Valutazione della complessità dendritica ippocampale nei topi invecchiati utilizzando il metodo Golgi-Cox
22 giugno 2017
Qui presentiamo un protocollo Golgi-Cox in dettagli estesi. Questo metodo affidabile di macchie di tessuto consente una valutazione di alta qualità della cytoarchitettura nell'ippocampo, e in tutto il cervello, con una minima risoluzione dei problemi.
L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di colorare correttamente il tessuto cerebrale al fine di esaminare e quantificare la morfologia e la complessità dei dendritici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nelle neuroscienze. Poiché la colorazione Golgi colora solo un piccolo sottoinsieme di cellule, questa tecnica potrebbe essere utilizzata per tracciare la struttura dei neuroni.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che le sezioni cerebrali possono essere facilmente macchiate senza il rischio che si secchino o cadano durante una qualsiasi delle fasi di lavaggio. A dimostrare la procedura saranno Fred Kiffer, Tyler Alexander e Julie Anderson, studenti laureati nel laboratorio del Dr. Allen. Inizia immergendo i semicervelli dei roditori appena raccolti e non fissati in cinque millilitri o in una soluzione a base di cloruro mercurico.
Poiché la soluzione di cloruro di mercurio è sensibile alla luce, coprire il tubo con un foglio. Conservare i campioni al buio a temperatura ambiente. Il giorno seguente, decantare lentamente la soluzione in un contenitore temporaneo prima di smaltirla correttamente in un contenitore per rifiuti a rischio biologico.
Aggiungi cinque millilitri di soluzione fresca di cloruro di mercurio e assicurati che il cervello sia immerso. Rimettere i campioni al buio a temperatura ambiente per altri 13 giorni. Dopo 14 giorni, preparare il tampone post-impregnazione aggiungendo 30 grammi di tampone post-impregnazione potenziato a 90 millilitri di acqua distillata o deionizzata, DH2O.
Riempire ogni pozzetto della piastra a sei pozzetti con 6,5 millilitri di tampone post-impregnazione, un pozzetto per cervello. Quindi, rimuovere la soluzione di cloruro di mercurio dal tessuto cerebrale come prima. Sciacquare il fazzoletto con DH2O, quindi trasferire il fazzoletto nelle piastre a sei pozzetti con tampone di post-impregnazione.
Coprire i piatti con un foglio di alluminio e conservare a temperatura ambiente al buio. Il giorno successivo, aspirare e sostituire il tampone di post-impregnazione. Ricoprite il piatto e conservatelo in frigorifero a quattro gradi Celsius.
Preparare due o tre piastre da 12 pozzetti per cervello etichettando prima le piastre sui coperchi con numeri in ordine crescente da sinistra a destra e dall'alto verso il basso. Aggiungere il numero di identificazione del cervello sezionato. Pipettare due millilitri di 1X PBS in ciascun pozzetto di ciascuna piastra, quindi allestire il tavolino e accendere il vibratomo.
Quindi, metti del nastro adesivo sul blocco di tessuto del portacampioni e aggiungi un po' di colla cianoacrilica sopra. Rimuovi un cervello dalla piastra a sei pozzetti e posizionalo su un piatto di plastica o di vetro. Utilizzare una lama a doppio taglio in acciaio inossidabile per tagliare il cervelletto caudalmente, assicurandosi che la parte del cervelletto rimasta sul cervello sia piatta.
Quindi, posiziona la superficie piana del cervelletto rimanente sulla colla. Dopo che la colla si è asciugata, posizionare il portacampioni con il fazzoletto nel bagno del campione. Posizionare il bagno del campione sul vibratomo e coprire il campione di tessuto con PBS.
Quindi, collegare la lama al supporto della lama del vibratomo e abbassare lentamente la lama nel bagno del campione fino a quando non è completamente immersa e leggermente al di sotto della parte superiore del tessuto. Quindi, imposta la velocità del vibratomo su sette, l'ampiezza su sei e l'angolo di taglio su 12 gradi. Avvia la vibrazione e taglia sezioni da 200 micron.
Utilizzare un pennello grande per spostare le sezioni di tessuto dal bagno del campione in ciascun pozzetto designato delle piastre a 12 pozzetti. Continuare a tagliare il tessuto fino a raggiungere il numero desiderato di sezioni di tessuto. Dopo il sezionamento, utilizzare una pipetta di trasferimento per aspirare il PBS dai pozzetti della piastra a 12 pozzetti, quindi aggiungere due millilitri di PBS-T e lavare per 30 minuti con agitazione.
Verso la fine del periodo di lavaggio, diluire tre parti di soluzione di idrossido di ammonio con cinque parti di DH2O. Quindi, dopo aver rimosso il PBS-T, aggiungere la soluzione diluita di idrossido di ammonio. Proteggere dalla luce con un foglio e macchiare le sezioni per 19-21 minuti.
Quindi, dopo aver rimosso in sicurezza la soluzione di idrossido di ammonio, aggiungere il tampone post-colorazione. Proteggere con un foglio e macchiare per altri 19-21 minuti. Infine, sciacquare le sezioni in PBS-T tre volte per cinque-10 minuti ogni volta.
Montare le sezioni su vetrini rivestiti di gelatina all'1% con il pennello grande. Lasciarli asciugare per 20-30 minuti a temperatura ambiente, quindi metterli in un barattolo Coplin e lasciarli riposare per una notte. Rimuovere i vetrini dal barattolo Coplin e posizionarli in una griglia di plastica nella cappa aspirante.
Mettere in una pirofila contenente etanolo al 100% per cinque minuti. Disidratare le sezioni attraverso altri due lavaggi di etanolo della durata di cinque minuti. Quindi, posiziona i vetrini in una griglia di vetro e usa una maniglia di metallo per abbassare la griglia in una capsula di vetro contenente il 99% di xilene.
Lavare i vetrini in due cambi di xilene per cinque minuti ciascuno. Trascorso il tempo per il secondo lavaggio, rimuovere i vetrini dallo xilene uno alla volta e coprire rapidamente il tessuto con circa 0,25 millilitri di terreno di montaggio. Quindi, prendi una copertina per diapositive e appoggiala sul supporto.
Spingere eventuali bolle d'aria intrappolate sotto i coperchi delle guide fino al bordo con un oggetto contundente, come l'estremità del pennello. Posiziona i vetrini in un'area al riparo dalla luce solare diretta e lasciali asciugare per due o tre giorni. Dopo l'essiccazione, procedere all'acquisizione delle immagini utilizzando un microscopio e all'analisi con l'apposito software.
Questa immagine in campo chiaro mostra un neurone colorato con Golgi che soddisfa i criteri per l'imaging e ulteriori analisi. Tutti e tre i tipi di colonna vertebrale possono essere facilmente visti. La colorazione è coerente su tutta la lunghezza del dendrite e il dendrite è isolato dagli altri neuroni.
Questa figura mostra che i neuroni colorati con Golgi all'interno del giro dentato hanno mostrato una lunghezza ridotta al quarto e al sesto ordine dopo il trattamento con 5-fluorouracile rispetto al gruppo trattato con soluzione salina. La colorazione Golgi può essere utilizzata per rilevare differenze significative nella densità della colonna vertebrale. Nei dendriti piramidali apicali CA1, la somministrazione di 5-fluorouracile a topi vivi ha ridotto significativamente la densità della colonna vertebrale.
Nei dendriti basali, non ci sono stati cambiamenti significativi nella densità complessiva delle spine. L'analisi di Sholl dei dendriti piramidali apicali CA1 ha rivelato che il trattamento con 5-fluorouracile ha ridotto significativamente l'arborizzazione dendritica a distanze comprese tra 40 e 160 micron di distanza dal soma. Nei dendriti basali, il trattamento con 5-fluorouracile ha diminuito l'arborizzazione dendritica a una distanza compresa tra 30 e 110 micron dal soma.
Una volta padroneggiata, questa tecnica, che tiene conto sia del processo di colorazione del Golgi che del montaggio, della pulizia e della copertura, può essere eseguita in tre ore per cervello se eseguita correttamente. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della neurobiologia per esplorare le connessioni neuroanatomiche in un modello murino. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere le sezioni in soluzione di idrossido di ammonio per soli 19-21 minuti per non sovraccaricare i neuroni.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come colorare, sezionare e risciacquare correttamente il tessuto cerebrale. Non dimenticare che lavorare con la soluzione a base di cloruro mercurico, la soluzione di idrossido di ammonio e lo xilene può essere estremamente pericoloso, quindi prendi precauzioni e indossa guanti da laboratorio e lavora in una cappa aspirante durante l'esecuzione di questa procedura.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo dettagliato di Golgi-Cox per la colorazione del tessuto cerebrale, che consente una valutazione di alta qualità della citotessitura nell'ippocampo e in tutto il cervello. Il metodo riduce al minimo i problemi tecnici e facilita l'esame della morfologia e della complessità dendritica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Neuroanatomia
- Istologia
Sfondo
- La colorazione di Golgi etichetta selettivamente un piccolo sottoinsieme di neuroni.
- Questa tecnica è fondamentale per tracciare le strutture neuronali.
- Permette la valutazione della complessità dendritica.
- Le sezioni cerebrali rimangono integre durante il processo di colorazione.
Scopo dello studio
- Dimostrare un metodo affidabile per la colorazione di Golgi del tessuto cerebrale.
- Facilitare l'esame della morfologia neuronale.
- Fornire un protocollo che minimizzi il rischio di danni al tessuto.
Metodi Utilizzati
- Immergere emisferi cerebrali di roditore non fissati in una soluzione a base di cloruro mercurico.
- Applicazione del protocollo di colorazione Golgi-Cox.
- Valutazione della morfologia e della complessità dendritica.
- Dimostrazione da parte di studenti universitari in un ambiente di laboratorio.
Risultati principali
- Colorazione riuscita di sezioni cerebrali senza essiccazione o danni.
- Visualizzazione di alta qualità delle strutture neuronali.
- Tracciamento efficace della morfologia dendritica.
- Problemi minimi da risolvere nel protocollo.
Conclusioni
- Il protocollo Golgi-Cox è un metodo affidabile per lo studio del tessuto cerebrale.
- Questa tecnica migliora la comprensione dell'architettura neuronale.
- È adatto a varie applicazioni nella ricerca in neuroscienze.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
La valutazione della complessità dendritica ippocampale fornisce informazioni meccanicistiche sui cambiamenti neurocognitivi associati all'invecchiamento e all'esposizione a chemioterapici, sostenendo la validazione degli bersagli nella scoperta di farmaci per il sistema nervoso centrale. Il metodo di Golgi-Cox consente una valutazione quantitativa dell'arborizzazione dendritica e della densità delle spine, offrendo un sistema rilevante per la malattia finalizzato alla riduzione del rischio preclinico di composti neurotossici. Questo approccio sostiene la fiducia predittiva nell'identificazione dei composti promettenti, collegando i cambiamenti strutturali neuronali a risultati funzionali in modelli murini anziani.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche riguardanti i cambiamenti neurostrutturali nell'ippocampo invecchiato.
- Valore operativo: Fornisce una riduzione del rischio biologico mediante la validazione funzionale del bersaglio relativa all'integrità dendritica.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio quantificando le alterazioni indotte dal composto nella densità delle spine e nell'arborizzazione.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara tessuto ippocampale validato per lo screening di composti successivi, garantendo una qualità di colorazione costante.
- Output quantitativo: Fornisce misurazioni riproducibili della lunghezza dendritica, del ramificamento e della densità delle spine in diverse sottoregioni ippocampali.
- Utilità della piattaforma: Permette una valutazione affidabile dei composti mediante fenotipizzazione neuroanatomica standardizzata.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le Malattie: Modella la vulnerabilità ippocampale legata all'età agli agenti chemioterapici come il 5-fluorouracile.
- Continuità Translazionale: Collega le scoperte alla validazione preclinica mediante analisi dendritica specifica per regione.
- Decisioni Adeguate al Rischio: Guida le decisioni di avanzamento identificando precocemente il rischio di neurotossicità nel percorso di sviluppo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo Golgi-Cox si inserisce nel percorso di scoperta, che va dalla verifica dell'ipotesi sul bersaglio all'identificazione del composto promettente fino alla valutazione preclinica della sicurezza, in particolare per composti che attraversano la barriera ematoencefalica.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi relative ai percorsi neurostrutturali e la riduzione del rischio biologico associata all'ambiguità meccanicistica.
- Screening: Fornisce tessuti pronti per saggi con output morfometrici quantitativi per il confronto degli effetti dei composti.
- Analisi: Permette l'analisi di Sholl e la quantificazione della densità delle spine dendritiche per confrontare diverse condizioni e valutare l'impatto dei composti.
- Ricerca traslazionale: Collega i cambiamenti strutturali dell'ippocampo alla continuità preclinica attraverso la vulnerabilità specifica delle regioni CA1, CA3 e DG.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma istologica riutilizzabile per lo screening neuroanatomico in diversi ambiti terapeutici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Maggiore affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi grazie alla riduzione dell'ambiguità meccanicistica nei cambiamenti strutturali neuronali.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità della valutazione della morfologia dendritica attraverso diverse regioni cerebrali.
- Valore strategico: Decisioni più accurate sul proseguimento o l'interruzione dei progetti, maggiore efficienza nell'uso del capitale e riduzione del rischio biologico in fase avanzata dello sviluppo di neuroterapie.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione corretta per rischio basata sulla complessità dendritica e sulla densità delle spine come biomarcatori traslazionali.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze specifiche in neuroistologia e manipolazione dei tessuti per l'esecuzione corretta della colorazione di Golgi.
- È dipendente da strumentazione specializzata, inclusa la vibratomo per la sezionatura e la microscopia in campo chiaro per l'acquisizione delle immagini.
- Necessita di una standardizzazione tra i vari gruppi di lavoro, tra istologia, acquisizione delle immagini e analisi, al fine di ottenere risultati riproducibili.
- Richiede considerazioni di adattamento quando si applica il metodo a diverse regioni cerebrali o modelli di malattia.
- Comprende limitazioni pratiche, come la manipolazione di reagenti pericolosi (cloruro mercurico, idrossido di ammonio, xilene), che richiede l'uso della cappa chimica e di dispositivi di protezione individuale (DPI).
