore. Ripetere questa procedura nello stesso modo sul lato opposto.

Individuare il cuore per eseguire la puntura cardiaca terminale. A tale scopo, afferrare lo sterno con la pinza e incidere il diaframma. Tagliare rapidamente verso l'alto attraverso la gabbia toracica e rimuovere la porzione tagliata per esporre il cuore in battito.

Una volta localizzato il cuore, rimuovere il pericardio ed eseguire la puntura cardiaca terminale con la siringa. Per una raccolta ottimale del sangue, utilizzare lo stantuffo della siringa per imitare l'azione di pompaggio del cuore ed evitare di aspirare troppo velocemente. Espellere il sangue nel tubo da centrifuga e smaltire la siringa nel contenitore per materiali taglienti.

Dopo aver effettuato la puntura cardiaca, si procede all'eutanasia rimuovendo i legamenti che collegano il cuore. Individuare lo stomaco sul lato sinistro del topo. Il pancreas ha l'aspetto di un tessuto diffuso di colore più chiaro che è collegato allo stomaco, al duodeno, lungo tutto l'intestino tenue e crasso, ed è inoltre connesso alla milza.

Iniziare a separare delicatamente il pancreas dallo stomaco e dal duodeno utilizzando la pinzetta. Continuare a staccare il pancreas dall'intestino tenue procedendo dalle sezioni del digiuno e dell'ileo e infine fino al cieco e all'intestino crasso. Nel tratto del cieco, riposizionare la pinzetta e proseguire la separazione del pancreas lungo il colon rimanente fino al retto.

A questo punto, è conveniente tagliare ed eliminare la sezione che va dallo stomaco alla regione del colon immediatamente precedente al retto. Individuare il pancreas e la milza ad esso collegata. Scorrere il pancreas verso il lato destro del topo.

Recidere i rimanenti collegamenti tra il pancreas e la cavità toracica per staccare completamente il pancreas e la milza ad esso adiacente. Rimuovere il pancreas e dispiegarlo per esaminarlo. Se desiderato, altri organi possono essere rimossi in questo momento.

Dopo l'estrazione, i campioni vengono trasferiti nell'area post-operatoria. Ogni organo verrà pesato e quindi collocato nel relativo criotubo. Registrare eventuali irregolarità osservate.

Una volta che gli organi sono stati inseriti nei criotubi, posizionarli nel portaprovetta galleggiante e quindi nel Dewar contenente azoto liquido. Dopo il congelamento rapido, l'organo deve essere conservato a meno 80 gradi Celsius per la conservazione a lungo termine. Tutti gli strumenti utilizzati per la dissezione devono essere sanificati mediante salviette sterili.

Il tubo falcone foderato con il tampone chirurgico imbevuto di isoflurano deve essere chiuso con il cappuccio. Il tampone chirurgico sulla lastra di polistirolo deve essere sostituito con uno nuovo. Le parti del topo non raccolte devono essere smaltite secondo le norme della struttura per lo smaltimento degli animali.

I seguenti elementi devono essere gestiti in modo appropriato. Una volta che questi elementi sono stati correttamente conservati, è possibile eseguire numerose sperimentazioni, tra cui – ma non limitate a – microscopia a fluorescenza, istologia con ematossilina ed eosina, immunohistochimica, spettrometria di massa e spettroscopia di risonanza magnetica nucleare. Poiché il pancreas è un organo primario per l'attività metabolica e la produzione di insulina, questa procedura consente la conservazione delle caratteristiche fisiologiche.

Isolando il pancreas, potranno essere effettuate analisi future sul campione. Questa procedura consente il confronto e lo studio delle interazioni con altri tessuti all'interno dello stesso organismo, entro lo stesso arco di tempo.