Name: Circuiti neuronali riavvolgenti: un nuovo metodo per lestensione veloce del neurite e la connessione neuronale funzionale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Impara a iniziare, estendere e connettere rapidamente i neuriti usando microcamere e micropipette guidate da perline rivestite con poli-D-lisina. Questo metodo permette di studiare la crescita neuronale e i segnali meccanici.

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Vorremmo ringraziare Yoichi Miyahara per molte discussioni e approfondimenti utili. MA e PG riconoscono il finanziamento da NSERC.

Tutte le procedure descritte di seguito sono state approvate dalla McGill University Animal Care Committee e sono conformi alle linee guida del Consiglio canadese di Animal Care. 1. Standardizzazione delle culture neuronali usando dispositivi microfluidici: Assemblaggio di apparecchiature <ol><li> Selezionare un dispositivo microfluidico adatto per l&#39;esperimento desiderato. Per collegare i neuroni all&#39;interno della stessa popolazione, utilizzare i Neuro Devices ( Figura 1 ) e collegare i neuroni in diverse popolazioni usa i dispositivi Co-Cultura ( Figura 6 ). </li><li> Pulire e preparare il numero desiderato di coperchietti sterili o piatti di fondo in vetro. Per ottenere risultati ottimali sulle superfici di plastica utilizzare piatti da 35 mm, su vetri da 25 mm, oppure da piatti di fondo da 35 mm. Selezionare lo spessore del vetro basato sul sistema di imaging, ad esempio 0,15 mm. </li><li> Cappare i piatti o le copertine con 0,5-1 ml di 100 μg / mL PDL per 2 ore o durante la notte a temperatura ambienteature. Nota: il protocollo può essere interrotto qui e ripreso il giorno successivo, se lo si desidera. Inoltre, i piatti possono essere rivestiti con PDL diluito in borato, PolyL-Lysine (PLL), laminina o qualsiasi altra molecola di adesione cellulare. </li><li> Lavare i piatti due volte con acqua (non utilizzare saline fosforato-tamponato (PBS) in quanto i cristalli salini possono bloccare i canali), rimuovere tutto il liquido e lasciarlo asciugare in un ambiente sterile come un armadio per la biosicurezza per 5-10 minuti o fino a La superficie è completamente asciutta. Nota: Fare attenzione a garantire che le copertine siano assolutamente asciutte, poiché qualsiasi liquido residuo interferisce con l&#39;adesione dei sistemi microfluidici. </li><li> Posizionare i dispositivi microfluidici con i modelli rivolti verso l&#39;alto sotto la luce UV in un ambiente sterile (armadio di biosicurezza) per 10 min. Assicurarsi di seguire le procedure sterili quando si lavora nell&#39;armadio della biosicurezza 10 . </li><li> Usando le pinzette mettere un dispositivo microfluidico con il modello rivolto verso il basso in contatto con i coperchi pulitiip / piatto. Utilizzare le pinzette per premere dolcemente il dispositivo in modo che aderisca al vetro. Nota: la trasparenza della regione aderente sarà visibile quando si guarda contro la luce. Assicurarsi che tutti gli angoli stiano contattando il vetro. Fai questo a tutti i dispositivi microfluidici. Vedere la Figura 1a . </li><li> Per riempire il dispositivo della singola popolazione con il mezzo, puntare la pipetta verso i canali e aggiungere 50 μl di mezzo completo di cellule integrati con B-27 privo di sieri (rapporto di volume 1:50) e 500 μg / mL di penicillina / streptomicina / glutamina Chiamato NBM) al pozzo superiore destro e quindi aggiungere un altro 50 μL al pozzetto che si trova diagonalmente ad esso. Fai questo per tutti i dispositivi, assicurandoti che il mezzo scorre tra pozzetti. Successivamente, aggiungere 50 μL di mezzo ai restanti 2 pozzetti. Vedere la Figura 2a . <ol><li> Per riempire il dispositivo multiplo di popolazione con il mezzo, puntare la pipetta verso i canali e aggiungere 30 μLDella NBM completa ai pozzetti di destra, fare riferimento alla Figura 6a . Fai questo per tutti i dispositivi, assicurandoti che il mezzo scorre tra pozzetti. Successivamente, aggiungere 50 μL di mezzo ai restanti 4 pozzetti. </li></ol></li><li> Posizionare i dispositivi in ​​una piastra più grande con un piatto aperto con acqua autoclave (camera bagnata) e collocare nell&#39;incubatrice (37 ° C, 5% CO 2 e 95% di umidità) per 1-2 h durante la preparazione della coltura cellulare. Vedere la Figura 2b . </li></ol> 2. Neuroni di placcatura nei sistemi microfluidici <ol><li> Seguendo il protocollo delineato in Rif. 8 , ottenere neuroni ippocampali dissociati o corticali da embrioni di ratto di Sprague Dawley (entrambi i sessi). </li><li> Resuspendere i neuroni embrionali in NBM a una concentrazione di 1-2 milioni di neuroni / ml. Verificare le concentrazioni di cellule nel microscopio usando un emocitometro e seguendo il riferimento 8 . Regolare la concentrazione della concentrazione cellulareG alla densità cellulare desiderata. Per aumentare le probabilità di ottenere singoli assi ippocampali per canale, piastra 10.000 neuroni per dispositivo. Per avere più assoni nello stesso canale, inserire 60.000 neuroni per dispositivo. Nota: Questi numeri variano in funzione del tipo neuronale utilizzato. </li><li> Rimuovere il mezzo dai dispositivi microfluidici senza svuotare i pozzetti. Lasciare circa 5 μL in ciascuno. </li><li> Per piastrare le celle nel dispositivo della popolazione singola, aggiungere 50 μL di NBM al pozzo inferiore destro. A questo punto il mezzo scorre da solo per riempire l&#39;altro pozzo inferiore. Aggiungere 20 μL della soluzione di cellule concentrate nel pozzo superiore destro del dispositivo microfluidico, come indicato in figura 1b . <ol><li> Per piastrare le cellule nel dispositivo multiplo della popolazione aggiungere 20 μL della soluzione di cellule concentrate in ciascuno dei pozzetti di destra nella figura 6a . </li></ol></li><li> Controllare nel microscopio se le celleSono all&#39;interno delle camere e collocano i dispositivi nell&#39;incubatrice per 15-30 minuti per promuovere l&#39;attaccamento cellulare al substrato. </li><li> Controllare il microscopio se ci sono celle sufficienti nelle camere. Se sono necessari ulteriori, ripetere i passaggi 2.4 e 2.5. </li><li> Aggiungere 50 μL di NBM ai 2 pozzetti superiori del dispositivo di popolazione singola e 20 μL di NBM nello stesso pozzetto in cui le cellule sono state iniettate nel dispositivo multiplo della popolazione. I supporti si sporgono leggermente per formare un menisco positivo, dando ai pozzetti un aspetto superiore della muffin. Ancora una volta, vedere la Figura 2a . </li><li> Mantenere le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 e 95% di umidità. </li></ol> 3. Manutenzione delle culture neuronali <ol><li> Rimuovere NBM (circa 30 μL con una pipetta) dalle cellule e applicare il nuovo NBM preriscaldato il giorno successivo alla loro introduzione ai dispositivi (cioè 1 d dopo il passo 2). </li><li> Controllare ogni 2 giorni se c&#39;è sufficiente mezzo in ogni canale. Se il muffin tOp è basso basta aggiungere più medio ai pozzi superiori. </li><li> Coltivare le cellule per almeno 7 giorni prima della rimozione dei dispositivi microfluidici. Le cellule possono sopravvivere in questi dispositivi per diverse settimane. Rimuovere i dispositivi 1-2 giorni prima che gli esperimenti siano eseguiti sui campioni. </li></ol> 4. Rimozione dei dispositivi microfluidici <ol><li> 1 - 2 d prima della rimozione dei dispositivi microfluidici, aggiungere 2 mL di NBM preriscaldati a 37 ° C ad ogni piatto di campione, inondando le camere e mantenere i dispositivi nell&#39;incubatrice. </li><li> Utilizzare pinzette sterili e una punta per rimuovere i dispositivi microfluidici dai coperchi lasciando una configurazione di neuroni modellata. Utilizzare la punta per tenere la copertura in posizione e le pinzette per chiudere il bordo del dispositivo nell&#39;angolo inferiore sinistro del pozzetto. Applicare delicatamente la torsione, sollevando il dispositivo con le pinzette in modo da sbucciare la copertura. Vedere la Figura 2c - 2d . </li><li> Ogni 2-3 giorni, sostituire l&#39;haSe la NBM finché il campione non viene utilizzato per gli esperimenti. </li><li> Prima di eseguire esperimenti di riavvolgimento sul campione, verificare che le neurite nei singoli canali di popolazione e le popolazioni neuronali nel dispositivo multiplo della popolazione siano isolate esaminando le lacune tra di loro nel microscopio per assicurare che non ci siano filamenti che collegano le popolazioni neuronali. </li></ol> 5. Preparazione dei branelli rivestiti in PDL <ol><li> Aggiungere 2 gocce di 50 μl di branelli in polistirene di 4, 10 o 20 μm diluiti in acqua (1: 500) a 1 ml di PDL (100 μg / ml). Lasciare almeno 2 ore a temperatura ambiente. Nota: il protocollo può essere interrotto qui e ripreso il giorno successivo. </li><li> Centrifugare la soluzione a 8.820 xg per 1 min. Rimuovere con cautela il surnatante senza disturbare le perle accumulate in fondo al contenitore. </li><li> Lavare le perle due volte con 1 ml di soluzione sterile 10 mM HEPES pH 8.4. </li><li> Resuspendere le perle rivestite con PDL in 200 mL di 10 mM HEPES pH 8.4soluzione. </li></ol> 6. Preparazione delle micropipette <ol><li> Preparare pipette provenienti da tubi capillari di vetro (diametro interno di 1 mm, diametro esterno di 1,5 mm) utilizzando un estrattore elettrodo orizzontale. Regolare le impostazioni in modo che la punta esterna della micropipetta tirata sia di ~ 2-5 μm. Prima di tirare, assicurarsi che i tubi di vetro siano puliti. </li><li> Fissare le pipette alle vetrate di vetro per essere conservate e assicurarsi che la punta non tocchi la superficie dello scivolo poiché la punta è fragile. Conservare a temperatura ambiente in un contenitore coperto per proteggere dalla polvere. Usare pipette nello stesso giorno in cui vengono tirate. </li></ol> 7. Adesione ai Neuroni di PDL-bead <ol><li> Aggiungere 40-60 μL di branelli rivestiti in PDL preparati nel passaggio 5 ad una coltura cellulare preparata nel passaggio 4. Centrare la punta pipetta sopra i neuroni, che sono debolmente visibili sul coperchio e aggiungere le perle (vedi figura 3 ). </li><li> Rimettere il campione all&#39;incubatore per 1 ora per promuovere la formazione dell&#39;occhioContatti naptici 8 , 9 . </li><li> Dopo l&#39;incubazione, rimuovere le perle non aderenti lavando delicatamente la coltura con NBM preriscaldata. </li></ol> 8. Preparazione della soluzione fisiologica salina (per esperimenti sulla temperatura ambiente) <ol><li> Preparare la soluzione salina fisiologica combinando gli ingredienti elencati nei riferimenti 7 , 8 . Questo è per regolare l&#39;ambiente cellulare all&#39;esterno dell&#39;incubatore. </li><li> Verificare i livelli di osmolarità e pH come indicato nei riferimenti 7 , 8 . </li><li> Continuare a infondere la soluzione con O 2 per ridurre al minimo le fluttuazioni del pH durante lo svolgimento di esperimenti. </li><li> Riscaldare a temperatura ambiente. </li><li> Impostare il sistema di perfusione inserendo un&#39;estremità di un tubo di plastica (dimensioni opzionali) in soluzione fisiologica iniettata da O 2 e fissando le altreNd ad un ago inserito nel supporto del campione. Mettere il tubo e la soluzione più alti del campione (vedere la Figura 4 ). <ol><li> Scollegare il tubo dall&#39;ago e collegarlo ad una siringa. Usare la siringa per esercitare pressione e disegnare liquido, riempiendo il tubo. Sigillare con un morsetto a rulli e ricollegare l&#39;ago. </li></ol></li></ol> 9. Micromanipolazione di perline <ol><li> Installare il campione in una configurazione sperimentale in modo tale che le celle possano essere accessate dall&#39;alto da due micropipette montate in micromanipulatori e accessibili in modo ottico sotto, ad esempio con l&#39;obiettivo a 40 secondi (apertura numerica di 0,6) di un microscopio ottico invertito. In questa configurazione, montare una telecamera CCD per la cattura delle immagini sulla porta laterale del microscopio. Collegare ogni pipetta a 1 ml di siringhe tramite tubo di plastica. A questo punto, sostituire NBM con soluzione salina fisiologica (1-2 mL) (vedi figura 4 ). </li><li> Durante l&#39;esperienza, Continuamente perfusione delle cellule con la soluzione fisiologica salina preparata al punto 8 a una velocità di 0,5-1 ml / min. </li><li> Selezionare un PDL-bead NON collegato ad un neurone nel campo visivo. Allineare la perlina con una punta di micropipetta mettendo a fuoco sul tallone quindi fino alla micropipetta. Portare il puntale giù il più vicino possibile al tallone monitorandolo attraverso il microscopio. </li><li> Applicare una pressione negativa con la siringa da 1 ml collegata alla pipetta per raccogliere il tallone. Mantenere una pressione negativa per tutto l&#39;esperimento. </li></ol> 10. Tirare i Neuriti <ol><li> Selezionare un tallone PDL collegato ad un neurone nel campo visivo e collegarlo alla seconda micropipetta usando l&#39;aspirazione come descritto nei passaggi 9.3-9.4. </li><li> Tirare il complesso PDL-bead-neuron lentamente (~ 0,5 μm / min) spostando il micromanipolatore o la fase di campionamento di 1 μm e pausa per 5 minuti per consentire l&#39;iniziazione neurita. </li><li> Ripetere due volte il passaggio 10.2. Nota: i primi 3 &amp;# 181; m deve essere tirato lentamente per garantire il successo sperimentale, che si verifica oltre il 95% del tempo. </li><li> Tirare il complesso PDL-bead-neuron lentamente (~ 0,5 μm / min) spostando il micromanipolatore o la fase di campionamento di 2 μm e pausa per 5 minuti per consentire l&#39;allungamento del neurite. </li><li> Dopo un inizio di successo e l&#39;estensione del neurite per i primi 5 μm, tirare il neurite a 20 μm / min su distanze di millimetro. Nota: l&#39;estrazione può essere eseguita in modo continuo o in gradini ea diverse velocità. Vedere la Figura 5b -5c . </li></ol> 11. Collegamento dei neuroni <ol><li> Selezionare una regione ricca di neuriti e abbassare il complesso PDL-bead-neurite in modo che lo contatti fisicamente. Utilizzare altre perle per misurare l&#39;altezza del punzone sopra la superficie del coperchio. Vedere la Figura 5d . </li><li> Lasciare il complesso PDL-bead-neurite a contatto con il neurite target durante la manipolazione della seconda micropiPette. Abbassare la seconda pipetta con il secondo PDL-bead sulla parte superiore del neurite appena formato, circa 20 μm dal primo bead. Utilizzare il secondo PDL-bead per spingere il nuovo filamento neurite verso la cella di destinazione. </li><li> Tenere entrambe le perle in posizione per almeno 1 h. Verificare l&#39;assenza di gonfiore focale, un ispessimento dei neuriti che contattano il tallone, con il microscopio 16 . </li><li> Durante questo periodo, utilizzare la perfusione per cambiare lentamente il mezzo del campione da salinità fisiologica a NBM precarbonizzato CO 2- equilibrato. </li><li> Rilasciare il tallone dalla seconda pipetta rilasciando l&#39;aspirazione. Se il nuovo neurite rimane attaccato, rilasciare anche il primo tallone. Vedere la Figura 5e . </li><li> Rimuovere delicatamente la soluzione salina e sostituire con NBM (~ 2 mL). </li><li> Riposizionare con cautela il campione nell&#39;incubatrice per rafforzare la connessione neuronale per i prossimi esperimenti. Questa connessione è stabile per&gt; 24 h 7 </sup&gt;. </li></ol> 12. Verifica della funzionalità della nuova connessione mediante le registrazioni delle morsetti di patch a coppie intere <ol><li> Seguire i riferimenti 7 , 18 , 19 . Per assemblare un set di elettrofisiologia. </li><li> Seguire i riferimenti 7 . Per preparare gli elettrodi pre- e postinaptici. </li><li> Raccogliere i dati della pinzetta delle patch, ripetutamente seguendo i riferimenti 18 , 19 . </li><li> Confronta i risultati con i segnali naturali 7 per determinare il tipo di connessione. </li></ol>

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<li>Cho, E. Y., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+of+regrowth+of+damaged+retinal+ganglion+cell+axons+regenerating+in+a+peripheral+nerve+graft+in+adult+hamsters%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Rate of regrowth of damaged retinal ganglion cell axons regenerating in a peripheral nerve graft in adult hamsters.</a> Brain Res. 419, 369-374 (1987).</li>
<li>Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+differences+in+the+growth+rate+of+early+nerve+fibres+related+to+target+distance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intrinsic differences in the growth rate of early nerve fibres related to target distance.</a> Nature. 337, 553-555 (1989).</li>
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L&#39;autore Margaret H Magdesian è il CEO di Ananda Devices che produce gli strumenti utilizzati in questo articolo.

Grazie alla micromanipolazione standard e ai dispositivi innovativi microfluidici, è stata sviluppata una nuova tecnica per avviare, allungare e collegare rapidamente nuovi circuiti neuronali funzionali a grandi distanze. La micromanipolazione della pipetta è uno strumento comune nella maggior parte dei laboratori neuroscienze 4 , 13 . La vera sfida per ottenere risultati riproducibili e affidabili è stata la standardizzazione di culture neuronali sane e posizio...

Le lesioni al sistema nervoso centrale adulto (CNS) possono portare a disabilità permanente a causa di meccanismi multipli che limitano la ricrescita assonale 1 . Dopo l&#39;infortunio, molti assoni CNS non formano un nuovo cono di crescita e non riescono a montare una risposta efficace rigenerativa 2 . Inoltre, i danni e il tessuto delle cicatrici che circondano lesioni del CNS inibiscono significativamente la crescita axonica 1 , 2 , 3 . Le terapie correnti per promuovere la rigenerazione del SNC dopo lesioni sono state focalizzate sul miglioramento del potenziale di crescita intrinseco del neurone danneggiato e sulla mascheratura degli inibitori dell&#39;estensione assonica associata a detriti di mielina e la cicatrice gliale 1 , 3 . Nonostante ciò la capacità di rigenerare gli assi lunghi a obiettivi lontani e di formare appropriate sinapsi funzionali rimane gravemente limitata 4 , </suP&gt; 5 , 6 , 7 . Nell&#39;attuale lavoro, microbeads, micromanipolazione pipettata e dispositivi microfluidici vengono utilizzati per avviare, allungare e collegare rapidamente nuovi circuiti neuronali funzionali a lunghe distanze. Precedenti lavori hanno dimostrato che le perline ricoperte da poli-D-lisina inducono l&#39;adesione della membrana seguita dal clustering dei complessi di vescicole sinaptici e la formazione di bouton presinaptici funzionali 8 . È stato inoltre dimostrato che quando il PDL-bead viene tirato meccanicamente dopo la differenziazione presinaptica, il cluster proteico sinaptico segue il branco, innescando un nuovo neurite 9 . La seguente procedura sfrutta questo fatto insieme alla capacità di coltivare i neuroni ippocampali embrionali di ratti in regioni organizzate su una copertura con dispositivi microfluidici polidimetilsilossano (PDMS) per ricreare con precisione un neuronecircuito. Questi dispositivi microfluidici PDMS sono non tossici, otticamente trasparenti e sono costituiti da due camere collegate da un sistema di microchannel. Una volta assemblati su una copertura, ogni apparecchio serve come uno stampo per guidare la crescita neuronale e mantenere sani le culture neuronali su modelli precisi per più di 4 settimane in vitro . Qui viene presentato un quadro per studiare i limiti di estensione e funzionalità del nuovo neurite. Nuove funzionalità neurite vengono create e posizionate per controllare (re) le reti neuronali. I tassi di estensione raggiunti sono più veloci di 20 μm / min su distanze di millimetro e sono stabilite le connessioni funzionali. Questi risultati mostrano inaspettatamente che la capacità intrinseca di queste neuriti per allungamento è molto più veloce di quanto precedentemente pensato. Questo approccio meccanico proposto supera strategie chimiche lente e consente la connessione controllata ad un target specifico. thÈ la tecnica apre nuove vie per lo studio in vitro di nuove terapie per ripristinare la connettività neuronale dopo il danno. Permette inoltre la manipolazione e il riavvolgimento delle reti neuronali per indagare aspetti fondamentali dell&#39;elaborazione dei segnali neuronali e della funzione neuronale in vitro .

<table><tbody><tr><td>Dispositivi di co-coltura</td><td>Dispositivi Ananda Disponibili</td><td></td><td>in commercio presso http://www.anandadevices.com</td></tr><tr><td>Neuro dispositivi Dispositivi</td><td></td><td></td> Ananda <td>Disponibili in commercio presso http://www.anandadevices.com</td></tr><tr><td>n. 1 Vetrino coprioggetti rotondo da 25 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0705</td><td></td></tr><tr><td>Piatti con fondo in vetro da 35 mm #0, non rivestiti, irradiati con raggi gamma</td><td>Incorporazione MatTex</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per colture cellulari da 35 mm, non pirogena, sterile</td><td>Corning Inc</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Piastra Petri da 95 mm x 15 mm, coperchio scorrevole, polistirene sterile</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875714G</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga da 50 mL con graduazioni stampate e tappi piatti VWR</td><td></td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica in polipropilene da 15 mL, modello 17 x 120 mm, non pirogena, falco sterile</td><td></td><td></td><td></td>352097</tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td>Soluzione extracellulare</td></tr><tr><td>Integratore B-27 (50X),</td><td>Integratore B-27 senza siero (50X), 17504044 senza siero</td><td></td><td>Soluzione extracellulare</td></tr><tr><td>Pennicilina, Streptomiozina, Glutammina</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>11995-065</td><td>Soluzione extracellulare</td></tr><tr><td>200 &mu; L Pipettatori</td><td>VWR</td><td>89079-458</td><td></td></tr><tr><td>2 - 20 &mu; L Pipettors</td><td>Puntali resistenti agli aerosol</td><td>2149P</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 3mL Pipette di trasferimento [Non sterili]</td><td>BD Falcon</td><td>357524</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Gibco</td><td>15023-021</td><td>Soluzione extracellulare</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>Soluzione extracellulare/Perline</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td>Soluzione</td></tr> <tr><td>extracellulareKCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td>Soluzione extracellulare</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-52-4</td><td>Soluzione extracellulare</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td>Soluzione extracellulare</td></tr><tr><td>#5 Dumont Dumostar Pinzette 11 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>500233</td><td></td></tr><tr><td>Strumenti di dissezione</td><td>Braun, Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Po-D-lisina bromidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Micro particelle a base di polistirene, 10 &mu; m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72986</td><td></td></tr><tr><td>Tubi in borosilicato</td><td>King Precision Glass, Inc.</td><td>14696-2</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore di pipette orizzontale</td><td>Sutter Instruments</td> Micromanipolatori <td>P-97</td><td></td>Brown-Flaming</tr><tr><td>, serie PCS-5000</td><td>SD Instruments</td><td>MC7600R</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 1 mL</td><td>BD Luer-Lok</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo</td><td>Olympus</td><td>UIS2, LUCPLFLN 40X</td><td></td></tr><tr><td>CCD</td><td>Camera Photometrics</td><td>Cascade II: 512</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's (1x) L-15 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11415-064</td><td>Dissezione di ratto</td></tr><tr><td>Typsin-EDTA (0,05%), Phenol red</td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td><td>Dissezione</td></tr> <tr><td>di rattoDMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4,5 g/L D-glucosio, + L-glutammina, + 110 mg/L di piruvato di sodio]</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td>Dissezione di ratto</td></tr><tr><td>HBSS (1x) Soluzione salina bilanciata di Hank [- Cloruro di calcio, - Cloruro di magnesio, - Solfato</td> di magnesio]<td>Life Technologies</td><td>14170-112</td><td>Dissezione di ratto</td></tr></tbody></table>

circuiti neuronali riavvolgenti: un nuovo metodo per l&#39;estensione veloce del neurite e la connessione neuronale funzionale

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

La lesione del cervello e del midollo spinale può portare a disabilità permanente e alla morte perché non è ancora possibile rigenerare i neuroni per lunghe distanze e ricollegarle con un bersaglio adeguato. Qui viene descritta una procedura per iniziare, allungare e collegare rapidamente nuovi circuiti neuronali funzionali a lunghe distanze. I tassi di estensione raggiunti raggiungono oltre 1,2 mm / h, 30-60 volte più velocemente rispetto ai tassi in vivo degli assoni in crescita più veloci del sistema nervoso periferico (0,02 a 0,04 mm / h) 28 e 10 volte più veloci di quanto riportato in precedenza per gli stessi Tipo neuronale in una fase precedente dello sviluppo 4 . In primo luogo, le popolazioni isolate di neuroni ippocampali del ratto vengono coltivate per 2-3 settimane in dispositivi microfluidici per posizionare le cellule in modo preciso, consentendo una facile micromanipolazione e una riproducibilità sperimentale. Successivamente, le perle ricoperte di poli-D-lisina (PDL) vengono poste sulle neurite per formare cont. AdesiveGli atti e la micromanipolazione pipettata vengono utilizzati per spostare il complesso bead-neurite risultante. Mentre il tallone viene spostato, estrae un nuovo neurite che può essere esteso su centinaia di micrometri e collegato funzionalmente a una cellula bersaglio in meno di 1 h. Questo processo consente la riproducibilità sperimentale e la facilità di manipolazione, escludendo strategie chimiche più lente per indurre la crescita del neurite. Le misure preliminari presentate qui dimostrano un tasso di crescita neuronale molto superiore a quelle fisiologiche. Combinando queste innovazioni permette la precisa creazione di reti neuronali nella cultura con un grado di controllo senza precedenti. È un metodo nuovo che apre la porta ad una pletora di informazioni e approfondimenti sulla trasmissione del segnale e sulla comunicazione all&#39;interno della rete neuronale, nonché come un parco giochi in cui esplorare i limiti della crescita neuronale. Le potenziali applicazioni e gli esperimenti sono diffusi con implicazioni dirette per terapie che mirano a ricollegare la neuronaL circuiti dopo trauma o in malattie neurodegenerative.

I neuroni ippocampali del ratto embrionale vengono coltivati ​​in dispositivi microfluidici per consentire un posizionamento preciso di cellule, PDL-perle e micromanipulatori. Il primo passo è quello di montare correttamente il dispositivo microfluidico su una copertura o un piatto di vetro. È essenziale che il dispositivo microfluidico sia ben attaccato al substrato per evitare che le cellule esca dalle camere e che si muovano sotto le parti del dispositivo che dovrebbero essere sigilla...

Questa procedura descrive come avviare rapidamente, estendere e collegare neuriti organizzati in camere microfluidiche utilizzando perline poli-D-lisina fissate a micropipette che guidano l&#39;allungamento del neurite.

Circuiti neuronali riavvolgenti: un nuovo metodo per l&#39;estensione veloce del neurite e la connessione neuronale funzionale

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di avviare nuovi neuriti, estenderli rapidamente e connetterli con precisione a cellule bersaglio. Questa procedura è possibile soltanto utilizzando cellule coltivate in un ambiente controllato e riproducibile. Questo metodo ci permette di rispondere a domande fondamentali nella neuroscienza.Che cosa limita la velocità di crescita dei neuroni? Quanto velocemente possono crescere? I segnali meccanici svolgono un ruolo?Possiamo inoltre studiare come si formano le sinapsi, come i neuroni trovano una cellula bersaglio? Come invecchiano e maturano le sinapsi? E, in terzo luogo, possiamo iniziare a costruire sistematicamente reti neurali, studiando come i neuroni elaborano le informazioni.I principali vantaggi di questa tecnica sono che consentono una facile manipolazione, riproducibilità sperimentale e, in definitiva, un elevato grado di controllo a livello di singola cellula. Per iniziare questa procedura, pulire e preparare il numero desiderato di coprioggetti sterili. Successivamente, ricoprire ciascun coprioggetto con 0,5-1 millilitri di PDL 100 microgrammi per millilitro per almeno due ore a temperatura ambiente.In seguito, lavare due volte le lamelle con acqua ed eliminare tutto il liquido. Lasciarle asciugare in un ambiente sterile per 5-10 minuti o fino a quando la superficie non &egrave; completamente asciutta. Quindi, posizionare i dispositivi microfluidici con i modelli rivolti verso l'alto sotto la luce UV in un armadio a sicurezza biologica per 10 minuti.Dopo 10 minuti, posizionare un dispositivo microfluidico con il motivo rivolto verso il basso a contatto con il vetrino pulito. Utilizzare le pinzette per premere delicatamente il dispositivo in modo che aderisca al vetro. Per riempire il dispositivo per popolazione singola con il mezzo, aggiungere 50 microlitri di mezzo cellulare completo nel pozzetto superiore destro.E quindi aggiungere altri 50 microlitri di mezzo cellulare completo nel pozzetto diagonalmente opposto. Per riempire il dispositivo per popolazioni multiple con mezzo, aggiungere 30 microlitri di NBM completo in una fila di pozzetti. Assicurarsi che il mezzo scorra tra i pozzetti.Quindi, aggiungere 50 microlitri di mezzo in ciascuno dei pozzetti rimanenti. Posizionare i dispositivi in una piastra più grande con una capsula Petri aperta contenente acqua autoclavata e inserire la capsula nell'incubatrice per uno o due ore mentre si prepara la coltura cellulare. A questo punto, rimuovere il mezzo dai pozzetti superiori dei dispositivi microfluidici senza svuotare completamente i pozzetti.Quindi, aggiungere 20 microlitri della soluzione concentrata di cellule nel pozzetto in alto a destra del dispositivo microfluidico e verificare al microscopio come le cellule fluiscono all'interno del dispositivo microfluidico per popolazione singola. Per seminare le cellule nel dispositivo per popolazioni multiple, aggiungere 20 microlitri della soluzione concentrata di cellule in ciascuno dei pozzetti superiori. Al microscopio, verificare se le cellule si trovano all'interno delle camere.Successivamente, posizionare i dispositivi nell'incubatrice per 15-30 minuti per favorire l'adesione delle cellule al substrato. Dopo che le cellule si sono attaccate al substrato, aggiungere 40 microlitri di NBM ai due pozzetti superiori del dispositivo a popolazione singola. Questo aiuterà a rimuovere le bolle d'aria dai microcanali.Aggiungere 20 microlitri di MBM nelle pozze superiori del dispositivo per popolazioni multiple, ovvero nelle stesse pozze in cui sono state iniettate le cellule. Il mezzo dovrebbe sporgere leggermente, formando un menisco positivo e conferendo alle pozze un aspetto simile a quello di una cupola di muffin. Uno o due giorni prima della rimozione del dispositivo microfluidico, aggiungere due millilitri di NBM preriscaldato in ogni piastra campione e inondare le camere.Successivamente, mantenere i dispositivi nell'incubatrice. In seguito, utilizzare pinze sterili e una punta di pipetta per rimuovere i dispositivi microfluidici dalle coprioggetti, lasciando una configurazione ordinata di neuroni. In questa procedura, aggiungere da 40 a 60 microlitri delle perle rivestite con PDL preparate alla coltura cellulare.Quindi, reinserire il campione nell'incubatrice per un'ora per favorire la formazione di contatti sinaptici. Successivamente, posizionare il campione in un apparato sperimentale in modo che le cellule possano essere valutate dall'alto mediante due micropipette e siano anche accessibili otticamente. In questa configurazione, una telecamera CCD è posizionata sul portello laterale del microscopio per l'acquisizione delle immagini.Collegare ogni pipetta riempita con soluzione salina a una siringa da un millilitro, quindi perfondere il campione con soluzione salina fisiologica. Successivamente, sotto il microscopio, verificare l'intervallo tra le due popolazioni neuronali isolate per assicurarsi che le due popolazioni non siano naturalmente connesse. Selezionare un microsfera di PDL che non sia attaccata al neurone nel campo visivo.Allineare la perlina con la punta di una micropipetta focalizzando prima sulla perlina e poi sulla micropipetta. Successivamente, avvicinare il più possibile la punta alla perlina monitorando la posizione attraverso il microscopio. Applicare quindi una pressione negativa alla pipetta per raccogliere la perlina e mantenere tale pressione negativa per tutta la durata dell'esperimento.Ora, selezionare una perla di PDL attaccata a un neurone nel campo visivo e fissarla alla seconda micropipetta utilizzando aspirazione. Tirare il complesso perla di PDL-neurone spostando lentamente il micromanipolatore o il palco del campione a 0,5 micrometri al minuto per 1 micrometro, quindi fare una pausa di cinque minuti per consentire l'iniziazione del neurite. Tirare il complesso perla di PDL-neurone spostandolo lateralmente lentamente a 0,5 micrometri al minuto per due micrometri, quindi fare una pausa di cinque minuti per consentire l'allungamento del neurite.Dopo un avvio riuscito e un'estensione del neurite per i primi cinque micrometri, tirare continuamente il neurite a 20 micrometri al minuto. Per connettere i neuroni, selezionare una regione ricca di neuriti. Utilizzare altre perle per valutare l'altezza della punta della pipetta rispetto al coprioggetto e abbassare il complesso perla-PDL-neurite in modo che entri in contatto fisico con i neuriti.Lasciare il complesso di perline PDL e neurite a contatto con il neurite bersaglio durante la manipolazione della seconda micropipetta. Successivamente, abbassare la seconda pipetta con la seconda perla PDL sulla sommità del neurite appena formato, a circa 20 micrometri dalla prima perla, e utilizzare la seconda perla PDL per spingere il nuovo filamento del neurite verso la cellula bersaglio. In seguito, mantenere entrambe le perle in posizione per almeno un'ora.Verificare l'assenza di gonfiore focale, un ispessimento dei neuriti a contatto con la perla, utilizzando il microscopio. Durante questo periodo, sostituire lentamente il mezzo del campione da soluzione salina fisiologica a NBM equilibrato con anidride carbonica e preriscaldato. Rilasciare la perla dalla seconda pipetta rilasciando l'aspirazione.Se il nuovo neurite rimane attaccato, rilasciare anche la prima perla. Successivamente, riposizionare con attenzione il campione nell'incubatrice per rafforzare la connessione neuronale in previsione di esperimenti futuri. È possibile utilizzare registrazioni con tecnica del patch clamp su intera cellula per studiare la funzionalità elettrica della connessione ottenuta mediante micromanipolazione.Qui sono mostrate le popolazioni neuronali isolate, separate da un gap di 100 micrometri in microdispositivi in PDMS. Sono state effettuate registrazioni in configurazione whole-cell mediante patch clamp, e le connessioni indotte meccanicamente sono state analizzate e confrontate con quelle presenti in popolazioni neuronali naturalmente connesse e in popolazioni non connesse. Le risposte elettriche successive al potenziale d'azione pre-sinaptico, registrate dai neuroni connessi naturalmente e mediante micromanipolazione, sono significativamente più elevate e correlano temporalmente con l'attività pre-sinaptica.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in otto ore se svolta correttamente e, durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di disporre di colture cellulari a lungo termine sane e ben organizzate per garantire risultati rapidi e riproducibili. Dopo aver seguito questa procedura, possono essere utilizzati diversi metodi per verificare la funzionalità elettrica della connessione micromanipolata. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come coltivare popolazioni cellulari in camere microfluidiche e utilizzare manipolazioni con pipetta per avviare, estendere e connettere i neuriti.

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Questo video dimostra una tecnica per l'avvio e l'estensione rapida di un neurone e la creazione di nuove connessioni con un neurone bersaglio utilizzando un dispositivo microfluidico e la micromanipolazione. Questo potrebbe essere utilizzato per terapie che mirano a ricollegare i circuiti neuronali dopo traumi o nelle malattie neurodegenerative.

Avvio dell'estensione e della formazione rapida della neurite Connessioni neuronali funzionali

Viene descritto un protocollo per generare un sistema di co-coltura costituito da neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), neuroni corticali primari e astrociti. Questo sistema di co-coltura consente di rilevare la formazione di contatti sinaptici e circuiti tra nuovi neuroni derivati da iPSC e neuroni corticali preesistenti che esprimono la canalrodopsina-2.

Un approccio per la valutazione optogenetic Formazione di connessioni neuronali in un sistema di co-coltura

Questo manoscritto descrive un protocollo di crescere in vitro reti modulari composti da spazialmente confinate, circuiti neuronali funzionalmente interconnessi. Una maschera polimerica viene usata per modello uno strato proteico per favorire l'adesione cellulare su substrato di coltura. Neuroni placcato crescono su aree rivestite stabilire connessioni spontanee e che presentano attività elettrofisiologica.

Design, Trattamento delle superfici, Cellular placcatura, e Coltura di neuronali modulari reti composte di circuiti funzionalmente interconnessi

Modifichiamo e implementare un protocollo precedentemente pubblicato che descrive la differenziazione rapida, riproducibile ed efficiente di indotto umani cellule staminali pluripotenti (hiPSCs) in eccitatorio neuroni corticali 12. In particolare, la nostra modifica permette il controllo della densità delle cellule neuronali e uso su array micro-elettrodi per misurare le proprietà elettrofisiologiche a livello di rete.

Rapid neuronale differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte per misurare l&#39;attività di rete su array Micro-elettrodo

Questo manoscritto specifica la realizzazione di reti neurali rivelate micro-tessuto: costruzioni tridimensionali di dimensioni microniche costituite da tratti longitudinali allineati allineati che comprendono la popolazione neuronale aggregata racchiuse in un idrogel tubolare. Questi impalcature viventi possono servire come relè funzionali per ricostruire o modulare la circuiteria neurale o come test-letti biofidelici che imitano la neuroanatomia della materia grigio-bianca.

Le reti neurali ricalcolate anatomicamente tridimensionali dei micro-tessuti per la ricostruzione, la modulazione e la modellazione del sistema nervoso

Presenteremo lo sviluppo di auto-assemblati, tridimensionale fasci di somata astrocytic allineati longitudinalmente e processi all'interno di un encasement romanzo biomateriale. Questi ingegnerizzato "ponteggi vivente", che esibiscono micron-scala diametro ancora estendere centimetri di lunghezza, può servire come banchi di prova per lo studio dei meccanismi dello sviluppo neurologico o facilitare la neurorigenerazione di regia della migrazione neuronale e/o assonale path-finding.

Tessutale tridimensionale allineato Astrocyte reti per ricapitolare i meccanismi dello sviluppo e facilitare la rigenerazione del sistema nervoso

Qui presentiamo un metodo per un modello umano in vitro della lesione elasticizzato in un formato a 96 pozzetti su una scala cronologica pertinente all'impatto del trauma. Sono inclusi i metodi per la realizzazione di piastre stretchable, quantificare l'insulto meccanico, coltura e ferendo le cellule, imaging e alto contenuto analisi per quantificare il danno.

Metodo per il pregiudizio elasticizzato ad alta velocità dell'essere umano ha indotto i neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti in un formato a 96 pozzetti

Basato sull'ingegneria calularisa in vitro dei precursori neuronali, sul loro co-trapianto in cervelli di tipo selvatico e sulla valutazione morbiterale accoppiata dei derivati "test" e "controllo", questo metodo consente una modellazione accurata del controllo genico in vivo morfologia dei neuroni in modo semplice e conveniente.

Trapianto intraventricolare di precursori neuronali ingegnerizzati per studi sulla neuroarchitettura In Vivo

In questa relazione, descriviamo un semplice protocollo per studiare la escrescenza di neurite nei neuroni corticali embrionali del ratto co-traducendo con EGFP e la proteina di interesse.

Un saggio basato sulle proteine con fluorescenza verde potenziato per studiare la crescita neurite nei neuroni primari

I saggi di crescita dei neuriti forniscono un valore quantitativo sui processi neuronali rigenerativi. Il vantaggio di questo software semiautomatico è che segmenta separatamente i corpi cellulari e i neuriti creando una maschera e misura vari parametri come la lunghezza dei neuriti, il numero di punti di diramazione, l'area del cluster cellula-corpo e il numero di cluster di cellule.

Standardizzazione di un nuovo software semiautomatico per la misurazione della crescita dei neuriti 

Impara a iniziare, estendere e connettere rapidamente i neuriti usando microcamere e micropipette guidate da perline rivestite con poli-D-lisina. Questo metodo permette di studiare la crescita neuronale e i segnali meccanici.

Circuiti neuronali riavvolgenti: un nuovo metodo per l'estensione veloce del neurite e la connessione neuronale funzionale

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