Name: Blocco di uno strumento ad ultrasuoni per la conduzione del nervo in modelli di ratto diabetico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Scopri come bloccare la conduzione nervosa periferica con ultrasuoni focalizzati ad alta intensità nel modello di ratto Sprague-Dawley diabetico. Questa tecnica offre un approccio sicuro e ripetibile per la gestione del dolore neuropatico.

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Lo studio è stato sostenuto dal Ministero della scienza e tecnologia (progetto più 105-2221-E-400-001) e istituti di ricerca salute nazionale (progetto BN-105-PP-10), Taiwan.

the Animal Care istituzionali e Comitato di uso degli istituti nazionali di ricerca salute in Taiwan ha approvato tutti i protocolli animali.
 1. induzione di modello diabetico nel maschio adulto Sprague - Dawley (deviazione standard) ratti <ol><li>rimuovere palline dell'alimento del ratto dalla gabbia per ratti SD maschi veloce (300-350 g) per 6 h prima di induzione di STZ.</li>
	Buffer di <li>preparare il citrato di sodio (0,1 M, pH 4,5).
	<ol><li>Sciogliere 1,05 g acido citrico monoidrato (C 6 H 8 O 7 · H 2 O; mol WT 210.14) in 50 mL di acqua distillata acqua per fare una soluzione di acido citrico 0.1 M.</li>
		<li>Sciogliere 1,47 g citrato trisodico biidrato (C 8 H 5 O 7 Na 3 · 2 H 2 O; mol WT 294,12) in 50 mL di acqua distillata acqua per fare una soluzione di citrato di sodio 0,1 M.</li>
		<li>Soluzione di acido citrico aggiungere 25 mL a 25 mL di soluzione di citrato di sodio. Monitorare il pH del tampone di citrato di sodio (pH 4,5) utilizzando un misuratore di pH. 
		Nota: Il buffer è reso isotonico con aggiunta di un appropriato volume della soluzione di citrato di sodio 0,1 M.</li>
	</ol></li> <li>STZ sciogliere in tampone citrato di sodio 0.1 M per produrre un 50 mg/mL soluzione STZ. 
	Nota: La soluzione STZ è sensibile alla luce, pertanto, coprire la soluzione STZ con carta stagnola e utilizzare entro 15-20 min.</li>
	<li>Disegnare la soluzione STZ di 50 mg/kg in una siringa di insulina o tubercolina 1 mL con ago 26 - 28 gauge. pulite il sito di iniezione con un tampone di etanolo e intraperitonealmente iniettare la soluzione STZ il quadrante inferiore destro dell'addome per evitare di danneggiare organi addominali. </li> <li>Ratti con acqua del 10% di saccarosio di alimentazione come la fonte di acqua solo per 48 h dopo l'iniezione di STZ per prevenire l'ipoglicemia.</li></ol>
 2. conferma di diabete in ratti indotti STZ <ol><li>Monitor la concentrazione di glucosio digiuno del plasma di tutti i ratti iniettati di STZ post 72h con un misuratore di glucosio.
	<ol><li>Veloce di ratti diabetici indotti STZ per 15 h prima di misurare il digiuno sangue livello di glucosio.</li>
		<li>Reprimere i ratti in un sacchetto di contenimento ed esporre le code per la raccolta di sangue durante le misure della glicemia.</li>
		<li>Usare una lancetta di sangue a pungere la punta della coda per ottenere una piccola goccia di sangue. Posizionare la goccia di sangue su una striscia di test del glucosio. Registrare i livelli del glucosio plasmatico a digiuno. 
		Nota: Il misuratore di glucosio rileva e visualizza il livello di glucosio nel sangue in mg/dL. Escludere i ratti con i livelli della glicemia a digiuno inferiore a 150 mg/dL dopo 2 settimane di STZ-induzione.</li>
	</ol></li></ol> 3. Valutazione della neuropatia periferica diabetica in ratti diabetici <ol><li>valutare l'allodinia meccanica con elettronica von Frey.
	<ol><li>Abituare l'indotto STZ ratti diabetici in una gabbia su un pavimento di maglia metallica di diametro 1 cm per 30 min prima di valutare la cerva zampa risposta ritiro.</li>
		<li>Utilizzare una sonda elettronica di von Frey con punta rigida (0,8 mm di diametro) per applicare manualmente la pressione alla superficie plantare della zampa posteriore dei ratti e aumentare gradualmente la pressione fino a una risposta di ritiro della zampa è riscontrabile.</li>
		<li>Registrare la pressione che mostra il sistema e ripetizione la misurazione 5 volte per ratto, con un intervallo di 30 s tra ogni misurazione.</li>
	</ol></li> <li>Valutare l'iperalgesia calore con un piatto caldo.
	<ol><li>Habituate ratti diabetici indotti STZ sulla piastra calda (24 ± 0,5 ° C) per 10 min prima di valutare la risposta al dolore.</li>
		<li>Rimuovere e riposizionare i ratti nella loro gabbie dopo l'assuefazione, riscaldare la piastra riscaldante e mantenere la piastra calda &#39; s temperatura a 55 ± 0,5 ° C.</li>
		<li>Posto il ratto sulla piastra calda riscaldata mentre simultaneamente a partire il timer.</li>
		<li>Quando il ratto esibisce comportamenti distinti, come leccare il posteriore della zampa o anormalmente flicking hind zampa, arresta il timer e registra la latenza di ritiro. 
		Nota: Se un ratto non esprime comportamenti distinti dopo 20 s (20 s Cut-off time), terminare il test della piastra calda e rimuovere il ratto dalla piastra scaldante.</li>
	</ol></li></ol> 4. In Vivo Blocco di conduzione con il trasduttore HIFU del nervo Nota: l'esperimento in vivo inizia settimana 5 dopo l'iniezione di 50 mg/kg STZ.
<ol><li>Eseguire procedure animale prima di bloccare di CMAPs con sonicazione HIFU.
	<ol><li>Sterilizzare gli strumenti chirurgici (bisturi, forbici, pinze e gancio di vetro) in autoclave prima della chirurgia.</li>
		<li>Anestetizzare i ratti con l'iniezione intraperitoneale di tiletamina/zolazepam miscela (40 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) o tramite inalazione dell'1,75% di isoflurane tramite vaporizzatore isoflurano. Posizionare i ratti su un rilievo di riscaldamento per mantenere la temperatura del corpo.</li>
		<li>Posizionare i ratti per la chirurgia in decubito ventrale. Applicare l'unguento dell'occhio. Estendere la gamba del ratto e un pizzico della superficie plantare del piede con le unghie per accertare la profondità dell'anestesia. Se i ratti mostrano le risposte ritiro, applicare ulteriore anestesia.</li>
		<li>Rimuovere i capelli dalla coscia e bassa della schiena dei ratti con una tosatrice elettrica. Applicare iodio liquido con una garza pulita al luogo chirurgico e spostarsi circolarmente la garza l'andata del sito chirurgico. Utilizzare un tampone imbevuto di alcool per pulire lo iodio liquido con lo stesso movimento circolare. Questo esperimento viene eseguito sul sito sinistro e destra chirurgico. Ripetere la procedura presso l'altro sito chirurgico quando eseguire il passaggio successivo della procedura di.</li>
		<li>Utilizzare un forbici chirurgiche sterili o bisturi per fare un'incisione della pelle alla coscia dorsale. Usare le forbici chirurgiche smussate per attentamente separare il tessuto sotto la pelle e proteggere la pelle con pelle ganci. femore può essere visto all'interno dei muscoli.</li>
		<li>Utilizzare le forbici per separare con cura i muscoli paralleli al femore, fino a quando le fibre di nervo sciatico metà coscia che sono incorporate nei muscoli sono visibili. Utilizzare con attenzione un gancio di vetro per separare il nervo sciatico metà coscia dal circostante tessuto connettivo e muscoli.</li>
	</ol></li> <li>Posizionare il nervo sciatico nella zona focale HIFU usando un fixator su ordine del nervo ( Figura 1 e Figura 3). 
	Nota: Il fixator su ordine del nervo è costituito da 3 componenti ( Figura 3). Tutti i componenti sono fatti di trasparente polimetilmetacrilato (PMMA). La filettatura esterna della struttura superiore della componente I è di 2,5 mm di altezza e M10XP0.7 ( Figura 4A). Il pozzo centrale è un 4.0 mm-diametro del foro tramite componente ho. L'apertura inferiore del pozzo è sigillata da un foglio di nastro. Il diametro dello slot è di 1,2 mm e la distanza tra il piano centrale dello slot e la superficie superiore della componente I è 3,1 mm. componente II è costituito da un corpo principale, quattro gambe e la struttura di fondo ( Figura 4B). La filettatura interna della struttura inferiore è 2,5 mm di altezza e M10XP0.7 per adattare la filettatura esterna del componente io. Il diametro del foro centrale è lo stesso come il pozzo centrale del componente io. Le dimensioni del corpo principale sono 32 mm di diametro e spessore 5,4 mm. Quattro gambe sono distribuite simmetricamente. Due gambe corte identiche sono progettate per l'allineamento e due gambe lunghe identiche lavoro per aggancio sul componente III. Il diametro esterno e l'altezza del componente III sono 41 e 9,2 mm. La filettatura interna è M36XP1.0 e il foro passante è 27,5 mm di diametro (< forte classe = "xfig"> Figura 4). Il cono è un cono vuoto con l'apertura superiore di 84 mm di diametro e l'apertura inferiore di 27,5 mm di diametro. L'altezza è di 57,5 mm ( Figura 5A).
	<ol><li>Prima dell'esperimento, immergere il fixator nervo acrilico su misura in soluzione di candeggina per 30-60 min seguita da immersione in acqua sterile.</li>
		<li>Usando un gancio di vetro, sollevare con cura il nervo e metterlo nello slot del componente I.</li>
		<li>Componente vite II al componente I. riempimento centrale Beh del componente, con suoneria &#39; soluzione di s per la conservazione del nervo e propagazione ultrasuoni.</li>
		<li>Vite componente III per il cono di alloggiamento HIFU. Componente di dock per iPod III con componente II attraverso le quattro gambe della componente II. 
		Nota: Il centro geometrico di tre componenti e il trasduttore sono allineati. La distanza tra il nervo e il trasduttore è uguale alla lunghezza focale, che assicura il nervo è all'interno della zona focale di HIFU.</li>
	</ol></li> <li>Inserire una coppia di aghi per agopuntura l'origine del nervo sciatico e l'altra coppia nel muscolo gastrocnemio. Collegare ogni coppia di aghi per il sistema di acquisizione di elettrofisiologia attraverso un cavo elettrico coassiale ( Figura 1). 
	Nota: Su un'estremità del cavo sono due morsetti a coccodrillo per ritagliare due aghi separatamente e sull'altra estremità del cavo è un connettore BNC per il collegamento del sistema. Le coppie di aghi per agopuntura funzionano come stimolanti elettrodi al nervo sciatico e gli elettrodi di registrazione presso il muscolo gastrocnemio.
	<ol><li>Impostare la frequenza di campionamento e la larghezza di banda del sistema di acquisizione di elettrofisiologia a 50 kHz e 70 Hz - 3kHz, rispettivamente. Applicare uno stimolo sovra-maximal con una larghezza di impulso di 0.1 ms per gli elettrodi di stimolazione all'origine del nervo sciatico.</li>
		<li>Registrare CMAPs dagli elettrodi di registrazione e amplificare la CMAPs con l'amplificatore incorporato nel sistema di acquisizione di elettrofisiologia. 
		Nota: Utilizzare l'amplificatore incorporato nel sistema di acquisizione di elettrofisiologia per amplificare i segnali nervosi e registrare CMAPs dagli elettrodi di registrazione con il sistema di acquisizione di elettrofisiologia.</li>
	</ol></li> <li>Utilizzare un trasduttore HIFU 2,68 MHz commerciale per sopprimere il CMAPs in ratti diabetici neuropatici. 
	Nota: Le specifiche del trasduttore sono descritti come segue: una ciotola di singolo elemento sferica con apertura diametro di 6 cm e lunghezza focale di 5 cm e una zona focale dell'elissoide di 4 mm in profondità e 0,8 mm di larghezza in campo libero.
	<ol><li>Immergere il cono sferico, il trasduttore HIFU e il cono copertura nel serbatoio riempito d'acqua degassato. Mettere il trasduttore HIFU nel cono sferico e fissare il coperchio del cono all'apertura superiore del cono sferico da 6 viti a testa ( figura 5B). Dopo che bolle nel cono sferica sono espulso naturalmente grazie alla bassa densità di rispetto con l'acqua bolle, sigillare l'apertura front-end del cono di un nastro trasparente 0,03 mm di spessore. Componente di vite III sul cono sferico.</li>
		<li>Estrarre il trasduttore HIFU con il cono di forma sferica e componente III dal serbatoio dell'acqua degassato. 
		Nota: L'acqua di osmosi inversa utilizzata nello studio è l'acqua purificata dal processo di osmosi inversa. L'acqua di osmosi inversa è bollito per espellere il gas. Dopo il raffreddamento, l'acqua degassato viene ottenuta in un singolo serbatoio sigillato.</li>
	</ol></li> <li>Messo componente ho nello spazio tra il nervo e il muscolo con attenzione e posizionare il nervo del divario di passaggi dei. eseguire componente 4.2.3 e 4.2.4 per garantire che il nervo è all'interno della zona focale l'HIFU ( Figura 3A < / forte >).</li>
	<li>Collegare un generatore di funzione e un amplificatore di potenza di radiofrequenza. Collegare l'amplificatore al trasduttore HIFU per la generazione del fascio HIFU. Impostare manualmente la tensione di uscita del generatore di funzione per il trasduttore HIFU tramite l'amplificatore di potenza. Disattivare manualmente il generatore di funzione una volta che il tempo di esposizione di HIFU è scaduto. Osservare ora utilizzando un timer. 
	Nota: L'intensità e l'energia del fascio HIFU utilizzato in questo studio sono 2.810 W/cm 2 e 84 J/mm 2, rispettivamente.</li>
	<li>Inviare simultaneamente, lo stimolo attraverso il sistema di acquisizione di elettrofisiologia (punto 4.3) e trave HIFU tramite sistema HIFU (punto 4.6) al nervo sciatico durante la registrazione il CMAPs. Aumentare gradualmente l'esposizione HIFU sul nervo sciatico da 3 s, 5 s per 8 s fino a quando si osserva la diminuzione o l'inibizione dell'ampiezza di CMAPs.
	Fascio <ol><li>record CMAPs una volta al secondo durante il parto la HIFU. Dopo aver osservato il cambiamento nell'ampiezza di CMAPs, spegnere il sistema HIFU e manualmente, fare clic sull'icona di registrazione del software di acquisizione di elettrofisiologia a record CMAPs ogni 2 min con i primi 10 min, ogni 5 min in consecutivi 30 min e ogni 10 min nella ultima fase il tempo di registrazione fino a 2 h.</li>
	</ol></li> <li>Componente separato II e III del fissatore del nervo ( Figura 3) per rimuovere il trasduttore HIFU dal sito di incisione. Io per rilasciare il nervo sciatico protetto e componente separato II. Sutura del sito chirurgico del ratto diabetico di suture catgut cromico 4-0 dopo aver registrato il CMAPs. Applicare liquido iodio al sito chirurgico per prevenire l'infezione.
	<ol><li>Collocare le gabbie sul tappetino di riscaldamento e consentire i ratti recuperare nelle loro gabbie prima di restituirli all'alloggio degli animali. Fornire i ratti con ibuprofene in acqua potabile per 3 giorni o l'iniezione intraperitoneale di buprenorfina (0,05 - 0,1 mg/kg).</li>
	</ol></li> <li>Inserire elettrodi stimolanti e registrazioni nell'origine del nervo sciatico e i muscoli gastrocnemio di ratti anestetizzati in neuropatici diabetici come descritto ai punti 4.1.2 e 4.3 nei giorni 7, 14 e 28 dopo la sonicazione HIFU iniziale. Ripetere i passaggi da 4.3.1 a 4.3.2.
	<ol><li>Collocare le gabbie sul tappetino di riscaldamento e consentire i ratti recuperare nelle loro gabbie prima di spostare le gabbie all'alloggio degli animali.</li>
	</ol></li> <li>Euthanize i ratti dopo l'esperimento. Posto il ratto in una camera di anidride carbonica. Attendere circa 5 minuti per i ratti a smettere di respirare. Assicurarsi che il cuore ha smesso di battere.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Parziale e temporanea soppressione di action potentials dei nervi neuropatici da ratti diabetici in vivo e la presenza immediata dell'effetto di blocco dopo il trattamento HIFU, che entrambi sono stati osservati. Lo studio di follow-up 28 giorni su CMAPs ha dimostrato che un blocco sicuro della conduzione del nervo potrebbe essere effettuato a un'appropriata esposizione HIFU. Di conseguenza, il protocollo di cui sopra del trattamento HIFU può fornire una soluzione alternativa per il blocchetto di conduzione reve...

Farmaci per via orale,1di agopuntura e di stimolazione nervosa elettrica2 sono stati utilizzati per il trattamento della polineuropatia diabetica dolorosa. Tuttavia, gli effetti collaterali dei farmaci orali, operazione invasiva di agopuntura e stimolazione elettrica del nervo ostacolare l'efficacia terapeutica e l'aderenza del paziente. Blocco di ecografia dei nervi periferici in modelli animali è stato studiato per decenni3,4,5. La conduzione di in vitro dei nervi sciatico della grande rana verde è stata inibita reversibilmente dopo il trattamento di 10-20 impulsi di esposizione di ultrasuono per 0,4 - 1,0 s6. Un fattore di bloccare la conduzione del nervo è l'aumento di temperatura indotta da ultrasuoni7. Per i pazienti con polineuropatia, la soppressione dei potenziali d'azione muscolare composto (CMAPs) è stata eseguita nel nervo peroneo esposto a ultrasuoni a bassa intensità per 2 min8. Il tempo di recupero completo è stato entro 5 min.
Recentemente, la Food and Drug Administration degli Stati Uniti ha approvato HIFU come un trattamento non invasivo per fibromi uterini9, palliations di dolore di osso metastasi10e11di carcinoma della prostata. Un trasduttore HIFU emette fasci acustici all'esterno del corpo, e le travi trasmettono in vari mezzi di tessuto e convergono sul tumore bersaglio al fuoco. La zona focale è formata immediatamente per generare effetti localizzati sui tumori di destinazione senza danneggiare i tessuti circostanti. HIFU è stato applicato anche per inibire la conduzione del nervo o causare denervazione del nervo in esperimenti in vivo di normale di ratti Sprague-Dawley (deviazione standard)12. Inoltre, gli effetti a breve e a lungo termine di HIFU sui nervi neuropatici sono state indagate13. I risultati precedenti hanno dimostrato che il blocco reversibile o permanente della conduzione del nervo sensoriale potrebbe essere realizzato da HIFU con i parametri appropriati. Oltre alle applicazioni analgesiche, HIFU potrebbe essere utilizzato come strumento per indagare il contributo relativo delle componenti periferici e centrali al blocco di conduzione del nervo per ricerca di base di neurologia e sviluppo del farmaco di dolore. Di conseguenza, è necessaria una piattaforma tecnologica di blocco HIFU specifica per i nervi periferici in modelli animali. Lo scopo di questo articolo è quello di illustrare le procedure per parzialmente o completamente bloccando i potenziali di azione dei nervi periferici in ratti diabetici neuropatici di HIFU. Modelli di ratto diabetico e valutazione dei sintomi neuropatici periferici sono stati stabiliti. Una piattaforma HIFU e processi sperimentali specifici per il trattamento dei nervi sciatico di ratto sono presentati.

<table><tbody><tr><td>streptozotocina</td><td>Sigma</td><td>85882</td><td></td></tr><tr><td>acido citrico monoidrato&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>citrato trisodico diidrato</td><td>Sigma</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>glucometri</td><td>Roche Accu-Check Active</td><td>GC</td><td></td></tr><tr><td>dispositivo elettronico von Frey</td><td>IITC Life Science</td><td>2390</td><td></td></tr><tr><td>piastra riscaldante</td><td>IITC Life Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biopac MP36 sistema di acquisizione Biopac Systems</td><td>, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trasduttore HIFU</td><td>Sonic Concepts</td> Generatore di funzioni <td>H108</td><td></td></tr><tr><td></td> Amplificatore di potenza <td>Agilent</td><td>33250A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Elettronica & Innovazione</td><td>1040L</td><td></td></tr><tr><td>Ratti&nbsp;</td><td>Biolasco taiwan</td><td>Sprague-Dawley</td><td></td></tr><tr><td>Puralube unguento veterinario</td><td>Dechra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>isoflurano vaporizzatore</td><td>Parkland</td><td>Scientific V3000PS</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurance</td><td>Attane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Restraint bag (Decapicones)</td><td>Braintree Scientific</td><td>DC 200</td><td></td></tr></tbody></table>

blocco di uno strumento ad ultrasuoni per la conduzione del nervo in modelli di ratto diabetico

An Ultrasonic Tool for Nerve Conduction Block in Diabetic Rat Models

Blocchetto di conduzione del nervo con un trasduttore di ultrasuoni ad alta intensità-focalizzati (HIFU) è stata eseguita recentemente in modelli animali normali e diabetici. HIFU è in grado di bloccare reversibilmente la conduzione dei nervi periferici senza danneggiare i nervi durante l'utilizzo di un parametro appropriato ad ultrasuoni. Blocco temporaneo e parziale dei potenziali d'azione dei nervi dimostra che HIFU ha il potenziale per essere un trattamento clinico utile per alleviare il dolore. Questo lavoro dimostra le procedure per sopprimere i potenziali di azione dei nervi neuropatici in ratti diabetici in vivo usando un trasduttore HIFU. Il primo passo è quello di generare ratti neuropatici diabetici maschio adulto di iniezione di streptozotocin (STZ). Il secondo passo è quello di valutare la neuropatia periferica diabetica in ratti diabetici indotti STZ da una sonda elettronica di von Frey e un piatto caldo. Il passo finale è quello di registrare in vivo extracellulare potenziali di azione del nervo esposto a sonicazione HIFU. Il metodo mostrato qui può trarre giovamento lo studio di applicazioni analgesico ad ultrasuoni.

Lo Studio in vivo ha dimostrato che, con una dose HIFU di 3 sonicazione di s ad un'intensità di 2.810 W/cm2, la CMAPs sono stati soppressi dal 20% del valore basale, ma essi sono stati completamente recuperati dopo 30 min (Figura 2A, diamanti) e sono stati quasi costante nel periodo di 28 giorni (Figura 2B, diamanti). Per l'esposizione HIFU s 5 presso la stessa intensità, il CMAPs è diminuito a 65,4% (9,5%) de...

Questo lavoro presenta la metodologia di applicazione di ultrasuoni ad alto intensità-focalizzati per bloccare i potenziali di azione dei nervi neuropatici diabetici.

Blocco di uno strumento ad ultrasuoni per la conduzione del nervo in modelli di ratto diabetico

Nerve conduction block with a high intensity-focused ultrasound (HIFU) transducer has been performed in normal and diabetic animal models recently. HIFU ...

L'obiettivo generale di questa tecnica ecografica è eseguire un blocco temporaneo della conduzione nervosa periferica mediante l'effetto termico degli ultrasuoni. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della gestione del dolore, come l'analgesia nella neuropatia periferica diabetica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'esposizione agli ultrasuoni sul nervo bersaglio è localizzata e ripetibile.Le implicazioni di questa tecnica sono orientate verso l'analgesia del dolore neuropatico umano poiché il trattamento con ultrasuoni è un processo molto sicuro e di lunga durata. La procedura sarà dimostrata da Cheng Jung-Sung e Tan Joo-Shin insieme a tecnici di laboratorio. Dopo aver sottoposto ratti maschi Sprague-Dawley o ratti SD al digiuno e aver preparato la soluzione di STZ secondo il protocollo indicato nel testo, utilizzare un ago da 26 o 28 gauge per aspirare la soluzione di STZ da 50 milligrammi per chilogrammo in una siringa da un millilitro per insulina o tubercolina.Utilizzare un tampone alcolico per pulire il sito di iniezione sui ratti e iniettare la soluzione di STZ nell'addome dell'animale. A 72 ore dalla somministrazione, misurare la concentrazione plasmatica di glucosio a digiuno di tutti i ratti iniettati, utilizzando un lancetta per pungere la punta della coda ed ottenere una piccola goccia di sangue. Applicare la goccia di sangue su una striscia reattiva per il glucosio e inserirla in un glucosimetro prima di registrare i livelli plasmatici di glucosio a digiuno.Per abituare un ratto diabetico indotto da STZ, trasferirlo in una gabbia con un pavimento a maglia metallica di un centimetro di diametro per 30 minuti. Successivamente, per valutare la risposta di ritrazione della zampa posteriore, utilizzare una sonda elettronica di Von Frey con una punta rigida per applicare manualmente una pressione sulla superficie plantare della zampa posteriore dei ratti e aumentare gradualmente la pressione fino a quando si osserva una risposta di ritrazione della zampa. Registrare la pressione e attendere 30 secondi prima di ripetere la misurazione.Cinque settimane dopo l'iniezione di STZ, dopo aver anestetizzato i ratti ed eseguito una compressione della superficie plantare del piede secondo il protocollo descritto, utilizzare un rasoio elettrico per rimuovere i peli dalla coscia e dalla parte bassa della schiena. Applicare iodio liquido sulla pelle nell'area chirurgica. Successivamente, utilizzare un tampone alcolico per rimuovere lo iodio liquido.Con un bisturi sterile, praticare un'incisione della cute nella regione posteriore della coscia. Utilizzare forbici chirurgiche per allargare il tessuto sottostante la cute e fissare la cute con ganci appositi. Con le forbici, separare con attenzione i muscoli in senso parallelo al femore fino a quando i filetti del nervo sciatico, situati al centro della coscia e incorporati nei muscoli, diventano visibili.Utilizzare con attenzione un uncino di vetro per separare il nervo sciatico a livello della coscia media dai tessuti connettivi e dai muscoli circostanti. Successivamente, per posizionare il nervo sciatico nella zona focale dell'ultrasuono focalizzato ad alta intensità, o HIFU, utilizzando un fissatore del nervo su misura, sollevare con cura il nervo con un uncino di vetro e inserirlo nella fessura del componente uno del dispositivo. Poi, avvitare il componente due al componente uno.Quindi utilizzare la soluzione di Ringer per riempire il pozzetto centrale del componente uno per la propagazione ultrasuonica e la conservazione del nervo. Avvitare il componente tre al cono dell'alloggiamento HIFU. Successivamente, attraverso le quattro gambe del componente due, collegare il componente tre al componente due.Dopo aver inserito una coppia di aghi di agopuntura nella sede di origine del nervo sciatico e l'altra coppia nel muscolo gastrocnemio, collegare ogni coppia di aghi al sistema di acquisizione elettrofisiologica tramite un cavo elettrico coassiale. Impostare la frequenza di campionamento e la larghezza di banda del sistema di acquisizione elettrofisiologica rispettivamente a 50 kilohertz e da 70 hertz a 3 kilohertz. Successivamente, applicare alla sede di origine del nervo sciatico uno stimolo sovramassimale con una larghezza d'impulso di 0,1 millisecondi agli elettrodi stimolanti.Nel sistema di acquisizione di elettrofisiologia, registrare i potenziali d'azione muscolari composti o CMAP dagli elettrodi di registrazione e amplificare i CMAP con l'amplificatore integrato. Per utilizzare un trasduttore HIFU commerciale da 2,68 millihertz per sopprimere i CMAP nei ratti con neuropatia diabetica, immergere il cono sferico, il trasduttore HIFU e il coperchio del cono nel serbatoio riempito con acqua disgassata. Inserire il trasduttore HIFU nel cono sferico e utilizzare sei viti testa per fissare il coperchio del cono all'apertura superiore del cono sferico.Dopo che le bolle nel cono sferico sono state espulse naturalmente a causa della bassa densità delle bolle rispetto all'acqua, utilizzare un nastro trasparente dello spessore di 0,03 millimetri per sigillare l'apertura all'estremità anteriore del cono. Quindi avvitare il componente tre sul cono sferico ed estrarre il trasduttore HIFU con il cono sferico e il componente tre dalla vasca d'acqua disgassata. Inserire con attenzione il componente uno nello spazio tra il nervo e il muscolo e posizionare il nervo nella fessura del componente uno.Per assicurarsi che il nervo si trovi nel fuoco dell'HIFU come dimostrato in precedenza, avvitare il componente due al componente uno. Dopo aver avvitato il componente tre al cono dell'alloggiamento HIFU, attraverso i quattro piedini del componente due, collegare il componente tre al componente due e utilizzare soluzione di Ringer per riempire il pozzetto centrale del componente uno, al fine di garantire la propagazione degli ultrasuoni e la conservazione del nervo. Collegare un generatore di funzioni e un amplificatore di potenza a radiofrequenza.Collegare l'amplificatore di potenza al trasduttore HIFU per generare il fascio HIFU. Impostare quindi manualmente l'uscita di tensione del generatore di funzioni al trasduttore HIFU tramite l'amplificatore di potenza e impostare un timer per misurare il tempo di esposizione all'HIFU. Spegnere manualmente il generatore di funzioni una volta terminato il tempo di esposizione all'HIFU.Applicare contemporaneamente lo stimolo tramite il sistema di acquisizione di elettrofisiologia e il fascio di ultrasuoni focalizzati ad alta intensità (HIFU) tramite il sistema HIFU al nervo sciatico, registrando nel contempo i potenziali muscolari compositi (CMAP). Aumentare gradualmente l'esposizione al fascio HIFU sul nervo sciatico da tre secondi, a cinque secondi, quindi a otto secondi, fino a osservare una riduzione o inibizione dell'ampiezza dei CMAP. Registrare i CMAP una volta al secondo durante l'applicazione del fascio HIFU.Dopo aver osservato il cambiamento nell'ampiezza dei CMAP, spegnere il sistema HIFU e fare clic manualmente sull'icona Registra nel software di acquisizione elettrofisiologica per registrare i CMAP per due ore. Dopo aver rimosso i componenti del fissatore nervoso, suturato la sede chirurgica del ratto diabetico e aver permesso ai ratti di riprendersi, nei giorni sette, 14 e 28 successivi alla prima sonicazione con HIFU, inserire nuovamente gli elettrodi stimolanti e di registrazione nei ratti neuropatici diabetici anestetizzati come in precedenza e registrare ulteriori CMAP come dimostrato in precedenza in questo video. Lo studio in vivo mostrato in questo video ha dimostrato che con un'ultrasuonografia focalizzata ad alta intensità, o dose HIFU di tre secondi di sonicazione a un'intensità di 2810 watt per centimetro quadrato, i CMAP sono stati soppressi del 20 per cento rispetto al valore basale, ma si sono completamente ripresi dopo 30 minuti.Per l'esposizione HIFU di cinque secondi alla stessa intensità, i potenziali d'azione muscolari composti (CMAP) sono diminuiti al 65,4 per cento del valore basale a quattro minuti e si sono ripristinati al 73,7 per cento del valore basale entro 120 minuti. I CMAP non sono tornati ai livelli basali fino al giorno 14. Quando il tempo di sonicazione HIFU è stato aumentato a 8 secondi alla stessa intensità, i CMAP sono scesi al 26 per cento del valore basale a quattro minuti, sono aumentati al 38 per cento del valore basale a 120 minuti e sono gradualmente aumentati fino al 74 per cento del valore basale entro il giorno 28.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un'ora se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di manipolare il nervo con estrema delicatezza. Dopo questa procedura, altri metodi come il rilevamento facile del marchio possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come quelle relative all'interazione sensoriale periferica.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della gestione del dolore per esplorare una nuova modalità energetica per l'agopuntura nel trattamento della neuropatia periferica. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come rappresentare graficamente la conduzione dei nervi neuropatici diabetici in un modello ratto mediante ultrasuoni. Non dimenticare che lavorare con l'amplificatore di potenza può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come l'uso di guanti da lavoro isolanti devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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Ultrasuoni focalizzati ad alta intensità per bloccare i potenziali d'azione nervosi in un modello di ratto diabetico 

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Questo studio stabilisce un modello sperimentale di neuropatia pura piccola fibra con resiniferatossina (RTX). Una dose unica di RTX (50 µ g/kg) è ottimale per lo sviluppo di un modello di neuropatia di piccole fibre che imita le caratteristiche dei pazienti e potrebbe aiutare a studiare il significato molecolare nocicettivo sottostante il dolore neuropatico.

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La registrazione a fibra singola è una tecnica elettrofisiologica efficace applicabile al sistema nervoso centrale e periferico. Insieme alla preparazione della DRG intatta con il nervo sciatico attaccato, viene esaminato il meccanismo di guasto della conduzione. Entrambi i protocolli migliorano la comprensione del rapporto del sistema nervoso periferico con il dolore.

Uso della registrazione in fibra singola in vivo e della radice dorsale intatta Ganglion con il nervo Sciatico attaccato per esaminare il meccanismo del fallimento della conduzione

Questo protocollo descrive la preparazione del tessuto nervoso sciatico intero di ratto per la stimolazione elettrofisiologica ex vivo e la registrazione in un bagno salino perfuso a due compartimenti regolato dall'ambiente.

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Blocco di uno strumento ad ultrasuoni per la conduzione del nervo in modelli di ratto diabetico

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