Name: Imaging di cellule vive di degranulazione piastrinica e secrezione sotto flusso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-10T10:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Scopri un metodo di imaging a fluorescenza per studiare la degranulazione e secrezione piastrinica in condizioni di flusso. Questa piattaforma versatile consente l'analisi in tempo reale delle funzioni piastriniche per la ricerca meccanicistica su trombosi ed emostasi.

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CM riconosce il sostegno finanziario dell&#39;Organizzazione Internazionale del Paziente per le Deficienze C1-Inibitore (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht e la Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR).

Il Comitato Etico Medico Comunale del Centro Medico Universitario di Utrecht ha approvato il disegno del sangue per scopi di ricerca ex vivo , inclusi quelli di questo studio. 1. Preparazione della soluzione <ol><li> Preparare un buffer di Tyrode di 4- (2-idrossietil) -1-piperazinattanesolfonico sciogliendo 10 mM HEPES, 0,5 mM Na 2 HPO 4 , 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO4 e 5,55 mM D- Glucosio in acqua distillata. <ol><li> Fare due varianti del buffer: impostare i livelli di pH a 6,5 ​​e rispettivamente a 7,4. Fai buca fresca per ogni giorno di esperimenti. Supplemento con 10 ng / ml prostacyclin dove indicato. </li></ol></li><li> Preparare la soluzione salina tricolata TRIS (TBS) dissolvendo 50 mM Tris e 150 mM NaCl in acqua distillata e regolare il pH a 9.0. </li><li> Preparare il destrosio acido citrato (ACD) sciogliendo 85 mM tri-sodio citrato, 71 mM acido citrico e 111 mM D-glucosio in disAcqua stagionata. </li><li> Preparare una soluzione fissativa aggiungendo la paraformaldeide (PFA) del 2% (v / v) al tampone di HEPES Tyrode, pH 7,4. Scaldare per dissolvere (50 - 70 ° C) e impostare il pH a 7,4. Aliquota e conservare a -20 ° C. Scongelare a 37 ° C prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare il tampone di bloccaggio sciogliendo l&#39;albumina umana (HSA) dell&#39;1% (m / v) nel tampone di HEPES Tyrode, pH 7,4 </li><li> Creare una soluzione di alcool polivinilico aggiungendo 4,8 g di alcool polivinilico a 12 g di glicerolo e mescolare bene. Aggiungere 12 ml di acqua distillata e lasciarlo su rotatore a temperatura ambiente durante la notte. <ol><li> Aggiungere 24 ml di 0,2 M Tris-HCL, pH 8,5. Riscaldare a 50 ° C mentre si mescola per 30 min. Aggiungere 1,25 g di 1,4-diazabiciclo [2.2.2] ottano (DABCO) e mescolare bene. Centrifugare a 1.500 xg per 5 min. Aliquota il surnatante (1 mL è sufficiente per 15-20 diapositive) e conservare a -20 ° C. Usate le aliquote una volta. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione del vetro di copertura <ol><li> Sgrassare la coperturaBicchieri (25 x 50 mm 2 ) incubando durante la notte in acido cromosumpurico non diluito. Sciacquare gli occhiali con acqua distillata e asciugarli per una notte a 60 ° C in un forno. </li><li> Aderire una striscia di una pellicola paraffina (10 x 15 cm 2 ) in cima a una panca da laboratorio con una goccia d&#39;acqua e rimuovere l&#39;aria lisciando la pellicola paraffina. Pipettare 80 μL gocce di 10 μg / mL VWF o 100 μg / mL fibrinogeno sulla pellicola paraffina. Posizionare gli occhiali sulle gocce; La soluzione proteica si diffonde tra le due superfici per coprire l&#39;intera parte posteriore del vetro. Incubare per 1,5 ore a temperatura ambiente (RT). </li><li> Rimuovere la pellicola paraffina e bloccare i vetri di copertura posizionandoli, con il lato rivestito in su in una piastra a 4 pozzetti con blocco di blocco. Incubare per 1 ora a 37 ° C o per una notte a 4 ° C. Come controllo, bloccare un vetro di copertura non rivestito con VWF o fibrinogeno. </li></ol> 3. Preparazione del plasma ricco di piastrine (PRP) </p&gt; <ol><li> Raccogliere il sangue intero citrato (concentrazione finale: 0,32% citrato di sodio (M / V)) mediante venipunzione. </li><li> Centrifugare il sangue per 15 minuti a 160 xg e RT senza freno. Raccogliere il surnatante ( ossia il PRP) con una pipetta in plastica Pasteur. NOTA: Dopo la centrifugazione si possono osservare tre strati (dall&#39;alto verso il basso): PRP, globuli bianchi e globuli rossi. Assicurarsi di non includere le celle bianche e rosse. Tipicamente, 3 ml di PRP possono essere raccolti dopo la centrifugazione di un tubo di sangue da 9 ml. </li><li> Continuare alla sezione 4 se l&#39;esperimento verrà eseguito con le piastrine lavate. Se si desidera utilizzare PRP, continuare con il passaggio successivo. </li><li> Dopo la raccolta PRP, centrifugare nuovamente il resto del sangue (contenente il pellet di cellule rosse) di nuovo per 10 minuti a 2.000 xg senza freno. Raccogliere il surnatante contenente il plasma poverico delle piastrine (PPP). NOTA: In genere, 2 mL possono essere raccolti dopo questa seconda fase di centrifugazione. </li><li> Conte il numero del pLatte nel PRP su un analizzatore di celle e diluirlo con il PPP (fase 3.4) ad una concentrazione di 150.000 piastrine / μL. NOTA: Il volume totale di PRP diluito dipende dal numero di piastrine del donatore. I conteggi delle piastrine variano notevolmente tra i donatori e la diluizione di PRP richiede una valutazione su base individuale. Le conta piastrine sono considerate normali quando si trovano entro 150.000 e 450.000 piastrine / μL. </li><li> Continuare alla sezione 5. </li></ol> 4. Preparazione di piastrine lavate <ol><li> Determinare il volume medio delle piastrine (MPV) nel PRP utilizzando un analizzatore di celle. NOTA: Questo è un indicatore della pre-attivazione delle piastrine 11 . Un MPV normale per le piastrine di riposo è di 7,5-11,5 fL 11 . Il MPV non dovrebbe aumentare di più di 1,5 fL durante la procedura di lavaggio delle piastrine. </li><li> Aggiungere un volume 1/10 di ACD a PRP per prevenire la pre-attivazione delle piastrine e centrifugare per 15 minuti a 400 xg e RT senza freno. Rimuovere la suPernatante e ri-sospendere attentamente il pellet nel tampone di HEPES Tyrode, pH 6,5, al volume originale di PRP. </li><li> Sciogliere una aliquota di prostacyclin aggiungendo TBS ad una concentrazione di 10 μg / mL; Tenerlo su ghiaccio. </li><li> Per prevenire l&#39;attivazione delle piastrine, aggiungere prostaciclina a una concentrazione finale di 10 ng / mL alle piastrine ri-sospese e centrifugare immediatamente per 15 minuti a 400 xg e RT senza freni. Rimuovere il surnatante e ri-sospendere attentamente il pellet nel tampone di HEPES Tyrode, pH 7.4. </li><li> Conta il numero delle piastrine (passo 3.5) e determinare la variazione nella MPV (passo 4.1) (il MPV non deve cambiare più di 1,5 fL). </li><li> Regolare il numero di piastrine con il tampone di HEPES Tyrode, pH 7.4, ad una concentrazione di 150.000 piastrine / μL. Lasciare le piastrine per recuperare per 30 minuti a RT prima degli esperimenti. Usare le piastrine lavate per esperimenti entro 4 ore dall&#39;isolamento. </li></ol> 5. Assemblea della camera di flusso 12 . Possono essere utilizzate varie camere di flusso commercialmente prodotte, purché possano contenere un vetro di copertura, preferibilmente rimovibile per ulteriori analisi. La camera di flusso utilizzata per le esperienze descritte è costituita da poli (metilacrilato) per adattarsi in modo preciso allo stadio di inserimento del microscopio. Contiene un ingresso e uscita ( Figura 1A - C ; 1, 2), nonché una connessione a vuoto ( Figura 1A e C ; 3). Una lastra di silicone personalizzata ( Figura 1A e D ; 4) è posta sulla parte superiore. Due estremità formano i canali di vuoto ( Figura 1A e D ; 5) per fissare strettamente la camera di copertura ( Figura 1A ; 6) alla camera. Un taglio centrale forma il canale di flusso ( Figura 1A </strong&gt; E D ; 7; 2,0 mm di larghezza e 0,125 mm di altezza). L&#39;ingresso e la presa sono collegati al canale di flusso e il vuoto è collegato al canale di vuoto. <ol><li> Coprire la parte superiore della camera di flusso con acqua distillata e posizionare il foglio in silicone personalizzato con il lato liscio in basso sull&#39;acqua. Spostare il foglio in posizione rimuovendo l&#39;acqua in eccesso pur mantenendo il foglio in posizione. NOTA: questo foglio di silicone è riutilizzabile (il silicone è noto per le sue proprietà inerte); In genere, le piastrine non sono state osservate per aderire a essa. Le lenzuola possono essere pulite con detersivo e riutilizzate fino a quando il materiale non viene danneggiato ( cioè strappo, soprattutto nella zona tra i canali). In genere, un foglio può essere utilizzato per 20 giorni con più esperimenti al giorno. </li><li> Incubare la camera di flusso per 1 h a 60 ° C per evaporare l&#39;acqua residua per fissare saldamente il foglio di silicone alla camera di flusso. </li><li> Con una pipetta di Pasteur plastica, aggiungere una goccia diTampone di HEPES Tyrode, pH 7.4, sul canale di flusso. Posizionare il vetro di copertura (vedi sezione 2) con il lato rivestito rivolto verso il basso, sul canale di flusso. Collegare la pompa a vuoto alla connessione a vuoto ( figure 1A e C ; 3). Applicare pressione ~ 10 kPa. </li></ol> 6. Pre-colorazione delle piastrine e preparazione degli anticorpi <ol><li> Colorazione delle piastrine <ol><li> Incubare le piastrine lavate con 10 μg / mL DAPI per 30 minuti a 37 ° C al buio. Per lavare via DAPI non legato e per prevenire l&#39;attivazione delle piastrine, aggiungere prostacyclin ad una concentrazione finale di 10 ng / mL e immediatamente centrifugare per 15 minuti a 400 xg e RT senza freno. </li><li> Ricostituire il pellet piastrinico nel tampone di HEPES Tyrode, pH 7.4, ad una concentrazione di piastrine di 150.000 piastrine / μL. </li></ol></li><li> Preparazione degli anticorpi <ol><li> Mescolare l&#39;anticorpo biotino-etichettato con strep etichettato con AlexaTavidin a un rapporto molare di 1: 1. Incubare per almeno 10 minuti a temperatura ambiente prima dell&#39;uso (passo 7.6). NOTA: L&#39;efficienza di etichettatura della biotina può variare tra i diversi lotti. In caso di problemi con la visualizzazione delle molecole bersaglio occorre eseguire esperimenti di controllo per confermare la biotinilazione riuscita, nonché le proprietà vincolanti dell&#39;obiettivo specifico dell&#39;anticorpo biotinilato. </li></ol></li></ol> 7. Perfusione <ol><li> Avviare il microscopio a fluorescenza, oltre al microscopio. Utilizzare le impostazioni del microscopio elencate nella tabella 1 . NOTA: Inizia la microscopia e le impostazioni di registrazione per la visualizzazione e la registrazione delle cellule vive delle piastrine e degli anticorpi e / o coloranti contrassegnati fluorescenti caricando un esperimento appropriato nel software del microscopio. Eseguire esperimenti di flusso a RT. </li><li> Bloccare il tubo di entrata collegando una siringa da 10 ml alla tubazione e aspirando 1% HSA bloTamponare il tampone nel tubo di entrata. Incubare per 15 minuti a RT. Sciacquare il tubo di ingresso aspirando il tampone di HEPES Tyrode, pH 7.4, nel tubo di ingresso. </li><li> Collegare il tubo di ingresso bloccato e il tubo di scarico non trattato, entrambi con un diametro di 1,02 mm e una lunghezza di circa 20-30 cm, all&#39;entrata e all&#39;uscita della camera. Collegare una siringa da 10 ml (o un volume più basso per maggiore precisione) al tubo di uscita. Accendere la pompa della siringa. NOTA: Il diametro della siringa, in combinazione con la portata impostata sulla pompa, determina la portata volumetrica. Insieme alla superficie del canale di flusso, la velocità di taglio può essere calcolata in base alla formula 13 sotto. Di conseguenza, è possibile manipolare la velocità di taglio cambiando la portata della pompa della siringa o alterando le dimensioni del canale di flusso. Una velocità di taglio di 800-1.600 s -1 tipicamente modelli per il flusso sanguigno arterioso, mentre 25-100 s-1 modelli per il sangue venosoflusso. Per questa impostazione, una portata di 7,5 μL / min determina una velocità di taglio di 25 s -1 . Velocità di taglio = 6Q / h 2 w in s -1 Dove: Q = portata volumetrica (mL / s), h = canale di altezza (cm) (0.0125 cm; spessore del foglio di silicone); w = canale di larghezza (cm) (0,2 cm in questa camera). </li><li> Posizionare una goccia di olio di immersione su un obiettivo 100X (amplificazione totale di 1.000x) e montare la camera sul microscopio con la superficie in vetro verso il basso. </li><li> Posizionare il tubo di ingresso in un tubo contenente il tampone HEPES Tyrode, pH 7.4. Tirare manualmente lo stantuffo della siringa collegato al tubo di uscita e tirare la soluzione attraverso la camera per rimuovere l&#39;aria dal sistema. Posizionare la siringa nella pompa della siringa ( Figura 1B e C ; 8) ed eseguire brevemente la pompa per stringere lo stantuffo e assicurare un flusso stabile. </li><li> Aggiungere gli anticorpi e / oi coloranti alla sospensione piastrinica o alla PRP, con attenzioneMescolare con una pipetta di plastica e trasferire la miscela in un tubo da 1,5 ml. NOTA: Per una perfusione tipica di 30 min alla velocità di taglio 25 s-1 (7,5 μL / min), è necessario un minimo di 225 μL di sospensione piastrinica. Gli anticorpi utilizzati per i risultati rappresentativi sono mostrati nella Tabella 2 . </li><li> Spostare il tubo di entrata, pur spremendolo, dal tampone di TRODE di Hepes, pH 7,4, in un tubo da 1,5 mL contenente PRP o le piastrine lavate e gli anticorpi e / o coloranti ( Figura 1B e C ; 9). NOTA: È importante che durante il trasferimento del tubo la tubazione sia compressa (premendo l&#39;aria) per impedire l&#39;ingresso dell&#39;aria nel tubo. È possibile trattare le piastrine aderenti con una varietà di reagenti in un passaggio successivo spostando il tubo di entrata in un altro tubo in modo simile. Un elenco di reagenti potenzialmente utili è fornito nella tabella 3 . </li><li> Selezionare la &quot;visualizzazione in diretta&quot;N &quot;nel software, mettere a fuoco il microscopio sulla superficie del vetro rivestito rivestito e avviare la pompa a una velocità di taglio di 1.600 s-1 (484 μL / min) fino a quando le piastrine raggiungono la camera di flusso.In questo momento, Ridurre la velocità di taglio a 25 s-1 modificando le impostazioni della pompa della siringa ad una portata di 7,5 μL / min. </li><li> Monitorare la superficie del lato rivestito del vetro di copertura, attendere che la prima piastrina inizia ad aderire, mettere a fuoco il microscopio su questa piastrina e avviare la registrazione avviando l&#39;esperimento nel software. Vedere la Tabella 1 per le impostazioni di registrazione utilizzate qui. </li><li> Seguire visivamente la registrazione dal vivo. Dopo 30 minuti, arrestare la pompa della siringa. NOTA: Assicurarsi che le piastrine rimangano a fuoco durante il corso dell&#39;esperimento. In genere, 20-30 piastrine si collegano nel campo visivo ad un ingrandimento di 1.000X; Si tratta di circa 2.000-3.000 piastrine in tutto il canale di flusso. </li><li> Fissazione usandoLa camera di flusso (opzionale). <ol><li> Quando il flusso si è arrestato dopo che la pompa della siringa è ferma, trasferire il tubo di entrata (senza aria) alla soluzione fissativa. Riavviare la pompa e passare il buffer di fissaggio attraverso il canale per un minimo di 10 minuti alla stessa portata di cui al punto 7.8. </li></ol></li><li> Rimuovere la camera dal microscopio, pulire l&#39;olio da immersione dal vetro, scollegare il vuoto e rimuovere con cura l&#39;involucro dalla camera con un ago da 18 G. NOTA: impedire che il vetro di copertura rompe e che danneggia il foglio di silicio. </li><li> Posizionare lo scivolo del coperchio (con le celle dirette verso l&#39;alto) in una piastra a 4 pozzetti in cima a un tessuto pre-imbevuto di acqua distillata. NOTA: questo impedisce che il vetro di copertura si adesca alla superficie del pozzetto e impedisca l&#39;essiccazione. </li><li> Pipettare 750 μL di soluzione fissativa sulla parte superiore del vetro di copertura e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Nel caso in cui i campioni non possano essere analizzati direttamente,Conservarli in 0,5% PFA (diluito con il tampone di HEPES Tyrode, pH 7,4) a 4 ° C per garantire una fissazione stabile. Procedere alla sezione 8 per elaborare il vetro di copertura per la fotografia. </li><li> Dopo l&#39;uso, sciacquare la camera, il tubo e il foglio con acqua distillata e incubare per una notte in una soluzione detergente. Prima del riutilizzo della camera e di altri componenti, risciacquare con acqua distillata. </li><li> Salvare i file di dati raw del microscopio contenenti tutti i metadati. Se necessario, esportare i filmati su .MOV, h.264 compressi o. AVI non compressi. Salvare i fotogrammi separati come file JPEG o TIF. </li></ol> 8. Preparazione del campione per la microscopia a fluorescenza confocale <ol><li> Trasferire i vetri di copertura a nuovi piatti a 4 pozzetti e sciacquare 5 volte con 3 ml di tampone HEPES Tyrode, pH 7,4. Aggiungere 3 mL / pozzetto di tampone di blocco e incubare per 1 ora a RT. </li><li> Rimuovere il buffer di blocco; Aggiungere 3 ml / pozzetto di glicina 0,15% (M / V) nel tampone di HEPES Tyrode, pH 7,4; E incubare per 15 minuti a RT. </li><li> Rimuovere la soluzione di glicina e lavare 5 volte in 3 mL / pozzetto di tampone di blocco. Facoltativamente, aggiungere anticorpi coniugati con fluoroforo diluiti nel buffer di blocco per ulteriori colorazioni. Incubare per 1 h a RT al buio. </li><li> Lavare 5 volte con tampone di blocco e 2 volte con acqua distillata. Asciugare il vetro rimuovendo il liquido in eccesso con un tessuto (dai bordi verso l&#39;interno), senza toccare le celle. </li><li> Pipettare 60 μL di soluzione di alcool polivinilico su uno scivolo a microscopio. Posizionare il vetro di copertura, con le cellule in basso, in cima alla goccia e lasciare che l&#39;alcool polivinilico si diffonda tra le due superfici. Incubare durante la notte in RT all&#39;oscurità. </li><li> Analizzare le cellule mediante la microscopia confocale 14 . </li><li> Salvare i file di dati raw dei dati registrati dello stack contenenti tutti i metadati. Quando necessario, elaborare i file di dati grezzi nei file compressi MOV, h.264 compressi o .AVI. Salvare gli stack separati come file JPEG o TIF. </li></ol>

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<li>Tersteeg, C., de Maat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmin+cleavage+of+von+Willebrand+factor+as+an+emergency+bypass+for+ADAMTS13+deficiency+in+thrombotic+microangiopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Plasmin cleavage of von Willebrand factor as an emergency bypass for ADAMTS13 deficiency in thrombotic microangiopathy.</a> Circulation. 129 (12), 1320-1331 (2014).</li>
<li>Basir, A., de Groot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Hemocompatibility+Testing+of+Dyneema+Purity+Fibers+in+Blood+Contact%5BTitle%5D)+AND+%22Innovations+%28Phila%29%22%5BJournal%5D)">In Vitro Hemocompatibility Testing of Dyneema Purity Fibers in Blood Contact.</a> Innovations (Phila). 10 (3), 195-201 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In tutto il mondo, la trombosi è una causa principale di morte e morbilità e le piastrine hanno un ruolo centrale nel suo sviluppo. Questo lavoro descrive un metodo per l&#39;imaging a cellule vive della degranulazione piastrinica sotto il flusso. Generalmente si presume che, quando le piastrine si attivano, tutti i contenuti granulari vengono direttamente rilasciati in soluzione. I risultati di accompagnamento suggeriscono che questo non è necessariamente il caso. Durante l&#39;aderenza e la degranulazione, le piastrin...

Le piastrine sono cellule anucleate che circolano nel flusso sanguigno. La loro funzione principale è quella di sigillare le ferite vascolari nei siti di lesioni e di prevenire la perdita di sangue. In questi siti di lesioni, le fibre di collagene subendoteliale diventano esposte e successivamente sono coperte dalla proteina multimerica, il fattore von Willebrand (VWF). VWF interagisce con le piastrine in circolazione in un meccanismo che dipende dal complesso glicoprotein Ibα-IX-V sulla superficie cellulare 1 , rallentando la velocità delle piastrine. Ciò è particolarmente importante a velocità elevate. Le piastrine successivamente subiscono cambiamenti morfologici mentre ricevono impulsi di attivazione dal collagene. Ciò porta ad una diffusione irreversibile e alla fine alla aggregazione piastrinica. Entrambi i processi dipendono dalla secrezione del contenuto di granuli per facilitare la crosstalk piastrinica. Tra gli altri, le piastrine α-granuli contengono fibrinogeno e VWF per assistere l&#39;adesione piastrinica e per ponteLe piastrine insieme in un modo integrin-dipendente. I granuli piastriniti contengono composti inorganici 2 , inclusi il calcio e l&#39;adenosina difosfato (ADP), che contribuiscono a rafforzare l&#39;attivazione delle piastrine. Inoltre, le piastrine contengono mediatori di infiammazione (allergica) 3 , proteine ​​di controllo del complemento 4 e fattori di angiogenesi 5 , 6 , sollevando le questioni di se e come tali contenuti vengono diffusi differenzialmente in condizioni diverse. Dagli anni Ottanta, lo studio della funzionalità piastrinica nei modelli di flusso è stato prezioso per la ricerca di meccanismi trombotici 7 . Da allora, sono stati fatti molti progressi tecnici e sono stati sviluppati modelli di flusso che includono la formazione di fibrina per analizzare il potenziale emostatico dei concentrati terapeutici piastrinici ex vivo 8 oIndagare l&#39;influenza dei disturbi in velocità di taglio sulla morfologia del trombo 9 . Le differenze nei meccanismi molecolari e cellulari che conducono adesione stabile e formazione di trombi fisiologici (emostasi) rispetto alla formazione di trombi patologici (trombosi) possono essere molto sottili e motivare lo sviluppo di modelli di flusso che consentono la visualizzazione in tempo reale di queste subcellulari processi. Un esempio di un processo per cui una tale configurazione sarebbe preziosa è la (ri) distribuzione del polifosfato intracellulare e l&#39;assunzione di fattori di coagulazione per scoprire l&#39;impatto dipendente dal tempo che questo ha sull&#39;ultrastruttura della fibrina 10 . Gli studi sono spesso limitati alle analisi dei punti finali. Lo scopo principale del metodo descritto è quello di consentire l&#39;esame visivo in tempo reale dei processi subcellulari dinamici che si verificano durante l&#39;attivazione piastrinica sotto flusso.

<table><tbody><tr><td>Acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonato (HEPES)&nbsp;</td><td>VWR</td><td>441476L</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S-0876</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>31248</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Merck KGaA</td><td>1.05886</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosio</td><td>Merck KGaA</td><td>1.04074</td><td></td></tr><tr><td>Prostaciclina&nbsp;</td><td>Cayman Chemical</td><td>18220</td><td></td></tr><tr><td>Citrato trisodico</td><td>Merck KGaA</td><td>1.06448</td><td></td></tr><tr><td>Acido citrico</td><td>Merck KGaA</td><td>1.00244</td><td></td></tr><tr><td>Copriocchiali</td><td>Menzel-Gl&auml; ser</td><td>BBAD02400500#A</td><td>24 x 50 mm, n. 1 = spessore 0,13 - 0,16 mm.</td></tr><tr><td>Acido cromosolforico (2% CrO3)</td><td>Riedel de Haen</td><td>07404</td><td>CAS [65272-70-0].</td></tr><tr><td>Fattore Von Willebrand (VWF)</td> <td>purificato</td><td></td><td></td>internamente</tr><tr><td>Fibrinogeno</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>FIB3L</td><td></td></tr><tr><td>Piatto a 4 pozzetti, non trattato</td><td>Thermo Scientific</td><td>267061</td><td></td></tr><tr><td>Frazione di albumina sierica umana V</td><td>Haem Technologies Inc.</td><td></td><td></td>823022</tr><tr><td>Provette per prelievo di sangue, 9 mL, 9NC Coagulazione Citrato di sodio 3,2%</td><td>Greiner Bio-One</td><td>455322</td><td></td></tr><tr><td>Analizzatore cellulare&nbsp;</td>Analizzatore <td></td><td>ematologico CELL-DYN</td> <td>di Abbott Diagnostics</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma</td><td>30525-89-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a siringa</td><td>Harvard Apparatus, Holliston, MA</td><td>Harvard apparatus 22</td><td></td></tr><tr><td>siringa da 10 ml con diametro di 14,5 mm</td><td>BD biosciences</td><td>305959</td><td>Siringa Luer-Lok</td></tr><tr><td>Anti-CD63-biotina&nbsp;</td><td>Abcam&nbsp;</td><td></td><td></td>AB134331</tr><tr><td>Anti-CD62P-biotina&nbsp;</td><td>R& D Systems</td><td>Dy137</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-fenilindolo dicloridrato (DAPI)</td><td>Polysciences Inc.</td><td>9224</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina, Alexa Fluor 488 coniugato</td><td>Thermo Scientific</td><td>S11223&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Olio da immersione</td><td>Zeiss</td><td>444963-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione detergente</td><td>Unilever, Biotex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>56-40-6&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Alcool polivinilico</td><td>Sigma</td><td>9002-89-5</td><td>Mowiol 40-88.</td></tr><tr><td>Tris cloridrato</td><td>Sigma</td><td>1185-53-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Diazabiciclo[2.2.2]ottano (DABCO)</td><td>Sigma</td><td>280-57-9</td><td></td></tr><tr><td>Pecora Anti-hVWF pAb</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>AB9378</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488-NHS</td><td>Thermo Scientific</td><td>A20000</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15523-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>Parafinn film</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>4 pollici x 125 piedi.</td></tr><tr><td>Foglio di silicone non rinforzato</td><td>Nagor</td><td>NA 500-1</td><td>200 mm x 150 mm x 0,125 mm.</td></tr><tr><td>Foglio di silicone tagliato su misura con canali di perfusione e vuoto</td><td>realizzati</td><td></td> internamente <td>Realizzato in foglio di silicone non rinforzato (Nagor, NA 500-1)Provette</td></tr> da <tr><td>1,5 mL</td><td>Eppendorf AG</td><td>T9661-1000AE</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>fluorescente Zeiss Observer Z1&nbsp;</td><td></td><td>Dotato di luci di eccitazione a LED.</td></tr><tr><td>Software per microscopio</td><td>Zeiss ZEN 2</td><td>blue edition</td><td></td></tr><tr><td>18 G ago (18 G x 1 1/2")</td><td>BD biosciences</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Riedel de Haen</td><td>31248375</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roche</td><td>10708976</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta pasteur in plastica</td><td>VWR</td><td>612-1681</td><td>&nbsp; 7 mL non sterile, graduato fino a 3 mL.</td></tr><tr><td>Tubo in silicone</td><td>VWR</td><td>228-0656</td><td>Diametro interno. x Diametro esterno x Spessore della parete = 1,02 x 2,16 x 0,57 mm.</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Thermo Scientific</td><td>ABAA000001##12E</td><td>76 x 26 x 1 mm, bordi rettificati 45 gradi, estremità smerigliata.</td></tr></tbody></table>

imaging di cellule vive di degranulazione piastrinica e secrezione sotto flusso

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Le piastrine di sangue sono giocatori essenziali in emostasi, la formazione di trombi per sigillare violazioni vascolari. Sono anche coinvolti nella trombosi, nella formazione di trombi che occludono la vascolarizzazione e danno gli organi, con conseguenze pericolose per la vita. Questo motiva la ricerca scientifica sulla funzionalità piastrinica e lo sviluppo di metodi per tenere traccia dei processi biologici in fase di flusso. Sono disponibili diversi modelli di flusso per lo studio dell&#39;adesione e dell&#39;aggregazione delle piastrine, due fenomeni chiave della biologia piastrinica. Questo lavoro descrive un metodo per studiare la degranulazione piastrinica in tempo reale in fase di attivazione. Il metodo utilizza una camera di flusso accoppiata ad una messa a punto della pompa a siringa posta sotto un microscopio a fluorescenza a LED basato su ampio campo, invertito. L&#39;impostazione qui descritta consente l&#39;eccitazione simultanea di fluorofori multipli che vengono fornite da anticorpi a fluorescenza o fluorescentiColoranti ent. Dopo gli esperimenti di immagini a cellule vive, i vetri di copertura possono essere ulteriormente elaborati e analizzati utilizzando microscopia statica ( cioè microscopia confocale o microscopia a scansione elettronica).

La figura 1 mostra le immagini della camera di flusso e della configurazione sperimentale; La posizione e le dimensioni del foglio di silicio; E connessioni tubi. La Figura 2 fornisce i dettagli sulle dimensioni della camera di flusso. La figura 3 e il filmato 1 mostrano una serie di immagini di adesione e diffusione piastrinica su VWF immobilizzato. CD63 è una proteina transmembran...

Questo lavoro descrive un metodo basato sulla microscopia a fluorescenza per lo studio dell&#39;adesione piastrinica, della diffusione e della secrezione sotto flusso. Questa piattaforma versatile permette di studiare la funzione piastrinica per la ricerca meccanicistica sulla trombosi e sull&#39;emostasi.

Imaging di cellule vive di degranulazione piastrinica e secrezione sotto flusso

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è monitorare la degranulazione e la secrezione delle piastrine sotto flusso mediante imaging su cellule vive. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia piastrinica. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente un'indagine versatile del contenuto piastrinico a livello subcellulare in cellule vive.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla funzione delle piastrine, può essere applicato anche ad altri tipi cellulari, come i mastociti. In generale, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà a causa di problemi nell'isolamento delle piastrine che comportano una preattivazione. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo capito che la secrezione piastrinica poteva essere valutata solo in fasi terminali.Le immagini in tempo reale forniscono informazioni sulla cinetica del rilascio dei granuli piastrinici. La procedura di isolamento delle piastrine sarà dimostrata da Silvia Pignatelli, una studentessa del nostro istituto. Successivamente, Arjan Barendrecht mostrerà gli esperimenti di imaging in tempo reale.Per iniziare, sgrassare le coprioggetti immergendole per tutta la notte in acido cromosolforico non diluito. Il giorno successivo, risciacquarle con acqua distillata. Successivamente, collocarle per tutta la notte in un forno a 60 gradi Celsius per farle asciugare.Successivamente, posizionare una goccia d'acqua su un banco da laboratorio e applicare sopra la goccia una striscia di pellicola di paraffina di 10 centimetri per 15 centimetri, rimuovendo l'aria tra il banco e la pellicola. Quindi aggiungere con una pipetta gocce da 80 microlitri di fattore di von Willebrand a 10 microgrammi per millilitro o di fibrinogeno a 100 microgrammi per millilitro sulla pellicola di paraffina. Posizionare le coprioggetti asciutte sulle gocce e incubare per un'ora e mezza a temperatura ambiente.Successivamente, aggiungere tre millilitri di buffer bloccante in ciascun pozzetto di una piastra a quattro pozzetti. Trasferire le lamelle con il lato rivestito verso l'alto nei singoli pozzetti della piastra. Incubarle tutta la notte a quattro gradi Celsius.Centrifugare nove millilitri di sangue intero citrato per 15 minuti a 160 ×g senza interruzione. Quindi utilizzare una pipetta Pasteur in plastica per raccogliere il soprannatante contenente il plasma ricco di piastrine. Aggiungere una parte di acido citrato destrosio a nove parti di piastrine in volume per prevenire la preattivazione piastrinica.Quindi centrifugare le piastrine per 15 minuti a 400 ×g senza frenata. Successivamente, rimuovere il soprannatante, lasciando un pellet di piastrine. Quindi risospendere con attenzione il pellet nel buffer HEPES Tyrode a un pH di 6,5 fino al volume originale del campione di piastrine.Quindi, aggiungere prostaciclina alle piastrine risospese. Centrifugare immediatamente il campione e quindi rimuovere il soprannatante. Risospendere delicatamente il pellet nel buffer HEPES Tyrode a un pH di 7.4.Successivamente, posizionare le piastrine lavate in un analizzatore cellulare e contare il numero di piastrine. Regolare il numero di piastrine nel campione a una concentrazione di 150.000 piastrine per microlitro utilizzando tampone HEPES Tyrode a un pH di 7,4. Dopo la risospensione, lasciare riposare le piastrine per 30 minuti a temperatura ambiente prima dell'esperimento.Coprire la parte superiore della camera a flusso con acqua distillata e posizionare su di essa un foglio di silicone personalizzato con il lato liscio rivolto verso il basso. Far galleggiare il foglio nella posizione desiderata rimuovendo l'acqua in eccesso, mantenendo al contempo il foglio al suo posto. Incubare la camera a flusso per un'ora a 60 gradi Celsius per far evaporare l'acqua residua e far aderire saldamente il foglio di silicone alla camera a flusso.Con la pipetta Pasteur in plastica, aggiungere una goccia di tampone HEPES Tyrode a un pH di 7,4 sul canale di flusso. Quindi posizionare il vetrino preparato con il lato rivestito verso il basso sul canale di flusso. Accendere la pompa a vuoto fino a una pressione di circa 10 kilopascal e collegare la pompa a vuoto al raccordo per il vuoto della camera di flusso.Aggiungere 10 microgrammi per millilitro di colorante DAPI ai trombociti lavati e avvolgere il tubo contenente i trombociti con carta d'alluminio. Incubare quindi per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Per prevenire l'attivazione dei trombociti, aggiungere prostaciclina a una concentrazione finale di 10 nanogrammi per millilitro e centrifugare immediatamente i trombociti per 15 minuti a 400 volte G senza utilizzare il freno, al fine di rimuovere il DAPI non legato.Risospendere il pellet di piastrine nel buffer HEPES Tyrode a un pH di 7,4 fino al volume originale, ottenendo una concentrazione di 150.000 piastrine per microlitro. Successivamente, accendere il microscopio a fluorescenza e avviare il software del microscopio. Impostare i parametri di acquisizione come descritto nella tabella uno del protocollo testuale allegato.Ostruire il tubo di ingresso collegando una siringa da 10 millilitri ed aspirando il buffer di blocco all'interno del tubo di ingresso. Bloccare per 15 minuti a temperatura ambiente, quindi risciacquare il tubo di ingresso aspirando il buffer HEPES Tyrode 7,4 all'interno del tubo di ingresso. Collegare il tubo di ingresso bloccato e il tubo di uscita non trattato rispettivamente all'ingresso e all'uscita della camera.Quindi collegare la siringa da 10 millilitri al tubo di uscita. Applicare una goccia di olio di immersione su un obiettivo da 100 volte e montare la camera sul microscopio con la superficie di vetro rivolta verso il basso. Successivamente, posizionare il tubo di ingresso in un tubo contenente buffer HEPES Tyrode a un pH di 7,4.Estrarre manualmente lo stantuffo della siringa collegata al tubo di uscita per far passare la soluzione attraverso la camera ed eliminare l'aria dal sistema. Successivamente, inserire la siringa nella pompa per siringa ed eseguire brevemente la pompa per fissare lo stantuffo e garantire un flusso stabile. Con il sistema di flusso ormai pronto, aggiungere gli anticorpi e/o i coloranti alla sospensione di piastrine e mescolare con attenzione.Quindi comprimere il tubo di ingresso e spostarlo dal tampone al tubo contenente le piastrine marcate. Selezionare la visualizzazione in tempo reale nel software. Mettere a fuoco il microscopio sulla superficie del vetrino e avviare la pompa a 484 microlitri al minuto.Fare funzionare la pompa fino a quando le piastrine raggiungono la camera di flusso. Successivamente, ridurre la velocità di flusso a 7,5 microlitri al minuto. Monitorare la superficie del vetrino coprioggetto.Una volta che la prima piastrina inizia ad aderire, mettere a fuoco il microscopio su questa piastrina e avviare la registrazione attivando l'esperimento nel software. Registrare per 30 minuti, quindi fermare la pompa a siringa. Salvare i file dati grezzi del microscopio contenenti tutti i metadati.Se necessario, esportare i filmati in formato MOV H 264 compresso o AVI non compresso. Salvare i fotogrammi singoli come file JPEG o TIF. Al termine dell'acquisizione delle immagini, rimuovere la camera dal microscopio, pulire l'olio di immersione dal vetro, scollegare il vuoto ed estrarre con attenzione il coprioggetto dalla camera utilizzando un ago da 18 gauge.Posizionare il vetrino con le cellule rivolte verso l'alto in una nuova piastra a quattro pozzetti, sopra un tessuto precedentemente inumidito con acqua distillata. Quindi aggiungere con una pipetta 750 microlitri di soluzione fissativa sopra il vetrino e incubare per un'ora a temperatura ambiente al buio. Nel caso in cui i campioni non possano essere analizzati immediatamente, conservarli in paraformaldeide allo 0,5% a quattro gradi Celsius per garantire una fissazione stabile.Questo mostra la serie temporale dell'adesione e dello spreading delle piastrine su vetrini ricoperti con fattore di von Willebrand immobilizzato. In verde è mostrato il CD63, una proteina transmembrana che viene reclutata sulla superficie piastrinica in maniera dipendente dal tempo. Analogamente, in arancione, la P-selectina è anch'essa una proteina transmembrana inserita nella membrana dei granuli alfa intracellulari che arrestano le piastrine.Dopo un esperimento di flusso, la microscopia a fluorescenza confocale può essere utilizzata per produrre una serie di inclinazione dell'adesione delle piastrine. Qui si osserva che CD63 è localizzato principalmente nel granulomero centrale, mentre la P-selectina è distribuita su tutta la massa cellulare e appare concentrata ai margini. In questi esperimenti, le piastrine, che non possiedono DNA nucleare, sono state preincubate con DAPI, che appare di colore blu.In questo caso, il DAPI colora i polifosfati e i granuli densi. La colorazione verde che appare successivamente indica il reclutamento dipendente dal tempo di CD63 sulla superficie delle piastrine. Nonostante evidenti segni di rilascio dei granuli densi, l'analisi a singola cellula mostra che il polifosfato viene trattenuto all'interno o all'esterno di queste piastrine.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in sei ore per quattro esperimenti di flusso individuali. Durante il tentativo di questa procedura, è fondamentale prevenire la preattivazione delle piastrine. Questo risultato può essere ottenuto manipolando con attenzione la sospensione cellulare.Al termine di questa procedura, altri metodi come la microscopia confocale possono essere utilizzati per ottenere ulteriori informazioni sulla distribuzione tridimensionale delle molecole bersaglio. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come studiare la funzione delle piastrine sotto flusso a livello di singola cellula.

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