Name: Phenotypic Analisi del roditore Malaria Parassita Sessuale e Sessuale Fasi Sangue e Mosquito Fasi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Scopri metodi standardizzati per l'analisi fenotipica di parassiti della malaria nei roditori, utili per studiare le fasi ematiche e la trasmissione alle zanzare. Queste tecniche migliorano la riproducibilità della ricerca.

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Ahmed Aly è sostenuto da finanziamenti all'Università Bezmialem Vakif del Ministero dello Sviluppo turco 2015BSV036, e dai finanziamenti forniti dalla Tulane University School of Public Health and Tropical Medicine, e dal finanziamento da NIH-NIAID per R21Grant 1R21AI111058-01A1.

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<li>Naing, C., Whittaker, M. A., Nyunt Wai, V., Mak, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+Plasmodium+vivax+malaria+a+severe+malaria%3F%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Is Plasmodium vivax malaria a severe malaria?: a systematic review and meta-analysis.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8, e3071(2014).</li>
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<li>Bagnaresi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlike+the+synchronous+Plasmodium+falciparum+and+P.+chabaudi+infection%2C+the+P.+berghei+and+P.+yoelii+asynchronous+infections+are+not+affected+by+melatonin%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+General+Medicine%22%5BJournal%5D)">Unlike the synchronous Plasmodium falciparum and P. chabaudi infection, the P. berghei and P. yoelii asynchronous infections are not affected by melatonin.</a> International Journal of General Medicine. 2, 47-55 (2009).</li>
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<li>Okada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transient+resistance+to+blood-stage+malaria+in+interferon-gamma-deficient+mice+through+impaired+production+of+the+host+cells+preferred+by+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A transient resistance to blood-stage malaria in interferon-gamma-deficient mice through impaired production of the host cells preferred by malaria parasites.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 600(2015).</li>
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<li>Fahey, J. R., Spitalny, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulent+and+nonvirulent+forms+of+Plasmodium+yoelii+are+not+restricted+to+growth+within+a+single+erythrocyte+type%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Virulent and nonvirulent forms of Plasmodium yoelii are not restricted to growth within a single erythrocyte type.</a> Infection and Immunity. 44, 151-156 (1984).</li>
<li>Srivastava, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+reticulocytes+provide+metabolic+reservoirs+that+can+be+exploited+by+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Host reticulocytes provide metabolic reservoirs that can be exploited by malaria parasites.</a> PLoS Pathogens. 11, e1004882(2015).</li>
<li>Hart, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Characterization+of+Plasmodium+Putative+Pantothenate+Kinase+Genes+Reveals+Their+Essential+Role+in+Malaria+Parasite+Transmission+to+the+Mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Genetic Characterization of Plasmodium Putative Pantothenate Kinase Genes Reveals Their Essential Role in Malaria Parasite Transmission to the Mosquito.</a> Scientific Reports. 6, 33518(2016).</li>
<li>Hart, R. J., Ghaffar, A., Abdalal, S., Perrin, B., Aly, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+AdoMetDC%2FODC+bifunctional+enzyme+is+essential+for+male+sexual+stage+development+and+mosquito+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Plasmodium AdoMetDC/ODC bifunctional enzyme is essential for male sexual stage development and mosquito transmission.</a> Biology Open. 5, 1022-1029 (2016).</li>
<li>Hart, R. J., Lawres, L., Fritzen, E., Ben Mamoun, C., Aly, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+yoelii+vitamin+B5+pantothenate+transporter+candidate+is+essential+for+parasite+transmission+to+the+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Plasmodium yoelii vitamin B5 pantothenate transporter candidate is essential for parasite transmission to the mosquito.</a> Scientific Reports. 4, 5665(2014).</li>
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<li>Hart, R. J., Abraham, A., Aly, A. S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Characterization+of+Coenzyme+A+Biosynthesis+Reveals+Essential+Distinctive+Functions+during+Malaria+Parasite+Development+in+Blood+and+Mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genetic Characterization of Coenzyme A Biosynthesis Reveals Essential Distinctive Functions during Malaria Parasite Development in Blood and Mosquito.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 260(2017).</li>
<li>Vanderberg, J. P., Yoeli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+temperature+on+sporogonic+development+of+Plasmodium+berghei%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Effects of temperature on sporogonic development of Plasmodium berghei.</a> The Journal of Parasitology. 52, 559-564 (1966).</li>
<li>Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+parasite+pre-erythrocytic+stage+infection%3A+gliding+and+hiding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Malaria parasite pre-erythrocytic stage infection: gliding and hiding.</a> Cell Host & Microbe. 4, 209-218 (2008).</li>
<li>Briones, M. R., Tsuji, M., Nussenzweig, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+large+difference+in+infectivity+for+mice+of+Plasmodium+berghei+and+Plasmodium+yoelii+sporozoites+cannot+be+correlated+with+their+ability+to+enter+into+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">The large difference in infectivity for mice of Plasmodium berghei and Plasmodium yoelii sporozoites cannot be correlated with their ability to enter into hepatocytes.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 77, 7-17 (1996).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Nonostante la somiglianza nella biologia generale dei loro cicli di vita a quella dei parassiti della malaria umana, i modelli di malaria dei topi hanno anche molte differenze rispetto alle specie di Plasmodium umano che limiterebbero il loro uso come modelli affidabili in vivo. Ad esempio, ad eccezione dei parassiti attenuati dal vivo come vaccini, tutti gli studi sui vaccini con sottounità e DNA e altri vaccini hanno dato ottimi risultati nel modello murino, ma negli esseri umani che vivono in aree en...

I parassiti della malaria causano centinaia di milioni di infezioni da malaria nell'uomo in tutto il mondo, con più di 600.000 decessi ogni anno1. Le infezioni umane sono causate da cinque specie parassitarie della malaria, vale a dire P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariaee P. knowlesi. La maggior parte delle decessi cliniche per la malaria sono causate da P. falciparum nell'Africa sub-sahariana1. Un'altra specie di parassita della malaria umana che causa ampie morbilità in tutto il mondo al di fuori dell'Africa subsahariana è P. vivax2. Le altre tre specie sono tutte più geograficamente limitate e causano infezioni benigne della malaria, ad eccezione del letale P. knowlesi3. L'indisponibilità di modelli in vivo rilevanti e pratici non umani delle infezioni è sempre stata ed è ancora un ostacolo al vaccino antimalarico e allo sviluppo di farmaci. Precedente al targeting del farmaco antimalarico e studi metabolici hanno fatto ampio affidamento su modelli di malaria aviaria come P. gallinaceum e P. lophurae, infettando polli e anatre, rispettivamente4. Successivamente, le specie di malaria dei roditori sono state gradualmente introdotte in vari vaccini e studi di targeting farmacologico come modelli in vivo. Nel corso degli anni, si sono accumulate prove di somiglianze della biologia e delle interazioni ospite-parassita delle fasi del ciclo di vita dei modelli di malaria dei roditori con le specie della malaria umana.
In particolare, i modelli di malaria dei roditori erano estremamente importanti per esplorare e caratterizzare la biologia delle zanzare e degli stadi pre-errocitici5. Tuttavia, ci sono quattro specie di malaria roditore (P. berghei, P. yoelii, P. chabaudi, e P. vinckei) che hanno diverse caratteristiche biologiche, il più notevole dei quali sono negli stadi del sangue6. Le specie di malaria del roditore differiscono nella sincronia delle stadi ematici, dove le stadi ematiche dei ceppi P. chabaudi e P. vinckei sono per lo più sincrone, mentre le fasi del sangue di P. berghei e P. yoelii non sono6 , 7. Un'altra differenza notevole è l'auto-eliminazionedelle stadi del sangue che si verifica in alcuni ceppi (ad esempio, P. yoelii 17X-NL, P. berghei NK65 e P. vinckei lentum),mentre l'infezione del sangue di altri ceppi della stessa specie potrebbero essere letali se non trattati (P. yoelii 17X-L, P. berghei ANKA, e P. chabaudi AS). Inoltre, p. yoelii 17X-NL ceppo e P. berghei ANKA ceppo preferibilmente invadere i reticulocyti8,9,10,11, anche se queste caratteristiche di P. I ceppi di yoelii e P. berghei non sono un rigoroso requisito di crescita12,13,14. Pertanto, i topi vengono trattati con feniliddrzina prima di un'infezione con gli stadi del sangue di tali parassiti per aumentare la parasitemia e la gametocitemia necessari per un'infezione da zanzara per il ceppo P. berghei ANKA e per P. yoelii 17X-NL15,16,17,18,19.
Differenze nello sviluppo delle stadi di zanzara esistono anche tra le diverse specie di malaria roditore, la più notevole è la temperatura e il tempo necessari per lo sviluppo ottimale delle stadi di zanzara e la lunghezza sporozoite5,6, 20. Negli stadi pre-erritrociti delle specie di malaria roditore, le differenze includono le specie di roditori e i ceppi più suscettibili all'inoculazione infettiva della sporozoite, il numero di sporozoiti necessari per l'inoculazione in un ceppo di roditori suscettibili, tipi di cellule mammiferi necessari per i saggi di sviluppo in fase epatica in vitro, e il tempo per completare lo sviluppo dello stadio epatico5,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30.
Nonostante queste variabilità, i parassiti della malaria dei roditori erano i modelli favorevoli fin dall'inizio per l'applicazione di approcci genetici inversi, perché erano meno dispendiosi di tempo e risorse con un'alta probabilità di successo31. Infatti, i modelli di malaria dei roditori sono stati i modelli migliori, e in molti casi gli unici modelli, disponibili per numerosi anni per caratterizzare funzionalmente i geni espressi negli stadi di zanzare e fegato.
Alla luce della popolarità e dell'amenabilità degli approcci genetici inversi nei modelli di malaria dei roditori, sono state utilizzate diverse metodologie per analizzare i fenotipi delle fasi del ciclo di vita dei parassiti transgenici, in particolare le fasi del sangue. Tuttavia, alcune di queste metodologie sono incoerenti; per esempio, confrontando le infezioni di parassiti in fase sanguigna dopo un'iniezione di IP (che sono probabilmente drenati ai linfonodi peritoneali e, da lì, possono entrare nel flusso sanguigno; quindi, i parassiti iniettati non finiscono ugualmente nel flusso sanguigno) , confrontando la trasmissione di zanzare di cloni con un diverso numero di trasferimenti seriali di stadi di sangue o numero G (che potrebbe influenzare la gametocitogenesi32,33),o confrontando i parassiti transgenici direttamente con il tipo selvaggio ingenuo (WT) parassiti che non sono mai stati sottoposti a elettroporazione e selezione di farmaci positivi e alle varie valutazioni non standardizzate dell'esclamazione dei gameti maschili. Pertanto, è fondamentale standardizzare protocolli che sono semplici da seguire per l'analisi fenotipica di qualsiasi tipo di parassiti transgenici o WT roditori della malaria nel sangue e nella zanzara per adattarsi alle variabilità biologiche della malaria roditore specie parassiche.
Qui, riportiamo su un protocollo sperimentale standardizzato e dettagliato per l'analisi fenotipica delle fasi del ciclo di vita del sangue e delle zanzare dei parassiti transgenici o selvatici P. yoelii e P. berghei . Questi protocolli sono applicabili anche ai parassiti P. chabaudi e P. vinckei.

<table><tbody><tr><td>Eparina</td><td>Sigma</td><td>375095-100KU</td><td></td></tr><tr><td>Acido xanturico</td><td>Sigma</td><td>D120804-5G</td><td></td></tr><tr><td>Ipoxantina</td><td>Sigma</td><td>H9377-25G</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di Alsever</td><td>Sigma</td><td>A3551-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fenilidrazina</td><td>Sigma</td><td>P26252-5G</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>Sigma</td><td>GS1L-1L</td><td></td></tr><tr><td>26 G x 3/8 Ago di scorrimento di precisione,&nbsp;</td><td>Siringa TB Becton Dickinson</td><td>305110</td><td></td></tr> da <tr><td>1 ml, 26 g x 3/8</td> Siringa da insulina <td>Becton Dickinson</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>1 cc, U-100 27 g</td><td>Becton Dickinson</td><td>329412</td><td></td></tr><tr><td>isoflurano, USB</td><td>Piramal</td><td>2667-46-7</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>22400105</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Fibra di vetro Lana di vetro</td><td>Corning</td><td>3950</td><td></td></tr></tbody></table>

phenotypic analisi del roditore malaria parassita sessuale e sessuale fasi sangue e mosquito fasi

Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages

I recenti progressi nella genetica e nelle tecnologie di biologia dei sistemi hanno promosso la nostra comprensione della biologia dei parassiti della malaria a livello molecolare. Tuttavia, gli obiettivi efficaci del parassita della malaria per lo sviluppo di vaccini e chemioterapia sono ancora limitati. Ciò è in gran parte dovuto all'indisponibilità di modelli di infezione in vivo rilevanti e pratici per le specie di Plasmodium umano, in particolare per P. falciparum e P. vivax. Pertanto, le specie di malaria del roditore sono state ampiamente utilizzate come modelli pratici alternativi in vivo per il vaccino antimalarico, il targeting dei farmaci, la risposta immunitaria e gli studi di caratterizzazione funzionale dei geni Plasmodiumspp conservati. In effetti, i modelli di malaria dei roditori si sono dimostrati preziosi, soprattutto per esplorare la trasmissione delle zanzare e la biologia dello stadio del fegato, e sono stati indispensabili per gli studi immunologici. Tuttavia, ci sono discrepanze nei metodi utilizzati per valutare i fenotipi dei parassiti asessuali e sessuali transessuali e sessuali di tipo selvaggio. Esempi di queste discrepanze sono la scelta di un'infezione endovenosa o intraperitoneale di roditori con parassiti in fase sanguigna e la valutazione dell'esclamazione di gamete maschile. Qui, sindiciamo i metodi sperimentali standardizzati per valutare i fenotipi delle stadi del sangue asessuato e sessuale nei parassiti transgenici che esprimono specie di parassiti della malaria reporter-gene o di tipo selvatico. Inoltre, vengono descritti in dettaglio i metodi per valutare i fenotipi degli stadi della zanzara parassita della malaria (gamete, ookineti, oocisti e sporozoiti) all'interno dei vettori di zanzare di Anopheles. Questi metodi sono dettagliati e semplificati qui per i ceppi letali e non letali di P. berghei e P. yoelii, ma possono anche essere applicati con alcune modifiche alle specie di malaria del roditore P. chabaudi e P. vinckei.

Il successo dell'applicazione di strumenti e tecniche genetiche inverse ai parassiti della malaria ha rivoluzionato il campo della ricerca sulla malaria, con la possibilità di aggiungere, eliminare o modificare segmenti genomici specifici di diverse specie di Plasmodium 39. È importante sottolineare che i loci genomici dispensabili sono stati identificati e utilizzati con successo per introdurre marcatori proteici di fluorescenza nei parassiti del roditore...

A causa delle sorprendenti somiglianze del ciclo di vita e della biologia dei parassiti della malaria dei roditori con i parassiti della malaria umana, i modelli di malaria dei roditori sono diventati indispensabili per la ricerca sulla malaria. Qui, abbiamo standardizzato alcune delle tecniche più importanti utilizzate nell'analisi fenotipica di specie di malaria roditore selvatico e transgenico.

Phenotypic Analisi del roditore Malaria Parassita Sessuale e Sessuale Fasi Sangue e Mosquito Fasi

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. ...

A causa delle sorprendenti somiglianze del ciclo di vita e della biologia dei parassiti della malaria dei roditori, i parassiti della malaria umana, i modelli di malaria dei roditori sono diventati indispensabili per la ricerca sulla malaria. Questi metodi standard possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sulla malaria su come eseguire un'analisi fenotipico di specie di malaria di roditori transgenici e di tipo selvatico. A dimostrare le procedure saranno gli studenti laureati Gozde Deveci e Ilknur Yilmaz del mio laboratorio.Inizia scongelando rapidamente le scorte di parassiti congelati preservati dal criocono e usando immediatamente una siringa millilitro dotata di un ago calibro 26 per iniettare almeno due topi donatori per genotipo intraperitonealmente con circa 200 microlitri di magazzino. Ventiquattro ore dopo l'iniezione, utilizzare un ago calibro 24 o 26 per pungere la coda del primo topo e raccogliere la goccia di sangue su uno scivolo al microscopio. Utilizzare il bordo corto di un'altra diapositiva per spalmare rapidamente il sangue attraverso la prima diapositiva.Quando il sangue si è completamente asciugato, fissare le diapositive in metanolo al 100% per almeno un minuto. Macchiare i campioni fissi a Giemsa per 10-15 minuti seguiti da un lavaggio dell'acqua distillato singolo o doppio. Quando le diapositive si sono asciugate, visualizzare i campioni sotto un obiettivo 100X e immersione dell'olio su un microscopio leggero per il conteggio del numero totale di eriociti infetti per griglia.Da due a tre giorni dopo l'infezione, fissare un topo anestetizzato in cui la parasitemia ha raggiunto tra lo 0,1 e l'1% nella posizione supina e utilizzare le flessione per sollevare la pelle vicino alla base dello sterno per facilitare la creazione di un'incisione cutanea. Tirare la pelle a parte nel sito dell'incisione per esporre il diaframma e la parte superiore della cavità addominale e utilizzare le forcep per mantenere la base della gabbia toracica mentre si taglia il diaframma per entrare nella cavità toracica. Schienare la gabbia toracica per esporre il cuore e utilizzare una siringa millilitro contenente almeno 20 microlitri di eparina e dotata di un ago calibro 26 per forare delicatamente il tessuto cardiaco.Ritrarre lentamente lo stantuffo per raccogliere circa un millilitro di sangue e erogare il sangue in un tubo di microcentrifugo. Una volta raccolto tutto il sangue, riscaldare i topi ricevente sotto una lampada di calore rossa e caricare una siringa per insulina dotata di un ago calibro 27 per ricevente con la dose appropriata di parassita. Quindi mettere il primo ricevente in un limitatore e iniettare una dose completa di etitrociti infetti in una vena di coda dilatata.Per l'alimentazione delle zanzare, consentire alle zanzare anopheles stephensi o a.gambiae adulte di quattro o sette giorni affamate per otto-12 ore di nutrire più di 15 minuti su topi infetti anestetizzati con il più alto tasso di escflagellazione. Per determinare il numero di sporozoiti oocista per zanzara, eutanasiare da 20 a 30 zanzare nel congelatore per non meno di 10 minuti e utilizzare un mirino di dissezione binoculare e due aghi calibro 26 o 27 per sezionare i moscerini delle zanzare su uno scivolo di vetro contenente l'appropriata soluzione di dissezione. Per sezionare il midgut, prima tenere la parte inferiore dell'addome in posizione con un ago e spingere attentamente il torace molto leggermente alla giunzione tra l'addome e il torace in direzione verso l'alto fino a quando non separa il torace e un midgut di colore bianco viene esposto penzolando giù dal torace.Ora taglia il midgut dall'estremità dell'esofago usando lo stesso ago che è stato usato per spingere il torace verso l'alto separando e diffondendo così il midgut. Sollevare il midgut sezionato dal mezzo di dissezione utilizzando un ago e trasferirlo in un tubo riempito con 200 microlitri di RPMI. Quando tutti i moscerini sono stati sezionati e raccolti, posizionare il tubo contenente i moscerini nella centrifuga per un minuto a 700 volte g.Quindi macinare i tessuti raccolti con un pestello due volte. Trasferire 12 microlitri della soluzione tissutale diluita in un emacitometro e incubare l'emacitometro a temperatura ambiente per cinque minuti per consentire al contenuto di depositarsi. Quindi determinare il numero medio di sporozoiti oocista su un microscopio leggero in contrasto di fase e un ingrandimento 40X.Per determinare il numero di sporozoiti della ghiandola salivare per zanzara, nel momento appropriato dopo l'alimentazione, congelare le zanzare femminili eutanasiate da 50 a 100 come dimostrato e utilizzare un microscopio sezionante e il lato di un ago calibro 26 o 27 per isolare le ghiandole salivari. Per sezionare le ghiandole salivari, tenere prima l'addome superiore o il torace in posizione con il lato smussato di un ago e spingere con attenzione la testa molto leggermente e molto brevi spinte alla giunzione tra la testa e il torace in direzione verso l'alto. Spingere fino a quando la testa è accuratamente separata dal torace senza strappare la ghiandola salivare vetrosa.Utilizzare una pipetta Pasteur in vetro corto per sollevare la ghiandola salivare sezionata dal mezzo di dissezione e posizionarla in un tubo da 1,5 millilitri. Quando tutte le ghiandole salivari sono state sezionate e raccolte, posizionare il tubo contenente le ghiandole nella centrifuga per un minuto a 700 volte g. Macinare i tessuti raccolti con un pestello due volte.Quindi determinare il numero medio di sporozoiti della ghiandola salivare come fatto in precedenza. I parassiti transgenici della malaria reporter progettati per esprimere l'EGFP sotto il controllo di un promotore forte e costitutivo mostrano il segnale di fluorescenza nelle fasi del sangue, negli oocineti, nei giovani ovociti sui moscerini di Anopheles stephensi e nelle sporozoiti isolate dalle ghiandole salivari delle femmine di Anopheles stephensi. I valori percentuali di parasitemia citometrica del flusso corrispondono direttamente alle percentuali stimate di parasitemia ottenute monitorando gli strisci di sangue sottile macchiati di Giemsa come dimostrato confermando la validità di quest'ultimo metodo di quantificazione.Inoltre, la stima delle percentuali di ciascuno dei diversi stadi asessuati e sessuali dipende dalla valutazione morfologica degli erytrociti che non può essere valutata dalla citometria del flusso. Il confronto tra le vie di infezione intraperitoneali rispetto a quelle endovenose rivela una diminuzione statisticamente significativa della percentuale di parasitemia del gruppo infetto ip rispetto alla percentuale di parasitemia del gruppo infetto IV durante i primi quattro giorni di infezione dimostrando che la via IV dell'infezione è una via più quantitativamente accurata per i saggi con le fasi del sangue del parassita della malaria. Da notare, il trattamento con fenilidrazina aumenta significativamente il numero di gametociti che aumenta il tasso di formazione di gameti maschili che a sua volta aumenta il tasso di fecondazione e il numero di tutte le fasi successive delle zanzare.C'è una scarsità di metodi standardizzati per l'analisi fenotipica dei parassiti dello stadio sanguigno della malaria dei roditori e la loro trasmissione al vettore di zanzara. Questi metodi aiuteranno a fornire protocolli standardizzati e semplificati per lo studio di questi agenti patogeni e delle loro fasi del ciclo di vita.

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Generazione di un modello murino di malaria cerebrale sperimentale utilizzando sporozoiti derivati da zanzare ospiti

La tubercolosi e la malaria sono due delle infezioni più diffuse negli esseri umani e le principali cause di morbilità e mortalità nelle popolazioni povere nei tropici. Abbiamo stabilito un sistema modello sperimentale per lo studio esito della malaria, tubercolosi coinfezione nei topi dopo la sfida con entrambi i patogeni tramite il loro percorso naturale di infezione.

Un modello sperimentale per studiare la tubercolosi, la malaria coinfezione sulla trasmissione naturale di Mycobacterium tuberculosis E Plasmodium berghei</i

Le zanzare che trasmettono la malaria hanno una serie di caratteristiche epidemiologicamente importanti che possono essere rilevate solo utilizzando tecniche molecolari. Utilizzando una piattaforma di genotipizzazione SNP basata su MALDI-TOF, abbiamo sviluppato un test per rilevare simultaneamente più tratti chiave (specie, resistenza agli insetticidi, infezione da parassiti e scelta dell'ospite) dei vettori della malaria.

Un test multi-rilevamento per la malaria Trasmissione Zanzare

Descriviamo un modello murino di malaria cerebrale sperimentale e mostriamo come la patologia infiammatoria e microvascolare possa essere monitorata in vivo utilizzando la risonanza magnetica.

Tracciamento in vivo di sviluppo dell&#39;edema e patologia microvascolare in un modello di malaria cerebrale sperimentale mediante l&#39;utilizzo di immagini a risonanza magnetica

Indagini dettagliate sugli stadi delle zanzare dei parassiti della malaria sono fondamentali per progettare efficaci strategie di blocco della trasmissione. Questo protocollo dimostra come coltura efficacemente gametociti infettivi e quindi nutrire questi gametociti alle zanzare per generare stadi di zanzara di P. falciparum.

Plasmodium falciparum Coltura di gametociti e infezione da zanzare attraverso l'alimentazione artificiale della membrana

Il test standard di alimentazione a membrana (SMFA) è considerato il gold standard per la valutazione e l'identificazione di potenziali composti antimalarici. Questo sistema di alimentazione artificiale viene utilizzato per infettare le zanzare per valutare ulteriormente gli effetti di tali composti sull'intensità e la prevalenza del parassita Plasmodium falciparum .

Test standard di alimentazione a membrana per la rilevazione dell'infezione da Plasmodium falciparum in vettori di zanzare Anopheles

La malaria si trasmette attraverso l'inoculazione dello stadio sporozoite di Plasmodium da parte di zanzare infette. Il Plasmodium transgenico ci ha permesso di comprendere meglio la biologia della malaria e ha contribuito direttamente agli sforzi di sviluppo del vaccino contro la malaria. In questo articolo descriviamo una metodologia semplificata per generare sporozoiti transgenici di Plasmodium berghei .

Generazione di sporozoiti geneticamente modificati di Plasmodium berghei

Lo sviluppo sessuale del Plasmodium avviene nell'intestino medio della zanzara. Prendere di mira le fasi sessuali del parassita è una strategia promettente per bloccare la trasmissione. Abbiamo sviluppato Ookluc, un P. berghei transgenico che esprime nanoluciferasi dopo la formazione dello zigote, consentendo lo screening ad alto rendimento di composti che bloccano la trasmissione. Questo articolo descrive in dettaglio i metodi per lo screening utilizzando Ookluc.

Ookluc: una linea di Plasmodium berghei per l'identificazione di composti che bloccano la trasmissione

Scopri metodi standardizzati per l'analisi fenotipica di parassiti della malaria nei roditori, utili per studiare le fasi ematiche e la trasmissione alle zanzare. Queste tecniche migliorano la riproducibilità della ricerca.

Phenotypic Analisi del roditore Malaria Parassita Sessuale e Sessuale Fasi Sangue e Mosquito Fasi

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