Circuiti neuronali riavvolgenti: un nuovo metodo per l'estensione veloce del neurite e la connessione neuronale funzionale

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di avviare nuovi neuriti, estenderli rapidamente e collegarli con precisione alle cellule bersaglio. Questa procedura è possibile solo utilizzando cellule coltivate in un ambiente controllato e riproducibile. Questo metodo ci permette di rispondere a domande chiave nelle neuroscienze.

Cosa limita il tasso di crescita dei neuroni? Quanto velocemente possono crescere? Gli indizi meccanici giocano un ruolo?

Possiamo anche studiare come si formano le sinapsi, come fanno i neuroni a trovare una cellula bersaglio? Come invecchiano, maturano le sinapsi? E in terzo luogo, possiamo iniziare a costruire sistematicamente reti neurali, studiare come calcolano i neuroni.

I principali vantaggi di questa tecnica sono che consente una facile manipolazione, riproducibilità sperimentale e, in ultima analisi, un alto grado di controllo a livello di singola cellula. Per iniziare questa procedura, pulire e preparare il numero desiderato di vetrini protettivi sterili. Quindi, rivestire ogni vetrino coprioggetti con 0,5-1 millilitro di 100 microgrammi per millilitro PDL per almeno due ore a temperatura ambiente.

Successivamente, lavare due volte i vetrini coprioggetto con acqua e rimuovere tutto il liquido. Lasciarli asciugare in un ambiente sterile per 5-10 minuti o fino a quando la superficie non sarà completamente asciutta. Quindi, posizionare i dispositivi microfluidici con i modelli rivolti verso l'alto sotto la luce UV in una cabina di biosicurezza per 10 minuti.

Dopo 10 minuti, posizionare un dispositivo microfluidico con il modello rivolto verso il basso a contatto con il vetrino coprioggetto pulito. Usa le pinzette per premere delicatamente il dispositivo in modo che aderisca al vetro. Per riempire il dispositivo di popolazione singola con il terreno, aggiungere 50 microlitri di terreno cellulare completo al pozzetto superiore destro.

E poi aggiungere altri 50 microlitri di terreno cellulare completo al pozzetto diagonale ad esso. Per riempire il dispositivo a popolazioni multiple con il terreno, aggiungere 30 microlitri di NBM completo a una fila di pozzetti. Assicurati che il fluido scorra tra i pozzetti.

Quindi, aggiungere 50 microlitri di terreno a ciascuno dei pozzetti rimanenti. Posizionare i dispositivi in un piatto più grande con un piatto aperto di acqua autoclavata e posizionare il piatto nell'incubatore per una o due ore durante la preparazione della coltura cellulare. Ora, rimuovere il fluido dai pozzetti superiori dei dispositivi microfluidici senza svuotare i pozzetti.

Quindi, aggiungere 20 microlitri della soluzione cellulare concentrata nel pozzetto in alto a destra del dispositivo microfluidico e controllare al microscopio come scorrono le cellule all'interno del dispositivo microfluidico a singola popolazione. Per piastrare le cellule nel dispositivo a popolazioni multiple, aggiungere 20 microlitri della soluzione cellulare concentrata in ciascuno dei pozzetti superiori. Al microscopio, controlla se le cellule sono all'interno delle camere.

Successivamente, posizionare i dispositivi nell'incubatore per 15-30 minuti per favorire l'adesione delle cellule al substrato. Dopo che le cellule si sono attaccate al substrato, aggiungere 40 microlitri di NBM ai due pozzetti superiori del dispositivo a popolazione singola. Questo aiuterà a rimuovere le bolle d'aria dai micro canali.

Aggiungere 20 microlitri di MBM ai pozzetti superiori del dispositivo a popolazioni multiple, gli stessi pozzetti in cui sono state iniettate le cellule. Il terreno dovrebbe sporgere leggermente per formare un menisco positivo e dare ai pozzetti un aspetto superiore da muffin. Uno o due giorni prima della rimozione del dispositivo microfluidico, aggiungere due millilitri di NBM preriscaldato a ciascun piatto campione e allagare le camere.

Quindi, conservare i dispositivi nell'incubatrice. Successivamente, utilizzare una pinzetta sterile e una punta di pipetta per rimuovere i dispositivi microfluidici dai vetrini coprioggetti lasciando una configurazione modellata di neuroni. In questa procedura, e da 40 a 60 microlitri di perle rivestite di PDL preparate alla coltura cellulare.

Quindi, rimettere il campione nell'incubatrice per un'ora per favorire la formazione di contatti sinaptici. Successivamente, installare il campione in una configurazione sperimentale in modo tale che le cellule possano essere valutate dall'alto con due micropipette e siano anche accessibili otticamente. In questa configurazione, una telecamera CCD si trova sulla porta laterale del microscopio per l'acquisizione delle immagini.

Collegare ogni pipetta riempita di soluzione fisiologica a una siringa da un millilitro, quindi perfondere il campione con una soluzione fisiologica. Successivamente, al microscopio, controllare il divario tra le due popolazioni neuronali isolate per assicurarsi che le due popolazioni non siano naturalmente collegate. Selezionare un bead PDL che non sia attaccato al neurone nel campo visivo.

Allineare il cordone con la punta di una micropipetta concentrandosi sul perlina e poi sulla micropipetta. Successivamente, avvicinare il più possibile la punta al cordone monitorandola al microscopio. Quindi, applicare una pressione negativa alla pipetta per prelevare il cordone e mantenere la pressione negativa per tutta la durata dell'esperimento.

A questo punto, selezionare una perlina PDL attaccata a un neurone nel campo visivo e collegarla alla seconda micropipetta mediante aspirazione. Estrarre il complesso neuronale della perlina PDL muovendo lentamente il micromanipolatore o lo stadio del campione a 0,5 micrometri al minuto per 1 micrometro e fare una pausa per cinque minuti per consentire l'inizio del neurite. Tirare il complesso neuronale della perlina PDL spostandolo lentamente lateralmente a 0,5 micrometri al minuto su due micrometri, quindi fare una pausa per cinque minuti per consentire l'allungamento dei neuriti.

Dopo l'inizio riuscito e l'estensione del neurite per i primi cinque micrometri, tirare continuamente il neurite a 20 micrometri al minuto. Per collegare i neuroni, seleziona una regione ricca di neuriti. Utilizzare altre perle per misurare l'altezza della punta della pipetta sopra il vetrino coprioggetti e abbassare il complesso neuritico della perlina PDL in modo che entri fisicamente in contatto con i neuriti.

Lasciare il complesso di neurite della perlina PDL a contatto con il neurite bersaglio mentre si manipola la seconda micropipetta. Quindi, abbassare la seconda pipetta con la seconda perlina PDL sopra il neurite appena formato a circa 20 micrometri dalla prima perlina e utilizzare la seconda perlina PDL per spingere il nuovo filamento di neurite verso la cellula bersaglio. Quindi, tieni entrambe le perline in posizione per almeno un'ora.

Verificare al microscopio l'assenza di rigonfiamento focale, un ispessimento dei neuriti a contatto con la perlina. Durante questo periodo, cambiare lentamente il mezzo del campione da soluzione fisiologica a NBM bilanciato con anidride carbonica preriscaldata. Rilasciare il cordone dalla seconda pipetta rilasciando l'aspirazione.

Se il nuovo neurite rimane attaccato, rilascia anche la prima perlina. Successivamente, riposizionare con cura il campione nell'incubatrice per rafforzare la connessione neuronale per esperimenti futuri. È possibile utilizzare le registrazioni di patch clamp a celle intere per studiare la funzionalità elettrica della connessione micromanipolata.

Qui sono mostrate le popolazioni neuronali isolate separate da un divario di 100 micrometri nei microdispositivi PDMS. Le registrazioni da coppia a patch clamp sono state eseguite in configurazione a cellula intera e le connessioni indotte meccanicamente sono state analizzate e confrontate con quelle in popolazioni neuronali naturalmente connesse e popolazioni non connesse. Le risposte elettriche dopo il potenziale d'azione presinaptico registrate dai neuroni collegati naturalmente e mediante micromanipolazione sono significativamente più elevate e si correlano temporaneamente con l'attività presinaptica.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in otto ore se eseguita correttamente e, mentre si tenta questa procedura, è importante ricordare di avere colture cellulari sane e ben strutturate a lungo termine per garantire risultati rapidi e riproducibili. Seguendo questa procedura, è possibile utilizzare diversi metodi per verificare la funzionalità elettrica della connessione micromanipolata. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come far crescere le popolazioni cellulari in camere microfluidiche e utilizzare le manipolazioni delle pipette per avviare, estendere e collegare i neuriti.