Name: Analisi per misurare il trasporto nucleocitoplasmatico in tempo reale allinterno di motori neuronici come le cellule NSC-34 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Scopri un saggio quantitativo per misurare in tempo reale il trasporto nucleocitoplasmatico nelle cellule NSC-34. Questo metodo sensibile rileva alterazioni minute nell'importo nucleare, utile per studiare malattie neurodegenerative come la SLA.

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Ringraziamo tutti i membri del laboratorio AI per i loro utili commenti e suggerimenti. Vorremmo ringraziare il Prof. Mark Hipp (Istituto Max Planck per la Biochimica) per fornirci il vettore shuttle-GFP. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Fondazione israeliana di scienza (ISF # 124/14), della Fondazione Binational Science (BSF # 2013325), della FP7 Marie Curie Career Integration Grant (CIG # 333794) e dell&#39;Istituto Nazionale di Psicobiologia in Israele NIPI # b133-14 / 15).

1. Preparazione della linea cellulare <ol><li> Scavare circa 1.000.000 cellule del midollo spinale del neuroblastoma del mouse (cellule NSC-34) che sono state immagazzinate in un contenitore di azoto liquido. Usare un incubatore ad acqua di 37 ° C fino a quando le cellule sono completamente scongelate. </li><li> Aggiungere il terreno fresco e caldo (mezzo DMEM contenente 10% di siero fetale fetale (FBS), 1% di L-glutammina e 1% di antibiotici pen-strep). </li><li> Centrifugare le cellule scongelate (SL16R) a 500 xg per 5 minuti, formando un pellet di cellule. Scartare il mezzo e aggiungere 1 ml di nuovo mezzo per la risospensione cellulare. </li><li> Posizionare le cellule risospese in una pallina da 15 mL e aggiungere un ulteriore 5 mL di terreno. Incubare le cellule durante la notte in un incubatore sterile con 5% di CO 2 a 37 ° C. </li><li> Parallelamente, posizionare 8 coperchi non rivestiti (vetro di copertura: 12 mm, spessore 0,13-0,17 mm) in un piatto da 60 mm di coltura e sterilizzare utilizzando il 70% di etanolo e l&#39;esposizione a 30 minuti di luce UV finché non sia asciutta. Aggiungere il mezzo a ogni piatto e smalti per lavare l&#39;etanolo residuo.</li><li> Aggiungere il tampone di trysina (2,5 g di tripsina e 0,2 g di EDTA in 1 L di Hanks &#39;Balanced Salt Solution) alle cellule dopo aver raggiunto la confluenza del 90% (circa 6 milioni di cellule per pallone) per consentire alle cellule aderenti di dissociarsi. NOTA: Le cellule NSC-34 sono sensibili e richiedono solo 15 s di incubazione del tampone di trypsina e 1 min di incubazione aggiuntiva senza trypsina prima della dissociazione usando il mezzo. </li><li> Piattare le cellule sui piatti di coltura da 60 mm che già contengono le copertine con 3 ml di mezzo, circa 350.000 per piatto. Lasciarli nell&#39;incubatrice per 24 ore per consentire l&#39;attaccatura cellulare sui coperchi. </li></ol> 2. Trasfezione cellulare NOTA: Dopo circa 24 ore, le cellule NSC-34 raggiungeranno la confluenza del 40% (circa 800.000 celle) e saranno pronte per la transfezione. <ol><li> Preparare il mezzo puro DMEM (300 μL di media DMEM per ogni piatto di coltura da 60 mm) in vasca di microcentrifuga sterilees. </li><li> Aggiungere 2 μg di ciascun plasmo necessario per la trasfezione in ogni tubo di microcentrifuga contenente DMEM. NOTA: Il plasmide shuttle-GFP è obbligatorio in tutte le cellule. </li><li> Aggiungere il reagente di transfection a tutti i tubi di microcentrifuga che contengono i loro plasmidi necessari. Qui, aggiungere 4 μL del reagente di transfection commerciale per ogni 2 μg di DNA. </li><li> Vortice i tubi di microcentrifuga contenenti DMEM, i plasmidi e il reagente di trasfezione e incubandoli a temperatura ambiente per 25 min. </li><li> Aggiungere ogni tubo di microcentrifuga a un piatto di coltura e mescolare delicatamente il piatto per formare una soluzione omogenea. Riporre il piatto nell&#39;incubatore per 48 ore. NOTA: poiché GFP deve essere espresso in tutte le cellule, l&#39;efficienza di trasfusione shuttle-GFP può essere parzialmente esaminata e pre-testata utilizzando microscopia fluorescente dopo transfection overnight. Un esame completo delle proteine ​​espresse non fluorescenti può essere condotto utilizzando un analogo immunoblotè. </li></ol> 3. Microscopia <ol><li> Fissare le copertine contenenti le cellule NSC-34 trasfettate in un supporto per copertina e lavare delicatamente con la soluzione salina fosfatizzata (PBS) per rimuovere le cellule morte staccate. </li><li> Identificare una patch cellulare appropriata utilizzando un filtro fluorescente verde con un microscopio invertito. NOTA: Una patch cellulare appropriata è definita come un campo di visione del microscopio che mostra un gran numero di celle (20-30 celle in un campo) e in cui i nuclei sono chiaramente definiti nelle cellule. I nuclei cellulari all&#39;interno della patch cellulare vengono identificati per primo con l&#39;occhio e sono contrassegnati manualmente dal software di imaging. </li><li> Aggiungere 200 μl di un buffer di Leptomycin B (LMB) inibitore exportin-1 contenente 10 μg / ml di LMB in PBS ai coperchi, gocciolando il tampone sui coperchietti sotto il microscopio. NOTA: Questo punto nel tempo è impostato come intervallo zero. </li><li> Quantifica l&#39;intensità fluorescente dei nuclei segnati in intervalli di 3 s per circa 400-500 s. </li><li&gt; Prova tra 3 e 5 coperchi di copertura per ogni gruppo di transfection in ogni singolo esperimento. </li></ol> 4. Analisi NOTA: poiché diverse cellule esprimono diversi livelli di shuttle-GFP fluorescente, è importante normalizzare l&#39;intensità fluorescente nucleare di ogni cellula alla propria intensità fluorescente iniziale. <ol><li> Normalizzare l&#39;intensità fluorescente dei nuclei marcati dividendo l&#39;intervallo fluorescente di 3 ciascun nucleo con la media dei sei intervalli iniziali di quel nucleo. </li><li> Dopo la normalizzazione di ciascun nucleo, produrre una curva di intensità fluorescente che rappresenta la variazione della fluorescenza del nucleo in funzione del tempo per ogni patch cellulare. Per fare questo, calcolare la media di tutte le celle in ciascuna patch cellulare (composta da circa 20-30 celle in ciascuna patch). NOTA: La curva di intensità fluorescente del nucleo assomiglia a una curva di saturazione di Michaelis-Menten, che è meglio osservata inMe periodi. Ciò è dovuto a una diminuzione degli importi citosolici di shuttle-GFP con il tempo a causa del trasporto nucleare. Questa diminuzione diminuisce statisticamente la probabilità che un shuttle-GFP trasferisca nel nucleo, raggiungendo così la saturazione della fluorescenza nucleare. La pendenza derivata dalla velocità iniziale lineare della curva produce la frequenza di ingresso V max nel nucleo. </li><li> Analizzare le pendenze V max di ogni patch cellulare, derivate da tre a cinque esperimenti indipendenti, utilizzando il software di grafica per produrre una pendenza che rappresenta ciascun gruppo sperimentale. Eseguire la quantificazione utilizzando l&#39;analisi statistica ANOVA a senso unico. </li></ol> 5. Validazione della espressione della proteina <ol><li> Posizionare piatti di coltura da 60 mm contenenti le cellule residue (non utilizzate nell&#39;esperimento precedente) da ciascun gruppo sperimentale su ghiaccio. </li><li> Smaltire il mezzo e lavare le cellule due volte con PBS per diluire e lavare il mezzo rimanente. </li><li> Trattare le cellule con 200-400ΜL di tampone di lisi contenente PBS, 0,5% Triton e tablet di cocktail inibitore della proteasi (PI). Raschiare utilizzando un raschiatore di celle. </li><li> Raccogliere le cellule in tampone di lisi in un tubo di microcentrifuga e omogeneizzare con un omogeneizzatore a 4000 rpm per 1 min sotto ghiaccio. </li><li> Centrifugare le cellule omogeneizzate a 2.500 xg per 10 min. Raccogliere il surnatante, quantificare la concentrazione proteica utilizzando un dosaggio di Bradford e conservare fino all&#39;uso a -20 ° C. </li><li> Raccogliere tra 30 e 70 μg di proteina totale (a seconda della proteina) e caricarla in un gel SDS-PAGE per testare l&#39;espressione proteica utilizzando un dosaggio immunoblot. </li></ol>

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<li>Woerner, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+protein+aggregates+interfere+with+nucleocytoplasmic+transport+of+protein+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleocytoplasmic transport of protein and RNA.</a> Science. 351, 173-176 (2016).</li>
<li>Tao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleolar+stress+and+impaired+stress+granule+formation+contribute+to+C9orf72+RAN+translation-induced+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Nucleolar stress and impaired stress granule formation contribute to C9orf72 RAN translation-induced cytotoxicity.</a> Hum Mol Genet. 24, 2426-2441 (2015).</li>
<li>Wen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+proline-arginine+RAN+dipeptides+linked+to+C9ORF72-ALS%2FFTD+form+toxic+nuclear+aggregates+that+initiate+in+vitro+and+in+vivo+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death.</a> Neuron. 84, 1213-1225 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno niente da divulgare.

Questo protocollo dimostra un nuovo test molto sensibile e quantitativo per valutare i minimi cambiamenti nel trasporto nucleocitoplasmatico. Utilizzando questo sistema, è possibile osservare e misurare il trasporto nucleocitoplasmatico e la sua disfunzione in tempo reale, non solo i grandi difetti che comportano cambiamenti drammatici nella distribuzione delle proteine. Questo test non solo ha un vantaggio di sensibilità, ma richiede anche una piccola preparazione, è poco costoso ed è un saggio molto facile e poco affi...

Il complesso dei pori nucleari (NPC) controlla l&#39;importazione e l&#39;esportazione di grandi molecole in e fuori dal nucleo delle cellule. Contrariamente alle piccole molecole, che possono entrare nel nucleo senza regola 1 , il trasporto di molecole più grandi è fortemente controllato dal NPC. Queste grandi molecole, come le proteine ​​e l&#39;RNA, associano fattori di trasporto, comprese le importazioni e le esportazioni, da importare ed esportare dal nucleo 2 . Per essere importato, le proteine ​​devono contenere un piccolo motivo peptidico, generalmente chiamato un segnale di localizzazione nucleare (NLS), che è vincolato dalle importanti 2 . Queste sequenze di aminoacidi agiscono come un tag e sono diverse nella composizione 3 , 4 . Le proteine ​​possono essere esportate dal nucleo al citoplasma a causa della loro associazione con l&#39;exportinS, che legano una sequenza di segnali, generalmente chiamata segnale di esportazione nucleare (NES) 2 . Entrambe le importazioni e le esportazioni sono in grado di trasportare il loro carico a causa della regolazione della piccola proteina nucleare RTP correlata GTPase (Ran) 2 . Ran ha dimostrato di esistere in diversi stati conformazionali a seconda che sia vincolato al GTP o al PIL. Quando legato a GTP, Ran può legarsi a importini o esportazioni. Dopo l&#39;adesione a RanGTP, le importazioni rilasciano il loro carico, mentre le esportazioni devono obbligare RanGTP a formare un complesso con il loro carico di esportazione. Lo stato di legame nucleotidico dominante di Ran dipende dalla sua collocazione nel nucleo (RanGTP) o nel citoplasma (RanGDP). Recentemente, un certo numero di studi hanno mostrato una connessione tra disturbi del percorso nucleocitoplasmatico e sia la sclerosi laterale amiotrofica (ALS) e la demenza frontotemporale (FTD) 5 , 6 </sup&gt; , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . L&#39;ALS è una malattia neurodegenerativa progressiva e fatale che colpisce sia i neuroni motori superiori che inferiori (MN) 13 e provoca paralisi e, infine, nella morte, in media da 2-5 anni. La maggior parte dei casi di ALS sono classificati come sporadici (SALS), senza alcun legame genetico apparente, ma il 10% è ereditato in maniera dominante (ALS familiare; FALS). Recentemente, le espansioni di ripetizione dell&#39;esanucleotide (HRE) nel cromosoma 9 aperto frame di lettura 72 (C9orf72) sono stati identificati 14,15 come causa genetica di ALS e FTD. Questi mutanti rappresentano il 30-40% dei casi FALS 16 e diversi studi hanno sostenutoChe provocano tossicità colpendo il trasporto nucleocitoplasmico 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Questi studi hanno mostrato in gran parte i risultati finali e le manifestazioni degli HRE sul trasporto nucleocitoplasmatico, ma non dimostrano la rottura nucleocitoplasmatica in tempo reale. Di conseguenza, solo la mancanza di trasporto nucleocitoplasmatico grave è stata valutata 11 , 17 , 18 . Questo protocollo descrive un nuovo e vePer valutare e quantificare la disfunzione del trasporto nucleocitoplasmatico in tempo reale. Il tasso di importazione di una proteina NLS-NES-GFP (shuttle-GFP) può essere quantificato in tempo reale utilizzando microscopia fluorescente. Ciò avviene usando un inibitore dell&#39;esportin, come descritto in precedenza 18 , consentendo così al shuttle-GFP di entrare solo nel nucleo. Utilizzando la microscopia fluorescente e un software in grado di quantificare i cambiamenti fluorescenti in tempo reale, è possibile quantificare i cambiamenti graduali nell&#39;intensità di fluorescenza del shuttle-GFP, che si trova nel nucleo. Di conseguenza, può essere effettuata una curva di saturazione simile a Michaelis-Menten dell&#39;asse fluorescenza-tempo, che rappresenta la quantità di GFP nucleare in un dato momento. Utilizzando la velocità lineare iniziale delle curve, è possibile generare una pendenza che rappresenta la velocità di ingresso nel nucleo prima della saturazione della fluorescenza. Per convalidare il saggio, tradurreRipetizioni di dipeptide di C9orf72, poli (GR) e poli (PR), precedentemente riportate per interrompere il trasporto nucleocitoplasmatico, sono state utilizzate 5 , 7 , 8 , 10 , 12 . Utilizzando questo saggio, è stata osservata una diminuzione del 50% del tasso di importazione nucleare rispetto al controllo. Utilizzando questo sistema, possono essere esaminati piccoli cambiamenti nel trasporto nucleocitoplasmatico. Inoltre, può essere determinata la capacità di diversi fattori per salvare un difetto di trasporto nucleocitoplasmatico.

<table><tbody><tr><td>Linea cellulare ibrida di tipo neurone motore di topo (NSC-34)</td><td>tebu-bio</td><td>CLU140-A</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4,5 g/L L-glucosio</td><td>Biological Industries</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>FBS European Grade</td><td>Biological Industries</td><td>04-007-1A</td><td></td></tr><tr><td>SL 16R Centrifuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004030</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO2 Incubatore</td><td>Thermo Scientific</td><td>3111</td><td></td></tr><tr><td>Vetro di copertura Ø 12 mm, spessore 0,13-0,17 mm</td><td>Bar Naor LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione TurboFect</td><td>Thermo Scientific</td><td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R0531">R0531</a></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 100 microscopio invertito</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging Workbench 2</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leptomycin B</td><td>Sigma</td><td>L2913</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>Omogeneizzatore motore/controllo/mandrino/morsetto a 90 gradi</td><td>Glas-Col</td><td>099C K5424CE</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga MicroCL 17R, refrigerata</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002455</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi per misurare il trasporto nucleocitoplasmatico in tempo reale all&#39;interno di motori neuronici come le cellule nsc-34

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Il trasporto nucleocitoplasmatico si riferisce all&#39;importazione e all&#39;esportazione di grandi molecole dal nucleo cellulare. Recentemente, un certo numero di studi hanno mostrato una connessione tra la sclerosi laterale amyotrofica (ALS) e le alterazioni del percorso nucleocitoplasmatico. L&#39;ALS è una malattia neurodegenerativa che colpisce i neuroni motori e che porta alla paralisi e, infine, alla morte, in media di 2-5 anni. La maggior parte dei casi di ALS sono sporadici, privi di qualsiasi legame genetico apparente, ma il 10% viene ereditato in maniera dominante. Recentemente, le espansioni di ripetizione di esanucleotidi (HRE) nel cromosoma 9 aperto frame di lettura 72 (C9orf72) sono stati identificati come una causa genetica di ALS e demenza frontotemporale (FTD). Importante, diversi gruppi hanno recentemente proposto che queste mutanti influenzino il trasporto nucleocitoplasmatico. Questi studi hanno mostrato in gran parte l&#39;esito finale e le manifestazioni causate dagli HRE sul trasporto nucleocitoplasmatico, ma non dimostrano disfunzioni del trasporto nucleare intempo reale. Di conseguenza, solo la carenza nucleocitoplasmatica di trasporto può essere determinata, soprattutto a causa di un&#39;elevata espressione o di inserimento proteico esogeno. Questo protocollo descrive un nuovo e molto sensibile dosaggio per valutare e quantificare la disfunzione del trasporto nucleocitoplasmatico in tempo reale. Il tasso di importazione di una proteina NLS-NES-GFP (shuttle-GFP) può essere quantificato in tempo reale utilizzando microscopia fluorescente. Questo viene eseguito usando un inibitore dell&#39;esportin, consentendo così alla navetta GFP di entrare solo nel nucleo. Per convalidare il dosaggio, sono state utilizzate le ripetizioni dei dipeptidi tradotte da C9orf72 HRE, poli (GR) e poli (PR), che sono state precedentemente mostrate per interrompere il trasporto nucleocitoplasmico. Utilizzando il saggio descritto, è stata osservata una diminuzione del 50% del tasso di importazione nucleare rispetto al controllo. Utilizzando questo sistema, possono essere esaminati piccoli cambiamenti nel trasporto nucleocitoplasmatico e la capacità di diversi fattori di salvarlo (anche parzialmente) di un nucleo nucleotiplasmaticoPuò essere determinato il difetto di risposta.

Utilizzando la procedura qui presentata, le cellule NSC-34, come motorie neuroniche, sono state trasfettate con una proteina NLS-NES-GFP (shuttle-GFP). Questa proteina, dotata di sequenze di segnali NLS e NES ( Figura 1 ), può spostarsi tra il nucleo e il citoplasma. Generico GFP può entrare o uscire dal nucleo in assenza di un solo segnale di localizzazione solo per diffusione e viene quindi distribuito uniformemente tra il nucleo e il citoplasma ( Figura 2A</st...

Questo protocollo descrive un metodo per misurare sensibilmente il tasso di trasporto nucleocitoplasmatico nelle cellule NSC-34 come motori neuronali quantificando il cambiamento in tempo reale nell&#39;importazione nucleare di una proteina NLS-NES-GFP.

Analisi per misurare il trasporto nucleocitoplasmatico in tempo reale all&#39;interno di motori neuronici come le cellule NSC-34

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

L'obiettivo generale di questo saggio è rilevare variazioni minime nel tasso di trasporto nucleocitoplasmatico delle cellule in tempo reale, in assenza o in presenza di molecole potenzialmente inibitorie del tasso di trasporto. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo malattie neurogenetiche specifiche, come la SLA, per le quali si è ipotizzato un impatto negativo sul trasporto nucleocitoplasmatico. Alcuni vantaggi di questa tecnica consistono nell'elevata sensibilità e nella natura quantitativa, nonché nella possibilità di analizzare in tempo reale variazioni minime del tasso di trasporto nucleocitoplasmatico.La procedura sarà dimostrata da Tom Shani, uno studente laureato del mio laboratorio. Iniziare scongelando circa un miliardo di cellule di neuroblastoma del midollo spinale di topo dallo stoccaggio in azoto liquido in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Quando le cellule sono completamente scongelate, raccoglierle mediante centrifugazione e risospendere il pellet in un millilitro di mezzo fresco.Quindi trasferire le cellule in un flacone da 15 millilitri contenente cinque millilitri di mezzo di coltura cellulare per un'incubazione notturna a

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Microscopia singola molecola approch fornito intuizioni romanzo in trasporto nucleare.

Singola molecola Imaging dei trasporti nucleari

Questo protocollo delinea l'estrazione di proteine dalle cellule tumorali neuronali. Le cellule vengono lavate con un tampone e lisate tramite disgregazione enzimatica e meccanica. Il surnatante ricco di proteine estratto viene raccolto dopo la centrifugazione.

Estrazione di proteine da cellule neuronali

Il trasporto intracellulare di carichi, come vescicole o organelli, è effettuato da proteine motrici molecolari che seguono i microtubuli polarizzati. Questo protocollo descrive la correlazione della direzionalità del trasporto delle singole particelle di carico che si muovono all'interno dei neuroni, con la quantità relativa e il tipo di proteine motorie associate.

Che caratterizza la composizione molecolare di motori su Moving assonale Cargo Utilizzo dell&#39;analisi &quot;Cargo Mapping&quot;

L'indagine sul traffico di membrana è fondamentale per la comprensione delle funzioni neuronali. Qui introduciamo un metodo per quantificare la motilità della vescicola nei neuroni. Questo è un metodo conveniente che può essere adattato alla quantificazione del traffico di membrana nel sistema nervoso.

Quantificazione delle endosomi e dei motivi di lisosomi nei neuroni coltivati ​​utilizzando sonde fluorescenti

Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un buon modello per studiare il trasporto assonale e intracellulare. Qui, descrivo un protocollo per la registrazione in vivo e l'analisi del trasporto assonale e intraflagellare c.elegans.

Immobilizzazione del Caenorhabditis elegans per analizzare il trasporto intracellulare nei neuroni

Il trasporto mitocondriale alterato e la morfologia sono coinvolti in varie malattie neurodegenerative. Il protocollo presentato utilizza neuroni del prosencefalo derivati da cellule staminali pluripotenti indotte per valutare il trasporto mitocondriale e la morfologia nella paraplegia spastica ereditaria. Questo protocollo consente la caratterizzazione del traffico mitocondriale lungo gli assoni e l'analisi della loro morfologia, che faciliterà lo studio delle malattie neurodegenerative.

Analisi del trasporto mitocondriale e della morfologia nei neuroni derivati dalle cellule staminali indotte dall'uomo in paraplegia ereditaria

Descriviamo i metodi di fotoattivazione della fluorescenza per analizzare il trasporto assonale dei neurofilamenti in assoni singoli mielinati di nervi periferici da topi transgenici che esprimono una proteina neurofilabile fotoattivabile.

Imaging e analisi del trasporto neurofilamento nel nervo tibiale del topo escresato

Utilizzando topi fluorescenti transgenici, vengono descritti protocolli dettagliati per valutare il trasporto assonale in vivo di endosomi e mitocondri di segnalazione all'interno di assoni motori e sensoriali del nervo sciatico intatto in animali vivi.

Espansione del toolkit per l'imaging in vivo del trasporto assonale

Questo protocollo descrive come impostare ed eseguire in modo efficiente analisi automatizzate dei dati di imaging di cellule vive ottenuti dal monitoraggio del trasporto nucleocitoplasmatico tramite strumenti optogenetici.

Utilizzo degli strumenti di optogenetica LEXY e LINuS e dell'analisi automatizzata delle immagini per quantificare le dinamiche di trasporto nucleocitoplasmatico nelle cellule vive

Il video presente mostra un metodo che sfrutta la combinazione di elettroporazione e microscopia confocale per eseguire l'imaging in diretta su singole cellule progenitrici neurali nel proencefalo zebrafish via di sviluppo.

Time-lapse immagini dal vivo di relazione clonale cellule progenitrici neurali in via di sviluppo Zebrafish proencefalo

Scopri un saggio quantitativo per misurare in tempo reale il trasporto nucleocitoplasmatico nelle cellule NSC-34. Questo metodo sensibile rileva alterazioni minute nell'importo nucleare, utile per studiare malattie neurodegenerative come la SLA.

Analisi per misurare il trasporto nucleocitoplasmatico in tempo reale all'interno di motori neuronici come le cellule NSC-34

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