Registrazioni Patch-clamp intere cellule delle cellule epiteliali primarie isolate dall'epididimo

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare le cellule epiteliali dall'epididimo di ratto e misurare le proprietà elettriche su queste cellule principalmente dissociate utilizzando il metodo del patch-clamp a cellula intera. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia riproduttiva, come la funzione dell'epididimo, che è importante per la maturazione degli spermatozoi e l'ereditarietà dei tratti paterni. Questa tecnica consente all'utente di cauterizzare le proprietà elettriche delle cellule epiteliali epididimali isolate in modo da poter poi illustrare la funzione fisiologica sconosciuta di queste cellule.

A dimostrare la procedura sarà Bao Li Zhang, uno studente laureato del mio laboratorio. Per iniziare la procedura, disinfettare gli strumenti di dissezione mediante immersione in etanolo al 70%. Quindi, lasciali asciugare all'aria.

Quindi, prepara l'IMDM completo. Successivamente, creare aliquote da 50 ml in condizioni asettiche, sigillare con Parafilm e conservare a quattro gradi Celsius. Successivamente, preparare una soluzione di digestione enzimatica collagenica sciogliendo la collagenasi di tipo I e la collagenasi di tipo II in RPMI, ottenendo un milligrammo per millilitro di ciascuna collagenasi nella soluzione.

Filtrare la soluzione attraverso una membrana da 0,22 micrometri. Quindi, contrassegnalo come soluzione di collagenasi e mantieni la soluzione a temperatura ambiente fino all'uso. Successivamente, regolare il volume della soluzione enzimatica in base al peso dell'enzima.

Il volume minimo richiesto per entrambi gli epididimi della cauda da un singolo ratto è di due millilitri. Per sezionare l'epididimo della cauda di ratto, sacrificare l'animale utilizzando pentobarbital di sodio tramite iniezione IP o utilizzando una camera di isoflurano fino a quando l'animale non risponde alla stimolazione del pizzicamento della coda, seguita da lussazione cervicale. Successivamente, disinfettare il basso addome strofinandolo con etanolo al 70%.

Spingere delicatamente i due testicoli verso il basso verso il basso addome e poi aprire il basso addome vicino allo scroto. Successivamente, rimuovere il grasso dell'epididimo e sezionare tutti gli organi riproduttivi. Successivamente, trasferiscili nel piatto con RPMI.

In una postazione di lavoro pulita e controllata dal flusso d'aria, sezionare la cauda epididimo dai tessuti connettivi e adiposi e dalla capsula dell'epididimo. Mettere un epididimo con 0,2 millilitri di soluzione di collagenasi in una provetta da 1,5 millilitri. Per dissociare le singole cellule dalla cauda epididimi, tagliare gli epididimi nella soluzione di collagenasi usando le forbici sottili fino a quando il tessuto diventa un fluido pastoso.

Quindi, sciacquare delicatamente le forbici con il resto della soluzione enzimatica nel tubo. Successivamente, posizionare il tubo su un termomiscelatore metallico per 30 minuti a 37 gradi Celsius con una velocità di agitazione di 1.000 giri/min. Quindi, centrifugare la miscela di tessuto enzimatico a temperatura ambiente per tre minuti.

Dopodiché, decantare il surnatante appiccicoso che contiene principalmente lo sperma. Quindi, risospendere il pellet in un millilitro di IMDM completo per estinguere tutta l'attività enzimatica. Successivamente, trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 50 millilitri contenente 49 millilitri di RPMI.

Centrifugare la miscela di cellule e travasare il surnatante. Risospendere il pellet in un millilitro di IMDM completo con una leggera triturazione per almeno cinque minuti per dissociare le singole cellule dalla miscela di tessuto epididimico trattato enzimaticamente. Separare le cellule epiteliali dalle altre cellule in condizioni asettiche e coltivare la sospensione cellulare su una piastra di Petri da 10 centimetri contenente IMDM completo per almeno otto ore o durante la notte in un incubatore a 32 gradi Celsius.

La mattina successiva, preparare i vetrini coprioggetto sterili mediante immersione in alcool al 100%. Asciugateli all'aria e poi immergeteli in una piccola quantità di terreno di coltura. Quindi, posizionare i vetrini coprioggetto in piastre di coltura di sei centimetri o in pozzetti singoli di una piastra a 24 pozzetti.

Ora, raccogli le cellule epiteliali dissociate raccogliendo delicatamente la sospensione cellulare dalla piastra di Petri, che consiste principalmente di cellule epiteliali. Centrifugare la sospensione cellulare a 30 volte G a temperatura ambiente per cinque minuti, quindi decantare il surnatante. Successivamente, risospendere il pellet della cella in due millilitri di IMDM completo.

Seminare 0,2 millilitri della sospensione cellulare raccolta al centro di ogni vetrino di copertura sterile. Lasciare che la sospensione cellulare si depositi nella gocciolina di liquido per almeno 10 minuti per consentire alle cellule di aderire liberamente ai vetrini di copertura. Quindi, aggiungere con attenzione un millilitro di IMDM completo sul bordo di una piastra di sei centimetri o 0,3 millilitri di IMDM completo a ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti, senza disturbare le cellule.

Mantenere le singole cellule isolate su vetrini coprioggetti nell'incubatore a 32 gradi Celsius fino agli esperimenti di patch-clamp. Il giorno dell'esperimento del patch-clamp, scongelare un'aliquota di soluzione intracellulare sul ghiaccio e mantenerla raffreddata durante l'esperimento del patch-clamp per prevenire la degradazione. Quindi, trasferire le cellule epiteliali di coltura sul vetrino di vetro nella camera di registrazione riempita con PSS standard a temperatura ambiente.

Sostituire con cautela il PSS da bagno almeno due volte utilizzando una pipetta prima di qualsiasi esperimento con il patch-clamp. Per stabilire la configurazione dell'intera cella, immergere la pipetta nella soluzione del bagno alla massima velocità del micromanipolatore. Individuare il puntale della pipetta sullo schermo collegato alla fotocamera digitale.

Quindi, rallentare la velocità del micromanipolatore alla modalità medio-alta. Controllare rapidamente la resistenza della micropipetta utilizzando il comando dell'interfaccia di acquisizione dati applicando un passo di tensione generato dall'amplificatore controllato dal computer. Passare a una nuova micropipetta se la resistenza è significativamente al di fuori di questo intervallo.

E impostare il potenziale di giunzione del liquido tra la pipetta e la soluzione del bagno su zero utilizzando il comando di offset della pipetta nell'interfaccia commander del software. Monitorare la resistenza con il test della membrana. Se la resistenza è maggiore di 500 megaohm, ma inferiore a un gigaohm, applicare un potenziale negativo per aiutare a formare il gigaseal.

Nel frattempo, compensare la corrente capacitiva transitoria della micropipetta. A questo punto, applicare un passo iperpolarizzante di 10 millivolt da un potenziale di mantenimento di zero millivolt per la determinazione della resistenza di tenuta. Subito dopo aver ottenuto una configurazione di celle intere di successo, applicare un passo di iperpolarizzazione di 10 millivolt da un potenziale di mantenimento di 60 millivolt negativi.

Passare dalla modalità di tensione alla modalità a corrente zero ed eseguire una registrazione di 10 secondi senza interruzioni per misurare il potenziale di membrana a riposo della cella. Successivamente, tornare rapidamente alla modalità di tensione e rimanere in essa. Applicare i protocolli di tensione in base agli esperimenti pianificati e misurare le risposte in corrente.

Ecco gli esempi delle cellule epiteliali isolate dagli epididimi della cauda di ratto prima e dopo il riraccoglimento della coltura notturna sulla piastra prima degli esperimenti di patch-clamp. Questa figura mostra le correnti tipiche dell'intera cellula registrate da singole cellule epiteliali dell'epididimo utilizzando un protocollo di elicitazione dell'impulso. La linea tratteggiata indicava i livelli di corrente zero.

Ecco la relazione di tensione di corrente delle risposte di corrente misurate nei punti temporali indicati. Questi sono i tracciati rappresentativi del potenziale di membrana a riposo delle principali cellule dializzate con una soluzione pipetta, sia con ATP che senza ATP. E questo grafico a barre non mostra alcuna differenza significativa tra il potenziale iniziale di membrana a riposo di più ATP e meno ATP.

I numeri tra parentesi all'interno delle barre indicano il numero di cellule testate di almeno tre animali. Ed ecco le analisi di correlazione della resistenza di tenuta e della resistenza di ingresso di tutte le celle, o solo delle celle principali rispetto ai potenziali di riposo misurati alla pinza di corrente zero poco dopo l'istituzione dell'intera cella e le grandezze di corrente misurate al passo iperpolarizzante a 100 millivolt negativi dal potenziale di mantenimento. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in nove ore se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di interrompere immediatamente la digestione enzimatica durante le fasi di isolamento cellulare. In caso contrario, può verificarsi una digestione eccessiva che può portare a una difficile formazione della tenuta gigaohm e al fallimento degli esperimenti di patch-clamp. Per mantenere la salute della coltura, è importante centrifugare la miscela di cellule enzimaticamente dissociate alla bassa velocità di 30 G per due o tre minuti, quindi decantare il surnatante appiccicoso che contiene principalmente spermatozoi.

Seguendo queste procedure, altri metodi come l'imaging di cellule vive e tecniche di coltura di una singola cellula possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio il potenziale di membrana a riposo nelle cellule epiteliali naive potrebbe regolare il comportamento extracellulare in condizioni controllate. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della biologia riproduttiva per esplorare le proprietà elettrofisiologiche delle cellule epiteliali dell'epididimo per la regolazione della maturazione degli spermatozoi e l'ereditarietà dei caratteri acquisiti paterni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione su come isolare le cellule epiteliali dall'epididimo di ratto e su come misurare le proprietà elettriche su queste cellule utilizzando il metodo del patch-clamp a cellula intera.