Un metodo per testare l 'effetto dei segnali ambientali sul comportamento di accoppiamento in

L'obiettivo generale di questo test comportamentale è quantificare l'effetto degli stimoli ambientali sui comportamenti riproduttivi, come il corteggiamento e l'accoppiamento. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia comportamentale e della neurogenetica, ad esempio riguardo all'influenza di fattori genetici e ambientali sui comportamenti riproduttivi e ai meccanismi che modulano tali comportamenti.

Questa tecnica offre velocità e flessibilità nel testare un'ampia gamma di stimoli ambientali che influenzano la riproduzione, e ciò con un numero molto elevato di repliche. La procedura sarà dimostrata da Jenke Gorter, una studentessa laureanda del mio laboratorio.

Iniziare l'esperimento preparando un litro di mezzo ricco per Drosophila. Versare un litro di acqua del rubinetto in un becher di vetro da due litri contenente una bacchetta magnetica di agitazione. Posizionare quindi il becher su una piastra magnetica riscaldante.

Mantenere la miscelazione spenta e aumentare il calore fino a 300 gradi Celsius, finché non si raggiunge la temperatura di ebollizione. Accendere la miscelazione a 500 giri al minuto e aggiungere gli ingredienti all'acqua bollente. Attendere che il lievito schiumi vigorosamente.

Quindi ridurre la temperatura della piastra riscaldante a 120 gradi Celsius. Dopo 10 minuti, abbassare ulteriormente la temperatura della piastra a 30 gradi Celsius. Lasciare mescolare la miscela finché non si sarà raffreddata a 48 gradi Celsius.

Controllare la temperatura inserendo un termometro direttamente nell'alimento. Sciogliere due grammi di Tegosept in 10 millilitri di etanolo al 96%. Aggiungere la miscela e cinque millilitri di acido propionico uno molare al becher.

Agitare per tre minuti. Riscaldare un ago fino a incandescenza in un becco di Bunsen e praticare un foro di 0,3 centimetri di diametro sulla parte superiore di una piastra di Petri di plastica di 3,5 centimetri per 1,0 centimetro.

Quando si prepara il mezzo alimentare con composti odorosi, pipettare prima 30 microlitri del composto desiderato nella piastra per 1/2 delle piastre sperimentali. Lasciare l'altra metà delle piastre vuota per confronto. Utilizzando una pipetta sierologica da cinque millilitri, versare tre millilitri di mezzo alimentare, coprendo il fondo della piastra.

Coprirlo con un panno di garza per prevenire contaminazioni e lasciare solidificare il mezzo per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, posizionare un coperchio sulle piastre e sigillare i coperchi con del nastro adesivo su due lati. Preparare piccoli tappi di pellicola di paraffina per coprire i fori delle piastre arrotolando pezzi di pellicola di paraffina in rotoli spessi zero virgola due centimetri.

E quindi tagliarli in segmenti di zero virgola cinque centimetri. Praticare due piccoli fori nel settino per inserire con precisione raccordi a barbetta passaparete. Montare coperchi da quattro virgola cinque centimetri con un settino in silicone spesso zero virgola tre due centimetri.

Collegare il tubicino in PVC a entrambe le uscite che escono dalla bottiglia e a una sola delle entrate che entrano nella bottiglia. Successivamente, collegare un tubo di vetro all'uscita di ciascuna bottiglia di coltura YPD, utilizzando un tubicino piccolo. Riempire il tubo con fibra di vetro.

E sterilizzarlo in autoclave prima dell'uso. Avvolgere i tappi a tenuta e i tubi in carta di alluminio. E sterilizzarli in autoclave per 25 minuti a 120 gradi Celsius e una pressione di un bar.

Immergere un’aspira sterile da 100 microliter in una delle colonie di lievito presente nella piastra di Agar YPD ed inserirla nel flacone contenente il mezzo liquido YPD sterilizzato. Chiudere con un tappo sterilizzato il flacone contenente il lievito e il mezzo liquido YPD inoculato, così come un flacone di controllo con mezzo YPD senza lievito, utilizzando tappi sterilizzati montati all’interno di un’uscita. Per prevenire la contaminazione del mezzo YPD con microrganismi, collegare un tubicino di dimensioni ridotte ad un filtro sterile per siringa da zero virgola quattro cinque micrometri, utilizzando un connettore plastico a innesto sul raccordo del tubicino, orientato verso il filtro.

E un connettore filettato in plastica passante che esce dal filtro. Quindi collegare il tubo all'ingresso della bottiglia contenente la coltura YPD. Posizionare le bottiglie su piastre magnetiche separate.

E agitare la soluzione a 100 giri/min, a temperatura ambiente, per 24 ore prima dell'inizio dell'esperimento. Collegare gli ingressi di entrambe le bottiglie a un tubo collegato all'aria compressa. Assicurarsi di collegare l'uscita della bottiglia con il lievito sperimentale a un tubo che smaltisca l'odore del lievito fuori dalla stanza dell'esperimento, per evitare interferenze con l'esperimento.

Collegare un tubo in PVC al lato di uscita del tubo di vetro e indirizzarlo verso i fori inferiori della scatola dell'esperimento. Utilizzando un raccordo a T, con diametro esterno maggiore o uguale a zero virgola cinque centimetri, e brevi spezzoni di tubo in PVC di piccole dimensioni, collegare due pipette serologiche a ciascuna delle due uscite sui lati opposti. Fissare le pipette in piano sul foglio di carta bianca posizionato sotto le telecamere, all'interno della scatola di acciaio.

Utilizzare una pipetta a bocca per posizionare una femmina sperimentale in una piccola capsula di Petri al tempo ZT sei. Lasciare che la mosca si abitui all'arena di accoppiamento per un'ora. Trascorsa un'ora, al tempo ZT sette, trasferire un maschio di tipo selvatico nella capsula di Petri.

E fare clic su Avvia monitoraggio per 24 ore. Per l'esperimento con la pompa d'aria, posizionare la piastra in modo che l'uscita della pipetta sia collegata al foro di ingresso dell'arena di accoppiamento. Per analizzare il comportamento riproduttivo della coppia, selezionare e aprire tutte le immagini in un software di visualizzazione delle immagini.

E sfogliarli in ordine cronologico. Riportare data, numero dell'esperimento, numero della piastra e ora di inizio in un foglio di calcolo all'interno della stessa riga. Prendere l'ora di inizio di ogni arena a partire dal momento in cui viene posizionata sotto la telecamera web.

Registrare il timestamp dalle immagini. Segnare l'ora di inizio di ogni accoppiamento nella stessa riga del foglio di calcolo. Considerare un accoppiamento come un evento quando il maschio ha montato la femmina e la coppia rimane moderatamente immobile e nella stessa posizione per almeno cinque fotogrammi consecutivi.

L'analisi dell'aria di lievito, separata per il mezzo di coltura, mostra che una coppia in accoppiamento non risponde agli odori del lievito quando non è presente lievito nel mezzo di coltura. Tuttavia, aumentano la frequenza di accoppiamento nell'aria di lievito quando il lievito viene aggiunto anche al mezzo di coltura. La ricettività femminile aumenta in presenza di acido acetico.

Ma solo quando la peptone è presente nel mezzo, dimostrando che le mosche devono percepire simultaneamente aminoacidi e acido acetico per aumentare la loro frequenza di accoppiamento. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere allestita in sei ore. E l'analisi del comportamento può essere eseguita in cinque ore, se effettuata correttamente.