Un metodo per testare l 'effetto dei segnali ambientali sul comportamento di accoppiamento in Drosophila melanogaster

L'obiettivo generale di questo test comportamentale è quantificare l'effetto delle code ambientali sui comportamenti riproduttivi, come il corteggiamento e l'accoppiamento. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia comportamentale e dell'eurogenetica. Come l'inferenza di fattori genetici e ambientali sui comportamenti riproduttivi e i meccanismi che moderano tali comportamenti.

Questa tecnica offre velocità e flessibilità nel testare un'ampia gamma di code ambientali che influiscono sulla riproduzione. E questo con un numero molto buono di repliche. A dimostrare la procedura sarà Jenke Gorter, una studentessa laureata del mio laboratorio.

Inizia l'esperimento preparando un litro di terreno di coltura ricco. Versare un litro di acqua del rubinetto in un bicchiere di vetro da due litri con ancoretta magnetica. E metti il becher su una piastra riscaldante magnetica.

Tenete a bada l'agitazione e alzate la fiamma fino a 300 gradi Celsius, fino a raggiungere la temperatura di ebollizione. Accendere l'agitazione a 500 giri/min e aggiungere gli ingredienti all'acqua bollente. Aspettate che il lievito si spenga vigorosamente.

Quindi abbassare la temperatura della piastra riscaldante a 120 gradi Celsius. Dopo 10 minuti, abbassare la piastra riscaldante a 30 gradi Celsius. E lasciate mescolare il composto, fino a quando non si raffredda a 48 gradi Celsius.

Monitorare la temperatura inserendo un termometro direttamente nel cibo. Sciogliere due grammi di Tegosept in 10 millilitri di etanolo al 96%. Unire la miscela e cinque millilitri di acido propionico molare al becher.

Mescolate per tre minuti. Scaldare un ago fino al rossore in un bruciatore bunsen. E praticare un foro di 0,3 centimetri di diametro sul lato superiore di una capsula di Petri di plastica di 3,5 centimetri per 1,0 centimetri.

Quando si prepara un terreno alimentare, con composti odorosi, pipettare prima 30 microlitri del composto desiderato nel piatto per 1/2 dei piatti sperimentali. Lascia l'altro 1/2 dei piatti vuoti per il confronto. Utilizzando una pipetta sierologica da cinque millilitri versare tre millilitri di terreno alimentare, coprendo il fondo del piatto.

Coprilo con una garza per evitare contaminazioni e lascia solidificare il terreno per un'ora, a temperatura ambiente. Quindi, metti un coperchio sui piatti e chiudi i coperchi con del nastro adesivo su due lati. Preparare piccoli tappi di pellicola di paraffina per coprire i fori dei piatti arrotolando pezzi di pellicola di paraffina in rotoli spessi due centimetri a punto zero.

E poi tagliateli a zero virgola cinque centimetri. Tagliare due piccoli fori nel setto per adattarli perfettamente ai raccordi spinati e da paratia. Montare tappi di bottiglia aperti a quattro virgola cinque centimetri con un setto Silcone di tre due centimetri di spessore zero virgola.

Collegare il tubicino in PVC a entrambe le uscite che escono dalla bottiglia e a una sola delle entrate che entrano nella bottiglia. Quindi, collegare un tubo di vetro all'uscita di ciascun flacone di coltura YPD, utilizzando un piccolo tubo. Riempire il tubo con fibra di vetro.

E autoclave prima dell'uso. Avvolgere i cappucci e i tubi montati in un foglio di alluminio. E autoclavali per 25 minuti a 120 gradi Celsius e una pressione di un bar.

Immergere un puntale di pipetta sterile da 100 microlitri in una delle colonie di lievito dalla piastra YPD Agar e lasciarlo cadere nel flacone di terreno liquido YPD autoclavato. Tappare questa bottiglia di lievito e YPD liquido oculato, nonché una bottiglia di controllo YPD medium, senza lievito, con tappi autoclavati, montata all'interno di un'uscita. Per evitare la contaminazione del mezzo YPD con microrganismi, collegare il tubo piccolo a un filtro per siringa sterile da quattro micrometri di punto zero, con una pressione di plastica sul connettore del tubo da paratia, andando verso il filtro.

E una vite sul connettore della paratia in plastica che esce dal filtro. Quindi collegare il tubo all'ingresso del flacone di coltura YPD. Posizionare le bottiglie su piastre magnetiche separate.

E mescolare la soluzione a 100 giri/min, a temperatura ambiente, per 24 ore prima dell'inizio dell'esperimento. Collegare gli ingressi di entrambe le bottiglie a un tubo collegato all'aria pressurizzata. Assicurati di collegare l'uscita della bottiglia di lievito sperimentale a un tubo che sfiati l'odore di lievito fuori dalla stanza sperimentale, per evitare interferenze con l'esperimento.

Collegare il tubo in PVC al lato di uscita del tubo di vetro e condurlo verso i fori inferiori della scatola dell'esperimento. Utilizzando un separatore a T, con diametro esterno maggiore o uguale a zero virgola cinque centimetri, e brevi pezzi di piccolo tubo in PVC, collegare due pipette sierologiche a ciascuna delle due uscite su entrambi i lati. Fissare le pipette con del nastro adesivo sul foglio di carta bianco sotto le telecamere, nella scatola d'acciaio.

Utilizzare una pipetta orale per posizionare una femmina sperimentale in una piccola capsula di Petri a ZT sei. E lascia che la mosca si acclimati all'arena di accoppiamento per un'ora. Dopo un'ora, alla ZT sette, trasferisci un maschio di tipo selvatico nella capsula di Petri.

E fai clic su Inizia monitoraggio per 24 ore. Per l'esperimento della pompa dell'aria, posizionare il piatto in modo tale che un'uscita per pipette sia collegata al foro d'ingresso dell'arena di accoppiamento. Per analizzare il comportamento di accoppiamento della coppia, selezionare un'opzione Apri tutte le immagini, in un software di visualizzazione delle immagini.

E sfogliali in ordine cronologico. Annota la data, il numero dell'esperimento, il numero del piatto e l'ora di inizio in un foglio di calcolo all'interno della stessa riga. Prendi l'orario di inizio di ogni arena dal momento in cui viene posizionata sotto la webcam della webcam.

Registrare il timestamp dalle immagini. Segna l'ora di inizio di ogni copulazione nella stessa riga, nel foglio di calcolo. Conta un accoppiamento come un incidente, quando il maschio ha montato la femmina e la coppia rimane moderatamente immobile e nella stessa postura, per almeno cinque fotogrammi consecutivi.

L'analisi dell'aria del lievito, separata per il mezzo alimentare, mostra che una coppia di accoppiamento non risponde agli odori del lievito quando non c'è lievito presente nel mezzo alimentare. Ma aumentano la loro frequenza di accoppiamento nell'aria del lievito quando il lievito viene aggiunto anche al mezzo alimentare. La ricettività femminile aumenta in presenza di acido acetico.

Ma solo quando il peptone è presente nel mezzo, dimostrando che le mosche hanno bisogno di percepire contemporaneamente gli aminoacidi e l'acido acetico, per aumentare la loro frequenza di accoppiamento. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere impostata in sei ore. E l'analisi comportamentale può essere eseguita in cinque ore, se eseguita correttamente.