Analisi del promotore di ligandi di c-KIT utilizzando l'immunoprecipitazione cromatina

L'obiettivo generale di questa procedura di immunoprecipitazione della cromatina è valutare il legame indotto dal TGF beta 1 del fattore di trascrizione SMAD2 agli elementi leganti SMAD nel promotore del kit C. Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo della biologia cellulare come la trascrizione genica indotta da citochine. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ha il potenziale per dimostrare il legame diretto dei fattori di trascrizione e di altre proteine regolatrici della trascrizione ai loro siti di legame del DNA in vivo.

Far crescere le cellule fino a una confluenza compresa tra il 70 e l'80% su piastre di coltura tissutale di dieci centimetri. Stimolare le cellule secondo gli obiettivi sperimentali. Rimuovere il terreno di coltura tissutale e aggiungere cinque millilitri di soluzione di fissaggio.

Quindi, incubare le cellule per 10 minuti a temperatura ambiente su una piattaforma di agitazione. Rimuovere la soluzione di fissaggio e lavare le cellule due volte con 10 millilitri di ghiaccio freddo uno X PBS. Rimuovere l'unico X PBS e aggiungere cinque millilitri di soluzione di glicina stop fix.

Dopo aver incubato le cellule per cinque minuti a temperatura ambiente su una piattaforma di agitazione, rimuovere la soluzione di stop fix alla glicina e lavare le cellule due volte con 10 millilitri di ghiaccio freddo uno X PBS. Dopo aver rimosso il PBS, aggiungere due millilitri di soluzione raschiante cellulare e raccogliere le cellule utilizzando un raschietto cellulare. Quindi, trasferire le cellule raccolte in un tubo conico con ghiaccio.

Centrifugare i campioni per 10 minuti a 600 volte G e quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante, risospendere il pellet in un millilitro di un tampone di lisi cellulare X e incubare su ghiaccio per 30 minuti. Una volta che il pellet è stato risospeso nel tampone di lisi cellulare, trasferire la sospensione cellulare in un omogeneizzatore Dounce ghiacciato e Dounce per 10 colpi utilizzando un pestello di tipo B per la disgregazione cellulare.

Quindi, trasferire la sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga e centrifugare il campione per 10 minuti a 2, 400 volte G e quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 350 microlitri di tampone per la digestione dei nuclei. Dopo aver incubato i campioni per cinque minuti a 37 gradi Celsius, aggiungere la nucleasi micrococcica e mescolare a vortice.

Incubare i campioni a 37 gradi Celsius per 5-20 minuti, mescolando i campioni ogni due minuti per inversione. Il tempo in una certa concentrazione, se ci si trova tra le linee cellulari, potrebbe richiedere un'ottimizzazione in caso di taglio enzimatico non ottimale. Una procedura di taglio alternativa che utilizza sonicare disponibile in commercio può essere trovata nel protocollo di testo.

Dopo l'incubazione con la nucleasi micrococcica, aggiungere sette microlitri di EDTA molare 0,5 ghiacciato per fermare la reazione. Centrifugare i campioni con il DNA tranciato per 10 minuti a 16, 200 volte G e quattro gradi Celsius. Trasferire il DNA tranciato contenente surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga.

Aliquotare 50 microlitri in una provetta da microcentrifuga separata, per confermare il successo del taglio del DNA come descritto nel protocollo di testo. Utilizzare immediatamente il volume rimanente per l'immunoprecipitazione o conservarlo a meno 80 gradi Celsius. Combinare da 10 a 25 microgrammi di cromatina reticolata tranciata con 25 microlitri di perle magnetiche di proteina G di grado immunoprecipitazione della cromatina.

Quindi, aggiungere 10 microlitri di tampone di diluizione per immunoprecipitazione e un microlitro di cocktail di inibitori della proteasi. Dopo quattro ore di incubazione, aggiungere da uno a 10 microgrammi di anticorpi in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. E aggiungere acqua distillata fino a un volume finale di 100 microlitri.

Incubare i campioni su un rotatore end-to-end per quattro-12 ore a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, posizionare le provette su un supporto magnetico. Una volta che le perle magnetiche si aggregano al lato del tubo, rimuovere con cura ed eliminare il surnatante.

Lavare le perline tre volte con 800 microlitri di tampone di lavaggio uno. Per ogni lavaggio, mescolare le perline capovolgendo più volte il tubo. Quindi, posizionare il tubo sul supporto magnetico e rimuovere con cautela il tampone di lavaggio una volta che le perle magnetiche si sono aggregate sul lato del tubo.

Successivamente, lavare le perle una volta con 800 microlitri di tampone di lavaggio due utilizzando la stessa procedura. Dopo i lavaggi, sospendere nuovamente le perle in 50 microlitri di tampone di eluizione e incubare i campioni su un rotatore end-to-end per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi, trasferire il surnatante in un tubo nuovo con l'aiuto del supporto magnetico.

Aggiungere sei microlitri di cloruro di sodio a cinque molari per invertire la reticolazione seguiti da due microlitri di proteinasi K.Dopo aver mescolato i campioni, incubarli per due ore a 65 gradi Celsius. A questo punto, i campioni possono essere analizzati direttamente per i siti di legame delle proteine come descritto nel protocollo di testo, oppure possono essere conservati a meno 20 gradi Celsius. Per confermare il legame di SMAD2 indotto dal TGF beta 1 al promotore SCF, è stato eseguito il test di immunoprecipitazione della cromatina.

Il trattamento con TGF beta 1 ha portato al legame di SMAD2 con il promotore SCF nelle linee di cancro al fegato umano, HepG2 e Hep3B. In assenza di stimolazione con TGF beta 1, non è stato osservato alcun legame con SMAD. Come controllo positivo, per l'attivazione di SMAD indotta da TGF beta 1, è stata eseguita l'immunoprecipitazione della cromatina per PAI-1.

Il promotore PAI-1 è un bersaglio noto di TGF beta e SMAD. La specificità dell'immunoprecipitazione di SMAD2 è stata confermata attraverso l'uso di anticorpi IgG non specifici. Non è stato osservato alcun legame di SMAD2 con SBE dopo immunoprecipitazione con IgG.

Per confermare il legame di STAT3 indotto dal TGF Beta 1 al gene del ligando del TGF beta, sono stati eseguiti saggi di immunoprecipitazione della cromatina utilizzando cellule HepG2 e Hep3B trattate con TGF beta 1. Il trattamento con TGF beta 1 ha portato al legame di STAT3 al secondo sito di legame putativo di STAT3 del gene TGF beta, ma non al primo. In questo esempio, il legame positivo di STAT3 con STB-2 funge da controllo positivo interno.

Analogamente all'altro esperimento di immunoprecipitazione della cromatina, il legame di STAT3 con l'ST-2 non è stato osservato dopo l'immunoprecipitazione con IgG. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in uno o due giorni a seconda dell'anticorpo se viene eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante seguire le linee guida di sicurezza del laboratorio ed essere estremamente accurati in ogni fase del protocollo.

Durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere precauzioni come il controllo della scheda di sicurezza e l'uso di dispositivi di protezione come guanti, camice bianco e occhiali di sicurezza. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare il legame delle proteine con le specifiche sequenze di legame del DNA. Seguendo questo protocollo, è possibile eseguire altri metodi, come i saggi del promotore, al fine di confermare la rilevanza funzionale del legame al DNA proteico dimostrato dall'immunoprecipitazione della cromatina.